一、磷酸化肽段质量数的分布特征（论文文献综述）
徐雯[1]（2021）在《黄酒酵母的蛋白组学及CRISPR基因编辑研究》文中指出黄酒酵母作为黄酒发酵过程中的主导微生物,其对氮源利用有独特的偏好性,易产生尿素及其它含氮化合物,从而影响发酵黄酒的品质。因此,鉴定黄酒酵母菌株间的差异表达蛋白,解析氮代谢调控途径具有重要的学术意义和应用价值。本论文首先以三株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株YJSH1、N85和XZ11为研究对象,探究三株菌株在以精氨酸为唯一氮源培养条件下的蛋白质组差异,鉴定与黄酒酵母氮源利用偏好有关的关键蛋白及其代谢途径。然后,为验证差异蛋白质的功能,构建了黄酒酵母菌株的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的实验体系,为进一步通过定向基因改造以优化黄酒酵母的发酵性能奠定基础。本论文的主要研究内容如下:（1）黄酒酵母菌株间的差异表达蛋白鉴定。首先研究酵母菌株YJSH1、N85和XZ11在以精氨酸为唯一氮源的条件下的生长差异,并选择对数生长中期为蛋白样本取样点;然后利用定量蛋白质组学串联质量标签（Tandem Mass Tags,TMT）标记技术、高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）和液相色谱串联质谱（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MC）技术分离定量蛋白质,共鉴定4005个可定量的蛋白。三株菌株两两对比按照相对定量值大于1.5倍或小于1/1.5倍,且统计学T检验p小于0.05筛选,一共得到793个差异表达蛋白。（2）差异表达蛋白功能注释分析。利用功能注释和数据统计等生信手段对差异表达蛋白进行分析。首先在分子功能、细胞成分和生物过程三个层面对差异表达蛋白进行GO（Gene Ontology）富集聚类分析,这些差异蛋白主要集中在能量代谢和外界物质的跨膜转运上,并参与离子转运和能量代谢途径。接着对差异表达蛋白的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路进行分析,发现N85中大部分糖酵解途径相关蛋白受到抑制,与乙醇生成相关的蛋白在YJSH1菌株中表达明显上调。（3）构建黄酒酵母菌株的CRISPR/Cas9基因组编辑实验体系。以ADE2为标记基因,利用网站CRISPR direct来设计一段20bp的g RNA序列（ATTGGGACGTATGATTGTTGAGG）。再以p CAS质粒为模板进行反向PCR,在p CAS质粒上引入g RNA序列。另在体外设计一段编辑过的DNA基因序列作为同源修复模板,通过优化G418添加浓度来确定最适抗生素筛选浓度,并采用高效的醋酸锂转化法进行转化培养,筛选获得红色的ade2突变体。本研究构建了黄酒酵母菌株的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的实验体系,可用于后续对差异表达蛋白质的功能验证及优良黄酒酵母菌株遗传育种等研究。
钟卓珩[2]（2021）在《UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究》文中进行了进一步梳理药用植物次生代谢产物是创新药物的重要来源。长春花中的吲哚生物碱与白桑中的异戊烯基化合物均具良好的生物活性,吲哚生物碱及其衍生物广泛用于肿瘤的临床治疗领域;但这些化合物在天然植株中的含量偏低,化学合成难度大,严重阻碍了大规模开发应用。前期研究表明,紫外线B（Ultraviolet B,UVB）辐射作为一种诱导因子,与暗培养手段结合,能引起长春花和白桑体内次生代谢物合成关键酶的响应并相应提升吲哚生物碱与Diels-Alder型加合物及其前体的含量,增加其药用价值,但UVB辐射下涉及的次生代谢激活及调控机制,如在信号转导、能量产生等方面,仍不清楚。本论文基于系统生物学研究思路,整合蛋白质组学、代谢组学、分子生物学等手段,对长春花及白桑响应UVB辐射的分子机理进行了探究,为阐明药用植物中活性成分生物合成机制奠定了基础,主要内容和结果如下:（1）UVB辐射下长春花磷酸化信号通路及初生代谢变化研究为探究UVB辐射下长春花叶片的响应,开展了ATP含量测定、磷酸化蛋白质组学分析、GC-MS代谢组学分析及Western-Blotting实验。结果表明,在UVB辐射下,叶片中ATP含量显着上升;磷酸化蛋白质组学分析鉴定了242个变化的磷酸化蛋白,这些磷酸化蛋白主要与蛋白质合成、修饰、降解及信号传递、转导相关,其中钙调蛋白、钙离子依赖型蛋白激酶、热激蛋白含量显着增加;GCMS代谢组学分析鉴定了110个变化的代谢物,主要属于糖类、有机酸类、氨基酸类、醇类,其中戊糖类、芳香族氨基酸类、苯丙素类代谢物显着增加;整合组学数据与Western-Blotting结果发现,糖酵解与活性氧清除系统相关途径显着变化。这些结果说明,UVB辐射对植物造成了氧化胁迫,并激活了钙离子依赖型的蛋白磷酸化/去磷酸化修饰。一方面,糖酵解途径蛋白精准调控,三羧酸循环上调,促进了ATP生成,为次生代谢中的合成反应提供能量;另一方面,氧化还原反应相关的蛋白上调,并参与催化部分次生代谢中的反应,进一步促进次生代谢物积累。（2）UVB辐射下长春花能量调控及次生代谢物积累研究为进一步探究UVB辐射下长春花叶片中线粒体对能量调控的作用及与次生代谢的联系,开展了线粒体酶活抑制实验、亚细胞器蛋白质组学分析、LC-MS靶向/非靶向代谢组学分析及q RT-PCR实验。线粒体酶活抑制实验表明,线粒体ATP合酶的抑制阻止了UVB辐射下ATP含量的上升。亚细胞器蛋白质组学分析鉴定了1051个线粒体相关蛋白质,其中线粒体呼吸链复合体I蛋白含量减少,复合体II、复合体IV蛋白含量增加;甲基赤藓糖磷酸（MEP）途径蛋白含量增加,香叶基焦磷酸（GPP）合酶含量增加,GPP还原酶含量降低;q RT-PCR实验证实这些蛋白对应基因的m RNA水平变化与蛋白变化趋势一致。LC-MS代谢组学分析鉴定了126个变化代谢物,主要包括生物碱类、有机酸类、糖类、苯丙素类、脂肪酸类,其中8个吲哚类生物碱含量显着增加。整合多组学数据分析发现,部分氨基酸代谢水平下降,色氨酸合成水平上升。这些结果说明,线粒体参与了UVB辐射反应的调控,一方面,不同复合体的响应保持了高ATP供应,MEP途径激活,GPP合酶含量增加,推动了GPP到单萜类骨架的转化,促进了吲哚生物碱单萜类前体的积累。另一方面,线粒体中部分氨基酸代谢水平下降,调控氮流参与色氨酸合成,促进吲哚生物碱另一前体积累。（3）UVB辐射结合不同时长暗培养下白桑调控机制研究为探究药用植物UVB辐射下调控机制存在的共性与特点,以白桑为例,开展了UVB辐射下白桑蛋白质组学分析、代谢物指纹图谱差异分析、体外抗氧化活力测定、化合物含量测定及q RT-PCR实验,分析了UVB辐射后暗培养不同阶段下及未处理植株不同组织部位间的差异。在未处理的白桑中,根部Diels-Alder型加合物及其前体含量显着高于其他部位,桑黄酮H、桑根皮素、chalcomoracin在根部的含量是其他部位的10倍以上。在UVB辐射处理后暗培养阶段,叶片中chalcomoracin等5个Diels-Alder型加合物及其前体含量显着增加;在暗培养30h下蛋白变化最为显着,有253个蛋白发生了变化,涉及黄酮类合成的查尔酮合酶、二氢黄酮醇-4-还原酶、柚皮素-2-酮戊二酸双加氧酶、苯香豆素苄基醚还原酶都有所增加。与长春花类似,UVB辐射下白桑内MEP途径激活,该途径中3个负责催化终产物异戊烯基单体合成的蛋白增加,使异戊烯基单体大量合成,促进了MEP途径下游以之为底物的反应,导致异戊烯基类化合物积累。由于白桑次生代谢途径仍未阐明,推测芳香类异戊烯基转移酶（Aromatic PT）催化的异戊烯基转移参与了Diels-Alder型加合物及其前体合成的调控。（4）白桑叶片UVB辐射下异戊烯基转移酶的功能研究为进一步研究白桑体内异戊烯基的转移机制,对白桑新型Aromatic PT展开研究。经过BLAST比对筛选、基因克隆、载体构建、体外酵母/烟草表达及功能验证实验,发现一条编码新型Aromatic PT的转录本,在UVB辐射后暗培养阶段RPKM值增加,能够催化GPP到氧化白藜芦醇的转移,命名为Ma OGT。通过生化性质测定及亚细胞定位实验,证实Ma OGT具有Aromatic PT的典型特征,拥有富含天冬氨酸的保守功能域,且定位于细胞质体。Ma OGT是首个接受GPP为异戊烯基供体的芪类PT,它的发现丰富了桑科Aromatic PT的信息,并为桑科更多未知Aromatic PT的深入挖掘提供参考。本论文通过对两种药用植物在UVB辐射下调控机制的共性与特点展开研究,阐明其在UVB辐射下分子响应及调控机制,揭示了MEP途径异戊烯基骨架合成及转移对下游物种特异性次生代谢途径激活的重要意义,对调控MEP途径活性成分的生物合成奠定了基础。
杨卓一[3]（2020）在《IL-1Ra保护ConA诱导肝细胞凋亡的分子机制研究》文中提出背景和目的肝损伤是指肝脏受到毒性药物、病毒、自身免疫性缺陷等引起的肝细胞炎症或死亡的现象,其中肝细胞死亡的主要形式是细胞凋亡和细胞坏死。伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A,ConA）是一种多克隆有丝分裂原,可以直接诱导肝细胞凋亡。动物模型中已经证实白介素1受体拮抗剂（Interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra）可以保护ConA诱导的肝损伤。磷酸化是研究最广泛,最受关注的翻译后修饰之一,它可以协调多种细胞功能,例如细胞生长、分化和凋亡,在肝细胞增殖、再生等方面也发挥着重要作用。纤维蛋白原样蛋白1（Fibrinogen like 1,FGL1）是纤维蛋白原家族中的一员,由肝细胞分泌。研究表明,FGL1通过促进受损的肝组织再生并下调促凋亡因子的表达参与肝细胞损伤的修复。本研究利用ConA诱导小鼠肝细胞AML12（Alpha mouse liver 12,AML12）细胞损伤建立磷酸化蛋白质组学模型,同时研究rhIL-1Ra对ConA诱导的肝细胞凋亡的保护作用及机制。方法采用磷酸化组学的方法,在ConA诱导AML12细胞损伤的情况下,定位定量相关磷酸化修饰蛋白的变化,并确定磷酸化修饰位点信息。构建ConA诱导的AML12细胞和HepG2细胞损伤模型;在不同浓度的ConA作用下,通过观察两种细胞的形态变化,检测细胞存活率及肝细胞的凋亡情况,考察rhIL-1Ra对ConA诱导的肝细胞凋亡的保护作用。采用双荧光酶报告基因法、实时荧光-聚合酶链反应（Real Time Polymerase Chain Reaction,RT PCR）法和western blot分别从转录水平、信使RNA（messenger RNA,mRNA）水平和蛋白水平检测rhIL-1Ra对AML12细胞内FGL1表达的影响;构建FGL1过表达质粒,瞬时转染进AML12细胞并在ConA诱导的损伤条件下检测FGL1过表达对肝细胞损伤的影响。结果本研究成功构建了ConA诱导AML12细胞损伤的磷酸化蛋白质组学模型,定量检测到82条磷酸化修饰肽段和77个磷酸化修饰蛋白。对它们进行了生物进程、分子功能、细胞成分的基因本体（Gene ontology,GO）分析以及蛋白互作关系网络构建,并得到了特定的磷酸化修饰位点信息。在ConA对AML12细胞和HepG2细胞的损伤模型中可以看出,ConA对这两个细胞都具有浓度依赖性的杀伤抑制作用。rhIL-1Ra能明显降低ConA诱导的肝损伤细胞的凋亡率,提高肝细胞的存活率,有效保护肝细胞损伤。RT PCR结果显示rhIL-1Ra可以提高FGL1 mRNA的水平;双荧光素酶报告基因结果表明rhIL-1Ra提高了AML12细胞中FGL1基因的转录水平。Western blot结果发现模型细胞中的FGL1表达量随着拮抗剂的浓度升高而升高。过表达的FGL1质粒也在损伤模型中对肝细胞起到了保护作用。研究结果表明rhIL-1Ra和FGL1均能保护ConA诱导的肝细胞损伤,并且rhIL-1Ra可以提高肝细胞中FGL1的水平。
