一、原发性肝癌免疫治疗及基因治疗现状（论文文献综述）
贺凡[1]（2020）在《基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制》文中进行了进一步梳理研究背景肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,因其恶性度高、预后差,目前对肝癌的诊治仍存在巨大挑战,随着分子免疫学研究的进展,对肝癌的治疗有了新的补充,但仍然存在应答率低、疗效欠佳的困境,中医药目前在肝癌的治疗中显示出一定的优势,在肿瘤治疗中的地位也越来越突出,但同时存在药物成分复杂、机制不明等问题。基于此,寻找敏感度高、特异性强的与肝癌的发病有密切联系的生物分子标记物的需求十分迫切。研究目的参桃软肝方（STR）是导师周岱翰教授的经验方,具有健脾养肝、软坚消症之效,临床运用数十载,取得了较好疗效,但因中药成分复杂,药效机制尚不明确,限制了其在临床的推广应用。本研究旨在通过网络药理学的方法对STR的成分及作用乙肝相关性肝癌（HBV-HCC）的靶点进行筛选,建立“药物-活性成分-关键靶点-通路”网络关系图,并通过体外细胞及动物实验,观察STR抑制肝癌细胞株及抑制裸鼠皮下移植瘤模型的疗效,进一步通过高通量测序技术综合分析筛选STR可能的作用靶点和机制,并进行生物信息学验证以确定STR治疗HBV-HCC的潜在靶点及可能的作用机制。研究方法1.通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）对STR中的组成药物进行检索从而获取其化学成分,根据口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和类药性（drug likeness,DL）≥0.18作为条件筛选候选化合物,同时结合STR质谱分析的结果得到中药的潜在化合物,将其所对应的靶点基因与GEO数据库筛选出来的HBV-HCC相关的靶点基因进行配对后,获得STR和HBV-HCC两者共同拥有的关键靶点,即为STR作用HBV-HCC的潜在靶点。利用R软件中“cluster Profiler”安装包对其进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建“中药-化学成分-关键靶点-通路”网络关系图。2.采用MTT法观察STR对人肝癌细胞株Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H增殖作用的影响,采用细胞划痕及Transwell实验观察STR对三株人肝癌细胞株的迁移能力的影响。3.建立人肝癌细胞株Hep G2.2.15裸鼠皮下成瘤模型,待瘤体积达100-200mm3时将其随机分为五组,即STR低、中、高剂量组,阴性对照组,阳性药对照组,分别进行灌胃,每天一次,连续给药25天,记录裸鼠状态、生长情况,测量瘤体积及裸鼠体重。最后一天给药结束,眼球取血,剥离瘤体,测量瘤重,进行统计学分析,取肝肾组织,HE染色观察肝肾形态学改变。4.取STR给药组和阴性对照组各3个肿瘤组织样本进行转录组学测序（RNA-seq）,通过文库构建、数据过滤及基因差异表达分析,筛选出差异表达基因（DEGs）,并以火山图、聚类热图形式表现,并进行GO功能注释和KEGG信号通路富集。取STR给药组和阴性对照组各3个肿瘤组织样本进行全基因组亚硫酸氢盐甲基化测序（WGBS）,通过文库构建、数据过滤及差异甲基化表达分析,筛选出差异甲基化区域及其对应基因,与转录组测序得到的DEGs重叠取交集。5.选取临床HBV-HCC病人8例癌组织与癌旁组织行WGBS,筛选差异甲基化区域（DMRs）相关基因,并将其与动物样本测序结果进行关联分析,寻找共同的差异甲基化基因,并进行GO与KEGG分析。6.通过Cytoscape软件将STRING构建的PPI网络进行可视化,并用拓扑分析进行核心基因筛选。将筛选出的核心基因通过c Bio Portal数据库中关联TCGA数据库对其进行突变谱分析,m RNA表达水平与甲基化状态的相关性分析;通过GEPIA数据库检验核心基因的m RNA表达水平及总生存期（OS）、无病生存期（DFS）的预后分析;通过人类蛋白质图谱（HPA）数据库验证核心基因的蛋白质表达水平的验证。研究结果1.通过TCMSP平台数据库检索西洋参、桃仁、大黄、丹参、当归、仙鹤草六种药物,以OB≥30%和DL≥0.18为条件进一步筛选,并通过质谱分析的