占冬冬[4]（2019）在《基于定量蛋白质组学数据的质谱仪性能评价研究》文中认为随着质谱技术的不断革新以及液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的广泛应用,生命科学领域内的科研工作者们可以很容易地开展大规模的蛋白质组学研究,使之服务于新药研发和精准医学。由于再现性是科学研究的重要基础,因此在开展大规模的研究过程中,对数据产出质量的要求必须更加严苛。基于质谱的蛋白质组学技术能够对复杂样品中成千上万的蛋白质进行定性和定量,而其结果的一致性和准确性主要取决于仪器、采集方法和数据分析软件的性能。在蛋白质组学领域内,相关的质量控制工作已经研究了样品制备、液相色谱条件和生物信息学分析方法对结果差异的影响,但尚未就LC-MS/MS性能引起的差异做出评估。因此,我们收集了国家蛋白质科学中心·北京质谱平台在2016年由10台Orbitrap仪器产出的1,200个使用293T标准品进行质量控制的实验数据。根据数据校核原则,实验记录不完整或者缺失的实验被予以剔除,最终入组数据为6台仪器产出的720个实验。综合人工检查和生物信息分析手段,经过人工谱图检查、经验高峰度8 Peaks的保留时间检查、定量数据标准化、主成分分析、聚类分析和异常值分析等质量控制措施,最终确定了来自6台仪器的458个基准实验集。基于基准实验集的分析表明,我们的LC-MS/MS平台具有较高的定性重现性和定量一致性,来自技术重复对的平均Jaccard距离在肽段水平和蛋白水平分别为0.45和0.73。仪器内部的变异系数在肽段水平和蛋白水平上的量值分别为25%和33%。这个结果客观地呈现了Orbitrap型号质谱仪对于复杂样品中的肽段和蛋白鉴定的总体性能,同时也与前人的研究结果保持了一致,蛋白的可重复性和重现性要高于肽段。为了进一步探究不同型号仪器检出差异蛋白的灵敏度,我们使用了“中华家系1号”标准品进行了不同仪器间和不同中心间的相关分析,结果表明,不同型号仪器检测出的差异蛋白虽然不尽相同,但富集到的通路高度一致,真实反映了标准品来源细胞的内在生理过程。由于仪器性能的波动会引起定量响应上的扰动,我们基于每台仪器的参考肽段集合为各自仪器分别个性化地定制了相应的打分模型,用于仪器性能的监测。将人工检查和信息学分析得到的低质量和高质量实验集分别标定为阴性和阳性数据集,受试者操作特征（ROC）曲线用于评估打分模型的性能,同时确定打分阈值用来描述仪器性能所处的临界状态。来自各个模型的平均的曲线下面积（AUC）等于0.98,表明了对应打分模型的可靠性。使用2017年产出的独立验证集进一步说明了基于定量参考肽段集合的打分模型可以帮助仪器操作人员客观地评估仪器的状态,及时地对性能较差的仪器进行必要的维护。根据重现性评估的结果,我们详细地分析了影响重现性的因素,结合本文中的蛋白质组学方案,从样品制备、LC-MS/MS参数设置和生物信息学方法应用三个角度出发,列举出了提高结果重现性的举措。此外,本文研究也在磷酸化蛋白质组学领域进行了质量控制的部分拓展工作,我们开发了一款叫做PhosMap的R包,旨在帮助没有编程经验的科研人员进行磷酸化蛋白质组学定量数据的质量控制以及快速开展后续的分析。
刘璐[5]（2019）在《PD-1/PD-L1免疫抑制轴激活外周T细胞淋巴瘤胞内癌基因信号通路的探索及其对患者预后影响的初步研究》文中认为目的:本研究主要的目的是初步探索PD-1多肽刺激下PD-l/PD-L1免疫抑制轴直接激活外周T细胞淋巴瘤（PTCL）胞内癌基因信号通路情况,并通过体外进行验证,同时在PTCL肿瘤组织中探索PD-Ll和癌基因信号通路关键蛋白表达之间的相关性以及与患者临床基本特征和预后的关系。以此探讨PTCL中PD-1/PD-L1免疫抑制轴除通过PD-1调节T细胞功能之外,还可通过PD-L1调控肿瘤细胞内在癌基因信号通路的新型免疫逃逸机制,并为PTCL患者的免疫治疗联合靶向治疗提供新的思路。方法:搜索Oncomine公共数据库数据,研究PTCL组织PD-L1 mRNA表达情况;采用免疫印迹技术检测PTCL细胞株中PD-L1总表达;PD-1多肽刺激PD-L1高表达PTCL细胞系,采用蛋白质磷酸化组学检测PTCL细胞内在癌基因信号通路活化情况。采用流式细胞术检测PTCL细胞系膜上PD-L1表达;PD-1多肽刺激高表达PD-L1的PTCL细胞系,在0-2h动态检测细胞内在AKT总蛋白和活化AKT（p-AKT）水平的变化,体外验证PD-1/PD-L1直接激活PTCL胞内AKT/mTOR癌基因信号通路。收集2006年1月至2016年1月时间段内确诊的PTCL患者的临床资料和信息。同时收集这些患者福尔马林固定石蜡包埋的组织蜡块,采用多色免疫荧光技术检测PTCL患者组织中PD-L1和p-AKT的表达,分别评价以上两种生物学标记物的表达水平,采用卡方检验分析患者石蜡组织中PD-L1和p-AKT表达相关性以及与患者临床特征之间的关系。对患者进行随访,采用GraPhPad Prism5.0软件分别分析PTCL患者组织中PD-L1和p-AKT表达对患者生存的影响,进一步分析PD-L1和磷酸化AKT的共同表达关系及对患者生存和预后的影响。结果:Oncomine公共数据库数据显示,相比正常组织细胞,PTCL组织中PD-L1 mRNA高表达;五株PTCL细胞系细胞内总PD-L1也均呈高表达状态;蛋白质磷酸化组学结果显示,PD-1多肽刺激PD-L1阳性的PTCL细胞后胞内405个磷酸化位点出现上调,131个磷酸化位点出现下调,且鉴定到磷酸化位点氨基酸的比例分布丝氨酸最高,为84%,其次为苏氨酸14%,赖氨酸2%;KEGG对鉴定蛋白进行通路分析显示,上调的磷酸化蛋白参包括RNA转运、剪切、DNA复制、赖氨酸降解及AKT/mTOR信号通路等10个信号通路,下调的磷酸化蛋白参与B细胞受体信号通路、RNA转运、MAPK信号通路及HTLV等10种信号通路;流式细胞术检测结果显示,五株PTCL细胞膜上PD-L1皆呈高表达状态;经人重组PD-l多肽刺激五株PTCL细胞0-2h后,各细胞系内p-AKT均有不同程度的升高。对所收集75例PTCL患者FFPE研究,多色免疫荧光结果显示PTCL组织PD-L1的阳性率为53.3%,p-AKT阳性率为37.3%,其中PD-L1和p-AKT共表达为26.7%。X2检验显示,PD-L1与p-AKT表达为正相关（R=0.280,P=0.015）。PD-L1表达与患者临床分期和IPI相关（R=0.278,P=0.016;R=0.280,P=0.015）,p-AKT表达与患者临床分期相关（R=0.255,P=0.027）。Kaplan-Meier（log-rank）生存分析显示PD-L1或p-AKT单阳性表达的患者较其阴性表达患者预后更差,差异具有统计学意义（P=0.001,P=0.006）。根据PD-L1、p-AKT表达情况,将患者分为4组,其中PD-L1阳性且p-AKT阳性的患者预后最差,差异有统计学意义（P<0.001）。结论:1.PTCL组织中PD-L1 mRNA高表达;PTCL细胞系PD-L1也高表达,PD-1/PD-L1结合导致PTCL细胞内多个磷酸化位点上调或下调,且鉴定到磷酸化位点氨基酸的比例分布丝氨酸最高;上调或者下调的磷酸化蛋白参与多达10个癌基因信号通路的调控;2.PTCL细胞在细胞膜上高表达PD-L1,PD-1/PD-L1通路可直接激活PTCL肿瘤细胞内在AKT/m TOR癌基因信号通路。3.PTCL患者组织中PD-L1和p-AKT的阳性表达率为53.3%和37.3%,PD-L1和p-AKT表达皆与患者临床分期相关,另外PD-L1表达还与IPI评分相关;4.PTCL患者组织PD-L1和p-AKT共表达为26.7%,二者表达呈显着正相关,差异具有统计学意义;5.PD-L1或p-AKT阳性患者较阴性患者预后更差,总生存时间更短,差异具有统计学意义;此外,根据PD-L1、p-AKT表达情况,将患者进一步分为4组,其中PD-L1阳性且p-AKT阳性的患者预后最差,差异具有统计学意义。
马敏[6]（2017）在《基于质谱技术的蛋白质翻译后修饰研究》文中研究表明蛋白质翻译后修饰在生命的许多生物学过程中发挥着重要的作用,并与人类的多种疾病的发生息息相关。目前已知的蛋白质翻译后修饰有300多种类型。本文主要针对蛋白质翻译后甲基化修饰和磷酸化修饰进行了深入的研究。甲基化和磷酸化同其他类型的翻译后修饰一样,都具有低丰度、化学计量数低和动态范围变化大等特征。因此,利用传统的生物学技术不能对其进行大规模化的深入研究。蛋白质组学的突起,特别是质谱仪灵敏度、速度和自动化的提升,成为了蛋白质翻译后修饰大规模化研究的强有力工具。其中“鸟枪法”蛋白质组学策略更是被广泛地应用于翻译后修饰的研究中。本论文主要通过结合“鸟枪法”质谱技术的手段,针对甲基化的定性和定量,以及磷酸化底物筛选等三个方面进行了研究。第一,通过去除甲基化富集过程中糖基化的干扰,并结合多酶切以及多维分离的手段,本论文研发了一种重现性高、成本低、耗时少的非抗体富集的甲基化方法,DOMAIN（De-glycO-assisted MethylAtion site IdeNtification）,可以对样品进行全蛋白质组学的甲基化大规模鉴定。并且可以有效地应用于临床样本的研究中。第二,结合同位素细胞培养技术,应用DOMAIN方法,对精氨酸甲基转移酶3的底物进行了筛查。并结合由于不同同位素核结合能不同产生的微小质量偏差Neucode（neutronencoding）思想,研发了特异性识别精氨酸二甲基化的定性定量方法,CoNeucode。不仅如此,同时还开发了针对Neucode的数据处理软件,可以应用于除甲基化以外的其他Neucode数据分析。第三,利用“鸟枪法”质谱技术,对Ack1磷酸激酶底物进行了初步的研究。从组蛋白到非组蛋白,最后到细胞全蛋白质水平。希望能发现一些新的酪氨酸磷酸激酶调控机制。同时,为一些疾病,特别是癌症等疾病提供新的药物靶点和新的治疗思路。综上所述,应用先进的质谱技术不仅能在大规模范围内研究蛋白质翻译后修饰,而且为发现新的蛋白质翻译后修饰位点以及新的生命过程机制提供了极大的可能性。
龙星宇[7]（2017）在《新型磁性亲和纳米探针的制备及其在磷酸化蛋白/多肽分离富集中的应用》文中提出蛋白质的磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰形式之一。在生物体液或组织中,许多低丰度内源性的磷酸化蛋白/多肽是具有高度特异性和临床灵敏性的生物标志物,这些生物分子对多种疾病的诊断及其病理的阐释可能提供有价值的信息。由于蛋白质磷酸化过程动态可逆且丰度低,从复杂的生物样品中通过质谱直接来检测磷酸化蛋白/多肽仍然是一个巨大的挑战。亲和纳米材料因具有大的比表面积、丰富的活性亲和位点及其独特的理化结构,在磷酸化蛋白/多肽的分离和富集方面已经引起了广泛的关注,并成为目前磷酸化蛋白质组学分离、富集和鉴定方面的研究热点。因此,本论文针对低丰度的磷酸化蛋白质/多肽在质谱分析中所面临的化学计量低、离子化效率低以及信号易受高丰度非磷酸化蛋白/多肽抑制等难点问题,开展了一系列的研究工作。通过设计和发展新型的磁性亲和纳米探针,选择性地富集磷酸化蛋白/多肽,建立高效、简单、快速和方便的磁分离过程,并将磁性亲和纳米探针应用于实际生物样品中磷酸化蛋白/多肽的分离富集,取得了令人满意的分离富集效果。本论文由绪论（第一章）和研究工作（第二～六章）组成,研究工作主要涉及两类新型亲和探针,即磁性尖晶石类（第二、三和四章）和稀土基类的亲和探针（第五和六章）,面向应用于对磷酸化蛋白/肽进行选择性富集而展开研究,具体内容如下:（1）简述了生物质谱技术的发展史,包括质谱仪的基本构造和工作原理,着重介绍基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）及其基质的选择,并对蛋白质/多肽组学研究及其引申出的磷酸化蛋白质/多肽组学的研究意义进行阐述,重点对磁性亲和纳米探针在磷酸化蛋白/多肽富集中的应用作了概述,归纳了近年来磷酸化蛋白/多肽富集新技术、新方法的应用,并对富集过程采用的磁性材料进行分类总结。最后,简要地介绍了本论文的研究思路。（2）可逆的蛋白质磷酸化作用在各种生物过程中起着非常重要的作用,特别是异常的磷酸化作用是导致人类疾病的原因或结果。我们通过合成简单、低廉的磁性Fe3O4纳米簇（Fe3O4MNCs）亲和探针,从人唾液样中成功地选择性富集和萃取内源性磷酸化肽段,并通过MALDI-TOFMS或二级质谱（MS/MS）来进一步说明和鉴定。制备的磁性纳米簇材料的物化性质通过SEM、TEM、XRD、EDX和SQUID等技术来表征。基于材料的高亲和性、快速分离、良好的生物相容性、优异的分散性以及特异性吸附磷酸化肽等特性,Fe3O4 MNCs可以从标准磷酸化蛋白和脱脂牛奶的胰蛋白酶酶解液,以及人唾液样中有选择性地和有效地萃取磷酸化肽。此外,我们还将该探针应用于磷酸化蛋白快速和有效的纯化和富集过程。Fe3O4 MNCs亲和探针整合了固体路易斯酸的功能和自身固有的磁性能为一体,且采用“双经济”（时间和费用）的合成策略,可以潜在地应用于大规模的内源性磷酸化蛋白质组学的研究。（3）通过简单溶剂热法合成尖晶石型磁性锰铁氧体（MnFe2O4）微球,将其作为一种新型吸附剂,用来选择性富集和有效分离磷酸化肽。这种MnFe2O4磁性亲和微球（MAMS）,粒径均一,呈窄粒径分布,并显示出强的饱和磁化值及超顺磁性,便于磁分离应用,使操作更为简便。我们还探讨了 MnFe2O4微球的可能形成机理,在Fe3+和Mn2+分别作为铁源和锰源,同时作为双前驱体时,形成的是MnFe2O4微球;而单一的Fe3+和Mn2+作为前驱体时,则分别形成Fe3O4微球和MnOOH纳米片状结构,这些球状/片状纳米结构材料的形成过程,分别可以通过二次重结晶/Ostwald熟化机理来解释。MnFe2O4 MAMSs亲和探针在水溶液中展现出较优异的分散性,可以完成快速磁分离,且具有良好的可重复循环性。基于MnFe2O4中金属价态（Fe3+和Mn2+）和磷酸化肽中的磷酸基团（PO43-）之间的强配位作用,该探针对磷酸化肽具有高度选择性。实验还通过从β-casein及其与BSA胰蛋白酶酶解液的混合液（富含非磷酸化肽）中有效地富集磷酸化肽,证明了其高特异性吸附磷酸化肽的性能,并进一步应用于脱脂牛奶样中胰蛋白酶酶解液和复杂的生物样品人血清中磷酸化肽的富集。因此,可以预见MnFe2O4亲和探针材料在磷酸化蛋白组学研究中具有诱人的应用前景。（4）通过简便的溶剂热法制备了一种具有可控形态和尺寸的新型多功能磁性CuFeMnO4纳米球亲和探针（NSAP）,并提出了该均匀NSAP颗粒的可能生长机制。这种纳米结构的亲和探针结合了 Cu2+,Fe3+和Mn2+的优异特征,它们的多功能性能通过与肽的羧基和胺基之间的超强配位能力（Cu2+和Fe3+）,与磷酸化肽中的磷酸基团之间的特殊亲和力（Fe3+和Mn2+）,以及良好的磁场响应性来体现。我们评估了 CuFeMnO4 NSAP从复杂生物样品中高效富集和快速磁分离低丰度肽（中性条件）和有效选择性捕获磷酸化肽（酸性条件）的潜力,尤其是探索了该NSAP探针用于从通过ZnO纳米颗粒刺激不同时间后的A549细胞裂解液中高度选择性分离并捕获磷酸化肽的可行性,从而提出了一种基于CuFeMnO4的研究经过外源物刺激后,细胞信号通路中磷酸化蛋白/磷酸化肽变化的新策略。（5）成功地合成了类似荔枝壳状核-壳结构的磁性磷酸镥（Fe3O4@LuPO4）亲和微球。基于磁性LuPO4亲和微球对磷酸化肽的特异亲和作用及其自身优异的快速磁分离的性质,将其应用于选择性富集磷酸化肽的研究并用于MALDI-TOFMS分析。通过从标准蛋白（β-酪蛋白）和复合样品（β-酪蛋白和牛血清白蛋白的不同摩尔比:1:10-1:50）的胰蛋白酶酶解液及混合液、以及真实生物样品（纯鲜牛奶样和人体血清样）选择性富集磷酸化肽来验证所制备微球的富集性能。结果表明,磁性LuPO4亲和微球对磷酸化肽的富集能力非常令人满意,可以选择性地捕获磷酸化肽且MS信号急剧增强,并且可通过质谱图中存在的分辨率较差的亚稳态离子峰进行可靠鉴定。Fe3O4@LuPO4亲和微球选择性富集磷酸化肽的研究,为大规模的磷酸化蛋白质组学分析提供了强有力的研究方法。（6）分别通过共沉淀法和溶剂热法制备出两种新型的铈基纳米复合材料（P-CCS和CSF）。并基于新型探针对磷酸化肽的亲和作用提出一种顺序组合的富集策略,不仅可以有效地将磷酸化肽与非磷酸化肽分离,而且可以进一步区分单磷酸化肽和多磷酸化肽。此外,这两种CeO2掺杂的亲和探针还表现出催化去磷酸化过程的性质,可以作为一种去磷酸化过程的催化剂。具体地说,CSF探针用于捕获多磷酸化肽,而P-CCF探针辅助捕获单磷酸化肽。通过这种方式,成功实现了单和多磷酸化肽的有效分步富集。因此,这种组合策略可以作为一种良好的对全磷酸化肽进行分离富集的替代方式。
付强[8]（2016）在《水牛生殖细胞蛋白质组表达谱构建和定量差异分析》文中研究表明水牛（Bubalus bubalis）是我国宝贵的家畜品种,具有耐粗饲、饲料转化率高、乳品的营养价值高等特点,具有巨大的经济开发价值。但水牛繁殖效率低,生殖细胞成熟质量是影响水牛繁殖率的主要原因之一。生殖细胞成熟发育是复杂的生物学过程,这种复杂性主要表现在转录、翻译和翻译后修饰及调控网络上。蛋白质是生命功能的执行者,采用高通量的蛋白质组学技术可大规模发现蛋白质的表达和翻译后修饰,有助于从整体上揭示生殖细胞发育的蛋白质调控网络,筛选和鉴定关键基因或生物标志物。目前,生殖细胞的组学研究在模式生物中的开展较多,但在水牛上的报道相对较少,本文开展水牛生殖细胞及其发育内环境的蛋白质组研究,从蛋白质表达和修饰方面探究影响精子活力的因素,利用多组学关联分析获得卵母细胞成熟过程中的蛋白质表达变化和转录变化,为水牛的生殖生理研究提供新的研究点,为在分子水平上揭示精子和卵母细胞的发育和成熟打下理论基础。本文的主要研究结果如下:一、水牛生殖细胞（精子、卵母细胞）及微环境（精浆、卵泡液）蛋白质组表达谱构建和生物学信息学分析。利用MudPIT（Multi-dimensional Protein Identification Technology）蛋白质组学策略在精子和精浆中分别鉴定到2147种和864种蛋白质,在卵母细胞和卵泡液中分别鉴定到1710种和363种蛋白质。构建了包括蛋白质的登录号、名称、分子量、等电点、谱图等信息的水牛生殖细胞公共数据库。开源的公共数据库将为发育生物学研究提供有价值的资源。其次,对蛋白质表达谱进行生物信息学分析和数据挖掘,通过Gene Ontology分析,对精子、卵母细胞、精浆和卵泡液蛋白质的细胞定位、参与生物学过程和分子功能进行富集分析,筛选了一批与受精、减数分裂等有关的重要蛋白质候选物。通过KEGG数据库富集生殖细胞及其微环境涉及的各类生物学代谢通路,精子和卵母细胞中较多蛋白质参与各类能量代谢、合成代谢通路;精浆和卵泡液通过补体级联通路和蛋白酶体通路起到稳定内环境的作用。根据蛋白质的功能和作用关系,绘制了水牛精子、卵母细胞的蛋白质相互作用网络,发现了一批与配子发育有关的蛋白质互作事件。该部分研究丰富了水牛蛋白质组和功能基因信息,为阐明精子和卵母细胞的成熟机制提供了研究基础。二、精子活力是影响受精能力的关键因素之一,为了探寻精子活力的维持机制,比较了高、低活力精子的蛋白质表达和磷酸化修饰变化并进行实验验证。采用Percoll密度梯度离心分离高、低活力精子,分别提取总蛋白质,应用TMT（Tandem Mass Tag）外标定量法结合高分辨率质谱分析对水牛高、低活力精子的差异蛋白质开展了研究。结果表明,在低活力精子中筛选到145种表达显着差异的蛋白质,其中上调蛋白52种,下调蛋白93种,差异蛋白质变化总体呈现下降趋势。上调蛋白质主要涉及形态发生和调节细胞分化,下调蛋白质与转运、氧化还原反应、微管构成、精子动力、调节cAMP代谢过程、DNA甲基化调节等生物进程有关。通过磷酸化分析,在高活力精子中获得197种磷酸化蛋白质、384种磷酸化肽段和441个磷酸化位点,在低活力精子中获得178种磷酸化蛋白质、361种磷酸化肽段和424个磷酸化位点。磷酸化蛋白质在精子中普遍存在,涉及多个生物学事件和信号通路,暗示磷酸化修饰在精子功能的维持上起重要作用。比较高、低活力精子的磷酸化肽段,发现了 22个差异修饰位点异常,定位到的9种磷酸化蛋白质,包括激酶锚定蛋白3（AKAP3）、激酶锚定蛋白4（AKAP4）、外膜致密纤维蛋白1（ODF1）、纤维鞘互作蛋白（FSIP2）等结构性蛋白质。这些差异蛋白质的表达量变化或修饰变化共同说明低活力精子表现出能量代谢低效率、精子核鱼精蛋白不足、动力蛋白的下调和尾部结构蛋白磷酸化修饰变异。采用Western blot和RT-PCR验证了 6种差异蛋白质:鱼精蛋白1（PRAM1）、多配体糖蛋白（SDC2）、细胞支架蛋白3（TEKT3）、激酶锚定蛋白3（AKAP3）、螺旋卷曲蛋白40（CCDC40）、异柠檬酸脱氢酶（IDH1）,它们的表达量变化均与质谱定量结果一致,RT-PCR证实SDC2、TEKT3和IDH1蛋白质的mRNA与蛋白质的表达相关性较低,说明这些蛋白质变化受到翻译调控影响。三、卵母细胞在体外成熟的分子机制尚不完全清楚,为获得水牛卵母细胞成熟过程的核质变化,比较了卵母细胞成熟培养前后的蛋白质表达差异,结合转录组数据进行系统生物学分析。首先,应用TMT外标定量结合质谱技术比较了水牛成熟培养前后卵母细胞的蛋白质变化,以成熟前卵母细胞作为对照组,成熟后的卵母细胞中鉴定到62种差异蛋白质,38种蛋白质表达上调,24种表达下调,差异蛋白质涉及能量合成、RNA剪切、转运等生物过程。Western blot验证了 HSP60和GEMIN8蛋白质表达变化。为发现相关基因在转录水平的表达量变化,通过高通量测序获得成熟前、成熟后卵母细胞转录本,与参考基因组比对率分别为86.4%和86.8%,与转录本比对率分别为22.4%和23.7%。比较两个转录组文库的FPKM值,发现了2667个差异表达基因,1695个基因在成熟卵母细胞中表达量下调,972个基因上调,转录组差异基因数量明显高于蛋白质水平。COG分析表明,转录、复制重组、信号传导机制、核糖体结构、翻译后修饰等是差异基因涉及的主要事件。差异基因与多种信号通路有关联,与差异蛋白质的功能聚类分析有较大不同。将转录组序列与蛋白质组序列进行BLASTx比对,将共同表达的unigene进行关联分析,相关系数r = 0.49,说明卵母细胞在成熟过程中转录和翻译的相关性较低。在筛选到的62个差异表达蛋白质中,27个差异蛋白质可在转录组中得到关联,相关系数r = 0.57,其中14种蛋白质的基因转录和蛋白质表达均呈现显着性变化。综上所述,本试验将高通量的蛋白质组学和差异磷酸化分析的技术体系应用于水牛精子活力研究,有助于阐明蛋白质变化与精子活力维持的关系。将多组学技术用于卵母细胞发育研究,发现卵母细胞成熟过程的基因和蛋白质表达变化,对于探讨卵母细胞成熟机制和提高IVF效率具有重要价值。
翟睿[9]（2016）在《功能化磁性纳米材料的制备及其在蛋白质组学中的应用方法研究》文中认为随着生命科学研究飞速发展和后基因组学时代到来,蛋白质作为生命活动的执行体,调节着生物体内诸多重要的生理生化活动。监测蛋白质动态变化、翻译后修饰状态以及研究蛋白质结构功能等对于人们认识生命活动的本质有着极为重要意义。其中,蛋白质磷酸化不仅参与生物体内诸多生命活动,还与多种疾病的发生发展息息相关。作为蛋白质组学研究的核心技术,生物质谱在磷酸化蛋白质组研究中发挥着重要作用并得到了广泛应用。然而,由于生物样本的复杂性以及在磷酸化蛋白质组分析中存在的大量非磷酸化肽段对磷酸肽质谱分析造成的信号干扰,使磷酸化蛋白质组分析面临巨大挑战。此外,在“bottom-up”分析策略中,传统溶液酶切法耗时长,易发生酶的自切,极大影响了蛋白质鉴定通量和覆盖率。因此,发展快速、高效的蛋白质样品预处理新方法是提高蛋白质分析灵敏度和鉴定效率的关键。本文针对以上问题,（1）发展了两种基于新型功能化磁性纳米材料的磷酸肽富集分离新方法并成功应用于实际生物样本,克服了基于固相金属离子亲和色谱法富集磷酸肽特异性差的缺点,并提高了磷酸肽的鉴定效率;（2）制备了一种基于磁性金属有机框架（metal-organic frameworks,MOFs）材料的新型固定化酶反应器,显着提高了蛋白质酶切效率并成功应用到小鼠卵母细胞蛋白样本的快速高效酶切。本论文中,首先阐述了不同材料在蛋白质组学样品前处理过程中的国内外研究现状,包括功能化磁性纳米材料用于磷酸肽的快速富集和固定化酶反应器,以及金属有机框架材料的研究进展与应用等。其次,基于镧系金属表面电子云分布及其与磷酸根可产生相互作用的特征设计合成了一种混合镧系金属(Tb3+,Tm3+,Ho3+,Lu3+)固载的新型功能化磁性纳米材料,Fe3O4@TCPP-DOTA-M3+,并将其应用于磷酸肽的快速、特异性富集。材料合成中,TCPP（tetrakis（4-carboxylphenyl）porphyrin）的应用不仅可以提高DOTA和镧系金属离子的负载量进而增加材料与磷酸肽的碰撞几率,同时也可以提高磁性纳米材料的亲水性从而获得更高的磷酸肽富集效率。另外,大环配合物DOTA（1,4,7,10-tetraazacyclododecane N,N’,N’’,N’’’-tetraacetic acid）可与镧系金属螯合形成热稳定性极高的金属复合物,进一步增强材料的整体稳定性。实验结果表明,当5 pmolα-酪蛋白酶切产物经新材料富集分离后可鉴定19条磷酸肽。即使在100倍（摩尔比）BSA蛋白酶切产物干扰下,经新材料富集分离后仍可鉴定到16条磷酸肽,其特异性明显优于商品化的TiO2材料的富集鉴定结果。该新型功能化磁性纳米材料进一步应用于HeLa细胞蛋白提取样品的磷酸肽富集。在单次质谱鉴定后,可成功检测到9048条磷酸化肽段对应2103个磷酸化蛋白质组。另外,为了系统分析不同金属离子与磷酸根相互作用行为差异,设计合成了不同金属离子(Ti4+,Zr4+,Fe3+,Tb3+,Tm3+,Ho3+)固载的新型功能化磁性纳米材料,Fe3O4@TCPP-DOTA-Ms,并成功应用于多位点磷酸化肽段特异性富集。实验结果表明,Fe3O4@TCPP-DOTA-Tb,Ti富集磷酸肽效果明显优于其他金属离子固载的材料,并且在鉴定到的磷酸肽中多位点磷酸化肽段的比例也较高。实验结果进一步证明,固载过渡金属的磁性纳米材料富集磷酸肽的灵敏度优于固载镧系金属的材料,而固载镧系金属的磁性纳米材料富集磷酸肽的选择性优于固载过渡金属的材料。结合过渡金属和镧系金属的优势,采取Fe3O4@TCPP-DOTA-Tb/Ti联合富集的策略,在HeLa细胞中成功鉴定到了13450条磷酸肽对应2965个磷酸化蛋白质组,富集特异性高达94%。其中,多位点磷酸化肽段占总磷酸肽的比例超过了50%,结果明显优于DHB/TiO2的富集鉴定方法（13.39%）。最后,由于固定化酶反应器可极大缩短蛋白质酶切时间,且MOFs材料具有较大的比表面积和可选择的作用位点,因此将二者结合制备了一种磁性MOFs材料基固定化酶反应器,Fe3O4@DOTA-ZIF-90-trypsin,并成功应用于小鼠卵母细胞蛋白样本的蛋白质组分析。本工作合成的新型磁性MOFs材料既具有良好的磁响应,又具备MOFs材料比表面积大、结构及热稳定性高等优势。将胰蛋白酶通过与磁性MOFs材料表面的大量醛基共价连接在磁性MOFs材料表面,获得新型固定化酶反应器。实验结果表明,BSA蛋白经1 min酶切后,获得了77%的氨基酸序列覆盖率,其酶切效率优于12 h传统溶液酶切结果（70%）。小鼠卵母细胞蛋白提取样本经20 min酶切后,单次质谱鉴定可检测到8957条肽段对应1843个蛋白质组。与传统溶液酶切相比,在酶切后鉴定的肽段和蛋白质组数目上新方法有67%和40%的提高。本研究不仅发展了一种磁性MOFs材料快速有效的合成策略,同时也进一步扩大了MOFs材料在蛋白质组学中的应用。
梁雪芳,赵吉,查金苗,王子健[10]（2016）在《磷酸化蛋白质组学技术的发展及其在环境毒理研究中的应用》文中提出磷酸化修饰是蛋白质最主要的翻译后修饰形式之一,磷酸化蛋白质组学从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化,为探讨药物刺激和环境应激下生物体受损的生物学过程提供新的视角.针对磷酸化蛋白质组学技术的发展以及其在环境毒理研究中的应用展开综述.首先,从磷酸化肽富集、磷酸化蛋白的鉴定和磷酸化位点的预测、定量磷酸化蛋白质组学研究3个方面对磷酸化蛋白质组学技术的研究内容和分析策略进行了概述.在此基础上,按照离体实验、活体实验以及毒性作用通路分析3部分对磷酸化蛋白质组学在环境毒理研究中的应用进行了详细阐述.最后,总结了目前磷酸化蛋白质组学研究的不足,并有针对性地提出了磷酸化蛋白质组学在环境毒理研究中的发展方向.
二、磷酸化肽段质量数的分布特征（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、磷酸化肽段质量数的分布特征（论文提纲范文）
（1）黄酒酵母的蛋白组学及CRISPR基因编辑研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 氮代谢物阻遏效应 |
| 1.1.1 氨基甲酸乙酯及其产生 |
| 1.1.2 氮代谢中心代谢途径 |
| 1.1.3 氮代谢物阻遏效应 |
| 1.2 蛋白质组学 |
| 1.2.1 蛋白质组学简介 |
| 1.2.2 蛋白质组学的研究策略 |
| 1.2.3 蛋白质组学的主要研究技术 |
| 1.2.4 蛋白质组学在酿酒酵母研究中的应用 |
| 1.3 CRISPR技术 |
| 1.3.1 基因编辑技术的发展 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas编辑技术 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas技术在酿酒酵母研究中的应用 |
| 1.4 主要内容与研究意义 |
| 1.4.1 本课题的主要内容 |
| 1.4.2 研究目的和意义 |
| 2 黄酒酵母菌株的蛋白组学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 实验所用的主要试剂 |
| 2.2.4 实验所用的主要仪器 |
| 2.3 实验方法与数据分析 |
| 2.3.1 样品准备与生长曲线测定 |
| 2.3.2 蛋白的预处理 |
| 2.3.3 标记肽段的HPLC预分离 |
| 2.3.4 液质联用分析 |
| 2.3.5 数据库搜索 |
| 2.3.6 功能注释分析方法 |
| 2.3.7 数据统计方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 黄酒酵母菌株生长曲线的绘制 |
| 2.4.2 蛋白抽提和定量结果 |
| 2.4.3 质谱数据的质控检测 |
| 2.4.4 定量重复性分析 |
| 2.4.5 差异表达蛋白的筛选 |
| 2.4.6 差异表达蛋白的功能注释分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 黄酒酵母CRISPR基因编辑系统构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 培养基与溶剂 |
| 3.2.3 实验所用的主要试剂 |
| 3.2.4 实验所用的主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 g RNA的设计 |
| 3.3.2 分子生物学实验方法 |
| 3.3.3 大肠杆菌感受态的制备 |
| 3.3.4 大肠杆菌感受态的转化 |
| 3.3.5 质粒的提取以及测序验证 |
| 3.3.6 同源修复片段DNA的设计 |
| 3.3.7 同源修复片段DNA的扩增和纯化 |
| 3.3.8 工业酿酒酵母化学转化感受态的制备 |
| 3.3.9 工业酿酒酵母化学转化方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 g RNA的选择 |
| 3.4.2 CAS9-g RNA复合物的连接 |
| 3.4.3 p CAS-g RNA质粒的测序鉴定 |
| 3.4.4 同源修复片段DNA的扩增 |
| 3.4.5 G418 添加浓度的优化 |
| 3.4.6 醋酸锂法共转化 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 药用植物长春花及白桑在肿瘤治疗的应用现状及前景 |
| 1.1.2 药用植物对紫外UVB辐射的响应 |
| 1.2 蛋白质组学技术发展及其在植物胁迫响应机制方面的研究进展 |
| 1.2.1 蛋白质组各流程技术及进展 |
| 1.2.2 植物单细胞型、亚细胞器及修饰型蛋白质组学研究进展 |
| 1.3 代谢组学及多组学联合分析在研究胁迫响应机制的进展 |
| 1.3.1 植物代谢组学研究技术与进展 |
| 1.3.2 代谢组学及多组学分析植物胁迫响应机制进展 |
| 1.4 植物来源异戊烯基转移酶研究进展 |
| 1.4.1 植物体内异戊烯基化反应及意义 |
| 1.4.2 植物芳香类异戊烯基转移酶功能及特性 |
| 1.4.3 植物芳香类异戊烯基转移酶研究现状及前景 |
| 1.5 本文的研究内容及意义 |
| 第二章 UVB辐射下长春花磷酸化通路及初生代谢研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 植物来源及处理 |
| 2.2.2 试剂及仪器 |
| 2.2.3 叶片ATP含量的测定 |
| 2.2.4 磷酸化蛋白的提取与富集 |
| 2.2.5 蛋白质组鉴定 |
| 2.2.6 全叶片代谢组样品制备及代谢组学分析 |
| 2.2.7 Western-Blotting |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 长春花叶片UVB辐射下ATP含量变化 |
| 2.3.2 磷酸化蛋白的鉴定及丰度检测 |
| 2.3.3 基于GC-TOF/MS技术检测的长春花UVB辐射下代谢物变化 |
| 2.3.4 关键差异表达蛋白的Western-Blotting鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 UVB辐射下长春花叶片内钙离子相关通路激活 |
| 2.4.2 UVB辐射下长春花糖酵解相关通路变化导致ATP增加 |
| 2.4.3 UVB辐射对长春花叶片造成氧化胁迫并激活次生代谢途径 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 UVB辐射下长春花能量调控及次生代谢研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 植物来源及处理 |
| 3.2.2 试剂及仪器 |
| 3.2.3 不同线粒体呼吸复合体抑制剂作用下ATP含量测定 |
| 3.2.4 叶片线粒体的纯化与蛋白富集 |
| 3.2.5 蛋白质组鉴定 |
| 3.2.6 全叶片代谢组学分析 |
| 3.2.7 qRT-PCR |
| 3.2.8 数据处理与分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 不同线粒体呼吸链抑制剂处理后长春花叶片在UVB辐射下ATP含量变化 |
| 3.3.2 长春花叶片线粒体蛋白富集与纯化程度检测 |
| 3.3.3 UVB辐射下长春花叶片线粒体差异蛋白的鉴定与功能注释 |
| 3.3.4 基于LC-MS技术检测的长春花UVB辐射下代谢物变化 |
| 3.3.5 差异蛋白质组与代谢组结合分析 |
| 3.3.6 关键差异表达蛋白基因的表达变化情况 |
| 3.4 .讨论 |
| 3.4.1 线粒体参与调控UVB辐射下长春花叶片内ATP含量的变化 |
| 3.4.2 UVB辐射下MEP途径被激活使得单萜类前体物质积累 |
| 3.4.3 氨基酸代谢调控UVB辐射下长春花叶片中吲哚类生物碱的合成 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 UVB辐射结合不同时长暗培养下白桑调控机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 植物来源与取样 |
| 4.2.2 试剂及仪器 |
| 4.2.3 蛋白质提取及蛋白质组鉴定 |
| 4.2.4 抗氧化水平检测 |
| 4.2.5 甲醇提取物指纹图谱建立与代谢物定量分析 |
| 4.2.6 总黄酮含量测定 |
| 4.2.7 qRT-PCR |
| 4.2.8 数据处理与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 桑叶UVB辐射后不同暗培养时间点差异蛋白鉴定 |
| 4.3.2 桑叶UVB辐射后不同暗培养时间点次生代谢相关差异蛋白功能分析 |
| 4.3.3 桑叶、枝、根部代谢物指纹图谱及差异代谢物含量测定 |
| 4.3.4 桑叶、枝、根部蛋白鉴定及功能分析 |
| 4.3.5 桑叶、枝、根部次生代谢相关差异性分析 |
| 4.3.6 不同部位差异表达蛋白基因的表达量分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 白桑UVB辐射后暗培养阶段MEP途径内蛋白的变化及意义 |
| 4.4.2 异戊烯基化合物在白桑根部大量积累 |
| 4.4.3 白桑不同组织部位有效成分及相关蛋白分布存在巨大差异 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 白桑叶片UVB辐射下异戊烯基转移酶的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 生物材料来源 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 异戊烯基转移酶基因的筛选 |
| 5.2.4 酵母表达载体构建 |
| 5.2.5 酵母表达体系建立 |
| 5.2.6 最适底物的筛选 |
| 5.2.7 烟草瞬时表达载体及表达体系构建 |
| 5.2.8 基因在植物中的功能及亚细胞定位分析 |
| 5.2.9 最适反应条件摸索及米氏常数测定 |
| 5.2.10 基因系统进化分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 白桑中异戊烯基转移酶基因序列及表达信息挖掘 |
| 5.3.2 基因在酿酒酵母细胞内的表达与功能验证 |
| 5.3.3 基因在本氏烟草内的瞬时表达亚细胞定位与功能验证 |
| 5.3.4 异戊烯基转移酶Ma OGT的最适反应条件 |
| 5.3.5 基因系统发育分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 MaOGT的功能及生化性质特点 |
| 5.4.2 MaOGT在白桑次生代谢生物合成途径的意义 |
| 5.4.3 MaOGT在进化发育的位置及意义 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
（3）IL-1Ra保护ConA诱导肝细胞凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 rhIL-1Ra对肝细胞损伤的保护 |
| 1.1 肝细胞与肝损伤 |
| 1.2 白介素1 家族以及rhIL-1Ra对肝细胞损伤的调控作用 |
| 1.3 FGL1 在肝细胞损伤中的保护作用 |
| 2 ConA诱导的肝细胞损伤模型与磷酸化蛋白质组学 |
| 2.1 ConA诱导炎症性肝损伤与体外肝细胞损伤模型研究 |
| 2.2 肝脏损伤过程的磷酸化蛋白质组学研究 |
| 第二章 ConA诱导肝细胞损伤的磷酸化蛋白质组学研究 |
| 1 导言 |
| 2 材料和试剂 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞收集以及样品前处理 |
| 3.3 样品上机测试 |
| 3.4 数据处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 定量蛋白质组结果分析 |
| 4.2 定量分析磷酸化蛋白质组 |
| 4.3 磷酸化修饰位点的确定 |
| 4.4 差异磷酸化修饰蛋白功能与互作关系分析 |
| 5 讨论 |
| 第三章 rhIL-1Ra对 ConA诱导的肝细胞凋亡的保护作用 |
| 1 导言 |
| 2 材料和试剂 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 AML12 细胞和HepG2 细胞的培养 |
| 3.2 ConA诱导肝细胞损伤模型的建立 |
| 3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 3.4 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 ConA诱导的AML12 细胞和HepG2 细胞损伤模型的建立 |
| 4.2 rhIL-1Ra抑制肝细胞凋亡 |
| 5 讨论 |
| 第四章 rhIL-1Ra促进肝细胞内FGL1 的表达 |
| 1 导言 |
| 2 材料和试剂 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 双荧光素酶报告基因法 |
| 3.2 Real-Time PCR |
| 3.3 Western-blot检测rhIL-Ra对 AML12 细胞中FGL1 表达的调控 |
| 3.4 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 rhIL-1Ra促进AML12 细胞中FGL1 基因的转录 |
| 4.2 rhIL-1Ra通过提高FGL1 mRNA水平保护AML12 细胞 |
| 4.3 rhIL-1Ra剂量依赖性提高AML12 细胞中FGL1 蛋白的表达 |
| 5 讨论 |
| 第五章 FGL1对ConA诱导肝细胞损伤的保护作用 |
| 1 导言 |
| 2 材料和试剂 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 FGL1 过表达质粒的构建 |
| 3.2 细胞培养与转染 |
| 3.3 Western-Blot检验FGL1 质粒的表达 |
| 3.4 FGL1对ConA诱导的AML12 细胞损伤的保护作用 |
| 3.5 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 FGL1 过表达质粒的构建 |
| 4.2 FGL1 过表达质粒的表达 |
| 4.3 FGL1 过表达保护ConA诱导的AML12 细胞损伤 |
| 5 讨论 |
| 第六章 结论及工作展望 |
| 1 rhIL-1Ra保护肝细胞损伤的研究总结 |
| 2 rhIL-1Ra保护肝细胞损伤的研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 定量蛋白质组和磷酸化肽段总表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间的成果 |
（4）基于定量蛋白质组学数据的质谱仪性能评价研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 基因组、转录组和微生物组学数据质量评估研究现状 |
| 1.2 蛋白质组学数据质量评估研究现状 |
| 1.3 本文针对质谱仪性能评价研究的内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 本文的创新点 |
| 1.4 实验技术路线 |
| 第二章 研究设计和评估工作流程构建 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 标准品制备 |
| 2.2.2 数据收集 |
| 2.2.3 基准实验集生成 |
| 2.3 案例研究:确定基准数据集的质量控制过程 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 重复性和重现性评估 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 定性分析 |
| 3.3.2 定量分析 |
| 3.3.3 差异蛋白质组分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 参考肽段集合的生成和性能评价模型的建立 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 提高蛋白质组学结果重现性的方案推介 |
| 5.1 影响重现性的因素 |
| 5.2 提高重现性的措施 |
| 5.2.1 样品制备 |
| 5.2.2 LC-MS/MS系统 |
| 5.2.3 生物信息学分析 |
| 5.3 方案推介 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 磷酸化蛋白质组学质量控制软件开发 |
| 6.1 研究背景 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 数据预处理模块 |
| 6.2.2 数据分析和可视化模块 |
| 6.3 结果和讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论与讨论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（5）PD-1/PD-L1免疫抑制轴激活外周T细胞淋巴瘤胞内癌基因信号通路的探索及其对患者预后影响的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、PD-1/PD-L1免疫抑制轴激活外周T细胞淋巴瘤胞内癌基因信号通路的探索 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 所用试剂 |
| 1.1.3 所用仪器和耗材 |
| 1.1.4 所用试剂配制 |
| 1.1.5 试验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 人PTCL组织样本中PD-L1的mRNA表达 |
| 1.2.2 PTCL细胞株总PD-L1的表达 |
| 1.2.3 蛋白质样本的质控 |
| 1.2.4 质谱结果的质量评估 |
| 1.2.5 磷酸化位点分析 |
| 1.2.6 差异磷酸化的计算 |
| 1.2.7 差异磷酸化蛋白质GO功能富集分析 |
| 1.2.8 差异磷酸化蛋白KEGG通路富集分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、PD-1/PD-L1免疫抑制轴激活外周T细胞淋巴瘤胞内癌基因信号通路的验证 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.1.4 所用试剂配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PTCL细胞系中PD-L1在膜上的表达 |
| 2.2.2 PD-1 刺激下的PTCL细胞内p-AKT上调 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、PTCL患者肿瘤组织中PD-L1和p-AKT表达与外周T细胞淋巴瘤患者预后的关系 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 包埋组织 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和耗材 |
| 3.1.4 所用试剂配制 |
| 3.1.5 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PTCL患者的基本临床特征 |
| 3.2.2 PTCL患者的病理亚型 |
| 3.2.3 PTCL患者病理组织中PD-L1和p-AKT的表达 |
| 3.2.4 PTCL患者PD-L1表达与患者临床特征的关系 |
| 3.2.5 PTCL患者PD-L1表达与患者预后的关系 |
| 3.2.6 PTCL患者p-AKT表达与患者临床特征的关系 |
| 3.2.7 PTCL患者p-AKT表达与患者预后的关系 |
| 3.2.8 PTCL患者PD-L1和p-AKT表达的相关性 |
| 3.2.9 PTCL患者组织中PD-L1和p-AKT共表达的患者与预后的关系 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 原发性和获得性耐药性PD-1/PD-L1在癌症治疗中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于质谱技术的蛋白质翻译后修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质翻译后修饰 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 蛋白质甲基化修饰 |
| 1.1.3 蛋白质磷酸化修饰 |
| 1.1.4 其他翻译后修饰: |
| 1.2 蛋白质组常用技术 |
| 1.2.1 样品预分离技术 |
| 1.2.2 质谱鉴定技术 |
| 1.3 定量蛋白质组技术 |
| 1.3.1 有标定量 |
| 1.3.2 无标定量 |
| 1.4 本课题主要研究内容及意义 |
| 第2章 基于HILIC富集甲基化修饰新方法的研发 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 常用储存液配置 |
| 2.2.4 样品制备流程 |
| 2.2.5 质谱检测和数据分析 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 糖肽对甲基化肽段富集的干扰 |
| 2.3.2 LysargiNase对甲基化肽段富集的影响 |
| 2.3.3 应用DOMAIN方法大规模鉴定甲基化修饰位点 |
| 2.3.4 甲基化修饰位点的生物信息学分析 |
| 2.3.5 本章小结 |
| 第3章 基于定量技术的甲基化鉴定方法的应用 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂与材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 储液配置 |
| 3.2.4 样品制备流程 |
| 3.2.5 质谱检测和数据分析 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 PRMT3底物筛查 |
| 3.3.2 coNeucode方法的开发 |
| 3.3.3 针对coNeucode软件的开发 |
| 3.3.4 结合DOMAIN和coNeucode进一步提高二甲基鉴定 |
| 3.3.5 质谱碎裂模式优化 |
| 3.3.6 本章小结 |
| 第4章 蛋白质酪氨酸磷酸化修饰相关研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 储液配置 |
| 4.2.4 样品制备流程 |
| 4.2.5 质谱检测和数据分析 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 CRISPR ACK1效果 |
| 4.3.2 组蛋白酪氨酸磷酸化研究 |
| 4.3.3 全蛋白质组学的ACK1酪酸磷酸化研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况 |
| 致谢 |
（7）新型磁性亲和纳米探针的制备及其在磷酸化蛋白/多肽分离富集中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文的主要创新点 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物质谱技术概述 |
| 1.1.1 质谱技术的发展 |
| 1.1.2 质谱仪的工作原理 |
| 1.1.3 质谱的分类 |
| 1.1.4 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) |
| 1.2 蛋白质组学研究概述 |
| 1.2.1 蛋白质与蛋白质组学 |
| 1.2.2 蛋白质组学研究 |
| 1.2.3 蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification,PTM) |
| 1.2.4 基于生物质谱技术的蛋白质组学研究 |
| 1.3 磷酸化蛋白质/多肽组学研究概述 |
| 1.3.1 磷酸化蛋白/多肽的分离与富集技术策略 |
| 1.3.2 磷酸化蛋白质/多肽的识别与位点的鉴定 |
| 1.3.3 磷酸化蛋白质/多肽组学研究 |
| 1.4 磁性亲和探针材料及其在磷酸化蛋白/多肽富集中的应用 |
| 1.4.1 磁性金属氧化物(MOs)亲和探针对磷酸化肽的富集 |
| 1.4.2 磁性无机盐类亲和探针对磷酸化肽的富集 |
| 1.4.3 氨基功能化的磁性亲和探针对磷酸化肽的富集 |
| 1.4.4 固定金属离子的磁性亲和探针对磷酸化肽的富集 |
| 1.4.5 其它平台结合磁性亲和探针富集磷酸化肽 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 |
| 参考文献 |
| 第一篇 基于磁性尖晶石类亲和探针的制备及生物富集应用 |
| 第二章 低廉的磁性Fe_3O_4纳米簇亲和探针应用于人唾液样中内源性磷酸化肽的富集 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 Fe_3O_4 MNCs亲和探针的合成和表征 |
| 2.2.3 蛋白酶解 |
| 2.2.4 内源性磷酸化肽的选择性富集 |
| 2.2.5 磷酸化蛋白的选择性富集 |
| 2.2.6 MALDI-TOF MS和MS/MS分析 |
| 2.2.7 ATP考察富集回收率 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Fe_3O_4 MNCs的制备及其形貌和结构表征 |
| 2.3.2 条件优化 |
| 2.3.3 标准磷酸化蛋白的胰酶解液中选择性富集磷酸化肽 |
| 2.3.4 选择性富集脱脂牛奶样中的磷酸化肽 |
| 2.3.5 富集人唾液样中的内源性磷酸化肽 |
| 2.3.6 蛋白混合样中富集磷酸化蛋白 |
| 2.3.7 与其它亲和探针作对照 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 磁性锰尖晶石(MnFe_2O_4):一种新型的亲和探针应用于磷酸化肽富集的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和材料 |
| 3.2.2 MnFe_2O_4 MAMSs材料的合成 |
| 3.2.3 MnFe_2O_4 MAMSs材料的表征 |
| 3.2.4 胰蛋白酶解样的制备 |
| 3.2.5 MnFe_2O_4 MAMSs对pNPP的吸附 |
| 3.2.6 MnFe_2O_4 MAMSs从标准磷酸化蛋白和脱脂牛奶酶解液以及人体血清样中选择性富集磷酸化肽 |
| 3.2.7 MALDI-TOFMS分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 MnFe_2O_4 MMSs的元素组成及其形貌和结构表征 |
| 3.3.2 MnFe_2O_4 MMSs的可能形成机理 |
| 3.3.3 从β-casein胰蛋白酶酶解液中高特异性选择富集磷酸化肽 |
| 3.3.4 从脱脂牛奶胰蛋白酶酶解液和人体血清中特异性选择富集磷酸化肽 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 新型多功能磁性铜锰尖晶石(CuFeMnO_4)亲和探针分别对低丰度肽和磷酸化肽的富集研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 CuFeMnO_4 NSAP的合成 |
| 4.2.3 制备蛋白质的胰蛋白酶酶解液 |
| 4.2.4 从蛋白质的胰蛋白酶酶解液中分别富集磷酸化肽/低丰度肽 |
| 4.2.5 MALDI-TOF质谱分析条件 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 CuFeMnO_4NSAP的制备和性质表征 |
| 4.3.2 形成CuFeMnO_4 NSAP的可能机制 |
| 4.3.3 对来自不同样品中低丰度肽的富集 |
| 4.3.4 对来自不同样品中磷酸化肽的高度特异性富集 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二篇 基于新型稀土基磁性亲和探针的设计及应用 |
| 第五章 新型核壳结构Fe_3O_4@LuPO_4磁球选择性富集及鉴定磷酸化肽段 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 制备Fe_3O_4@LuPO_4微球 |
| 5.2.3 制备蛋白质的胰蛋白酶酶解液 |
| 5.2.4 磷酸化肽的富集 |
| 5.2.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析 |
| 5.2.6 数据库搜索和数据分析 |
| 5.2.7 表征 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 Fe_3O_4@LuPO_4微球形态和结构的表征 |
| 5.3.2 Fe_3O_4@LuPO_4微球的磁性 |
| 5.3.3 Fe_3O_4@LuPO_4微球选择性富集,分离和鉴定磷酸化肽 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 两种新型的Ce基亲和探针纳米复合材料应用组合策略选择性富集单/多磷酸化肽的质谱分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 材料和试剂 |
| 6.2.2 样品制备 |
| 6.2.3 从混合标准蛋白(α-/β-酪蛋白)和脱脂牛奶样胰蛋白酶酶解液及人血清中选择性富集磷酸化肽 |
| 6.2.4 MALDI-TOF MS分析 |
| 6.2.5 材料的表征 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 两种Ce基亲和探针的合成及形貌、结构和性质表征 |
| 6.3.2 材料的可能形成机理 |
| 6.3.3 从混合标准磷酸化蛋白中选择性富集磷酸化肽 |
| 6.4 结论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）水牛生殖细胞蛋白质组表达谱构建和定量差异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 生殖细胞发育的蛋白质组学研究综述 |
| 1.1 蛋白质组学研究概况 |
| 1.1.1 蛋白质组学技术 |
| 1.1.2 蛋白质组定量分析方法 |
| 1.1.3 磷酸化蛋白质组学 |
| 1.2 哺乳动物精子发育及蛋白质组研究进展 |
| 1.2.1 精子发生的过程 |
| 1.2.2 精子发生的调控 |
| 1.2.3 影响精子活力的因素 |
| 1.2.4 精子和精浆蛋白质组的研究进展 |
| 1.3 哺乳动物卵母细胞的成熟和蛋白质组学研究进展 |
| 1.3.1 卵母细胞成熟过程 |
| 1.3.2 卵母细胞减数分裂成熟 |
| 1.3.3 卵母细胞及其微环境的蛋白质组学研究 |
| 1.4 本课题的目的、研究意义和技术路线 |
| 第二章 水牛生殖细胞蛋白质组表达谱的构建和分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 蛋白质样品制备 |
| 2.1.3 FASP酶切 |
| 2.1.4 液相色谱分离和质谱鉴定 |
| 2.1.5 数据库检索和生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 液相分离和数据采集 |
| 2.2.2 蛋白质组的理化性质和分布统计 |
| 2.2.3 蛋白质组的韦恩分析 |
| 2.2.4 高丰度蛋白质分析 |
| 2.2.5 生殖细胞蛋白质组的Gene Ontology (GO)分析 |
| 2.2.6 生殖细胞中功能蛋白质的挖掘 |
| 2.2.7 水牛生殖细胞蛋白质组数据库的构建 |
| 2.2.8 信号通路分析 |
| 2.2.9 蛋白质相互作用网络 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 生殖细胞蛋白质组数据集的文献比较分析 |
| 2.3.2 表达谱的重要功能蛋白质分析 |
| 2.3.3 与生殖细胞发育有关的重要信号通路 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 水牛高、低活力精子差异蛋白质和磷酸化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 Percoll分离 |
| 3.1.3 蛋白质样本制备和TMT标记 |
| 3.1.4 液相色谱预分离和on-line LC-MS/MS分析 |
| 3.1.5 磷酸化肽富集和质谱分析 |
| 3.1.6 Western blot分析 |
| 3.1.7 RT-qPCR验证 |
| 3.1.8 数据处理与统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 高、低活力精子的Percoll分离结果 |
| 3.2.2 多维液相色谱分离 |
| 3.2.3 质量控制和差异蛋白质筛选 |
| 3.2.4 差异表达蛋白质(DEPs)分析 |
| 3.2.5 Western blot分析和qPCR验证 |
| 3.2.6 精子磷酸化蛋白质分析 |
| 3.2.7 磷酸化修饰位点差异分析 |
| 3.2.8 差异表达蛋白质、磷酸化蛋白质的互作网络 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 蛋白质定量分析和磷酸化富集策略 |
| 3.3.2 差异蛋白质的MGI生殖表型 |
| 3.3.3 低活力精子的核染色质异常 |
| 3.3.4 低活力精子中线粒体能量代谢水平降低和氧化压力 |
| 3.3.5 低活力精子尾部结构蛋白质与运动能力关系 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 水牛成熟培养前后卵母细胞的蛋白质定量分析和转录组差异分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 卵母细胞成熟培养 |
| 4.1.3 蛋白质提取 |
| 4.1.4 定量蛋白质组分析 |
| 4.1.5 转录组测序分析 |
| 4.1.6 转录组数据评估和处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 卵母细胞蛋白质的LC-MS分离 |
| 4.2.2 差异蛋白质组定量结果 |
| 4.2.3 卵母细胞成熟培养前后的转录组分析 |
| 4.2.4 成熟前后的差异表达基因(DEGs)筛选 |
| 4.2.5 差异表达基因的COG分析和通路分析 |
| 4.2.6 蛋白质组与转录组的关联分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 卵母细胞的转录组数据分析 |
| 4.3.2 卵母细胞成熟过程的蛋白质变化 |
| 4.3.3 多组学关联分析 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结和研究展望 |
| 附录 |
| 附表1 主要缩略词对照 |
| 附表2 水牛精子蛋白质表达谱在KEGG数据库中富集到的代谢通路 |
| 附表3 水牛精浆蛋白质表达谱在KEGG数据库中富集到的代谢通路 |
| 附表4 水牛卵母细胞蛋白质表达谱在KEGG数据库中富集到的代谢通路 |
| 附表5 水牛卵泡液蛋白质在KEGG数据库中富集到的代谢通路 |
| 附表6 与精子活力有关的差异蛋白质信息 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）功能化磁性纳米材料的制备及其在蛋白质组学中的应用方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质组学分离分析方法 |
| 1.1.1 二维凝胶电泳技术 |
| 1.1.2 多维液相色谱技术 |
| 1.1.3 毛细管电泳及相关技术 |
| 1.2 磷酸化肽段富集分离策略的研究进展 |
| 1.2.1 离子交换色谱富集法 |
| 1.2.2 固定金属离子亲和色谱法 |
| 1.2.3 金属氧化物富集法 |
| 1.3 固定化酶在蛋白质组学中的应用与进展 |
| 1.4 功能化磁性纳米材料在蛋白质组学样品前处理中的应用与进展 |
| 1.4.1 基于功能化磁性纳米材料的磷酸化蛋白/肽段富集策略 |
| 1.4.2 基于功能化磁性纳米材料的新型固定化酶反应器 |
| 1.5 金属有机框架材料的研究进展 |
| 1.5.1 MOFs材料的特点 |
| 1.5.2 MOFs材料的主要类型 |
| 1.5.3 MOFs材料的应用 |
| 1.5.4 复合MOFs材料的应用 |
| 1.5.5 MOFs材料在蛋白质组学中的应用 |
| 1.5.6 结语与展望 |
| 第2章 固载混合镧系金属的磁性纳米材料的合成及其在磷酸肽富集中的应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 磁性纳米材料Fe_3O_4@TCPP-DOTA-M~(3+)的合成和表征 |
| 2.2.4 标准蛋白酶切产物的制备 |
| 2.2.5 Hela细胞蛋白酶切产物的制备 |
| 2.2.6 高pH反相色谱分离肽段混合物 |
| 2.2.7 磷酸肽富集 |
| 2.2.8 质谱检测及数据分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 固载混合镧系金属的磁性纳米材料的制备与表征 |
| 2.3.2 固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽效果考察 |
| 2.3.3 固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽的灵敏度考察 |
| 2.3.4 固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽选择性考察 |
| 2.3.5 固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料使用重复性考察 |
| 2.3.6 固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料用于HeLa细胞蛋白酶切产物磷酸肽的富集 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 固载不同金属离子的磁性纳米材料的合成及其在磷酸肽富集中的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 磁性纳米材料Fe_3O_4@TCPP-DOTA-Ms的合成和表征 |
| 3.2.4 标准蛋白酶切产物的制备 |
| 3.2.5 Hela细胞蛋白酶切产物的制备 |
| 3.2.6 磷酸肽富集 |
| 3.2.7 质谱检测及数据分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 固载不同金属离子的磁性纳米材料的制备与表征 |
| 3.3.2 固载不同金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽效果考察 |
| 3.3.3 固载不同金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽的灵敏度考察 |
| 3.3.4 固载不同金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽的使用重复性考察 |
| 3.3.5 固载不同金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽的特异性考察 |
| 3.3.6 固载不同金属离子的磁性纳米材料用于HeLa细胞蛋白酶切产物全磷酸肽的富集 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于磁性MOFs材料的新型固定化酶的制备及其用于蛋白质的快速酶 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 磁性MOFs材料Fe_3O_4@DOTA-ZIF-90的制备和表征 |
| 4.2.4 基于磁性MOFs材料Fe_3O_4@DOTA-ZIF-90的固定化酶反应器的制备 |
| 4.2.5 磁性MOFs材料Fe_3O_4@DOTA-ZIF-90的表征 |
| 4.2.6 蛋白样品的制备 |
| 4.2.7 蛋白样品经固定化酶Fe_3O_4@ DOTA-ZIF90tyrpsin酶切或溶液酶切 |
| 4.2.8 质谱检测和数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 磁性MOFs材料Fe_3O_4@ DOTA-ZIF-90的制备和表征 |
| 4.3.2 固定化酶Fe_3O_4@ DOTA-ZIF90trypsin的制备 |
| 4.3.3 Fe_3O_4@ DOTA-ZIF90trypsin酶切标准蛋白BSA的效率考察 |
| 4.3.4 Fe_3O_4@ DOTA-ZIF90trypsin用于小鼠卵母细胞蛋白样品的快速酶解 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）磷酸化蛋白质组学技术的发展及其在环境毒理研究中的应用（论文提纲范文）
| 1 引言( Introduction) |
| 2磷酸化蛋白质组学的研究内容和分析策略(Research contents and analytical strategy of phosphoproteomics) |
| 2. 1 磷酸化肽段的富集 |
| 2.1.1抗体富集法 |
| 2.1.2 IMAC富集法 |
| 2.1.3 MOAC富集法 |
| 2.1.4化学修饰法 |
| 2.1.5基于色谱技术的分离富集 |
| 2. 2 磷酸化蛋白的鉴定和磷酸化位点的预测 |
| 2.2.1撞诱导解离(collision induced dissociation,CID) |
| 2.2.2电子捕获解离(electron capturedissociation,ECD) |
| 2.2.3电子转运解离(electrontransfer dissociation,ETD) |
| 2. 3 定量磷酸化蛋白质组学研究 |
| 2.3.1基于凝胶的定量技术 |
| 2. 3. 2 基于质谱的定量技术 |
| ( 1) 代谢标记技术 |
| ( 2) 化学标记技术 |
| ( 3) 无标记定量技术 |
| 3磷酸化蛋白质组学在环境毒理研究中的应用(Applications of phosphoproteomic technologies in environmental toxicology) |
| 3. 1 离体( in vitro)实验 |
| 3. 2 活体( in vivo) 实验 |
| 3. 3 磷酸化蛋白质组学技术在毒性作用通路分析中的应用 |
| 4 展望( Future prospects) |
| 术语表( Abbreviations) |
四、磷酸化肽段质量数的分布特征（论文参考文献）
- [1]黄酒酵母的蛋白组学及CRISPR基因编辑研究[D]. 徐雯. 浙江工商大学, 2021(12)
- [2]UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究[D]. 钟卓珩. 浙江大学, 2021(01)
- [3]IL-1Ra保护ConA诱导肝细胞凋亡的分子机制研究[D]. 杨卓一. 上海交通大学, 2020(01)
- [4]基于定量蛋白质组学数据的质谱仪性能评价研究[D]. 占冬冬. 华东师范大学, 2019(06)
- [5]PD-1/PD-L1免疫抑制轴激活外周T细胞淋巴瘤胞内癌基因信号通路的探索及其对患者预后影响的初步研究[D]. 刘璐. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]基于质谱技术的蛋白质翻译后修饰研究[D]. 马敏. 天津大学, 2017(06)
- [7]新型磁性亲和纳米探针的制备及其在磷酸化蛋白/多肽分离富集中的应用[D]. 龙星宇. 南京大学, 2017(03)
- [8]水牛生殖细胞蛋白质组表达谱构建和定量差异分析[D]. 付强. 广西大学, 2016(12)
- [9]功能化磁性纳米材料的制备及其在蛋白质组学中的应用方法研究[D]. 翟睿. 北京工业大学, 2016(02)
- [10]磷酸化蛋白质组学技术的发展及其在环境毒理研究中的应用[J]. 梁雪芳,赵吉,查金苗,王子健. 环境科学学报, 2016(02)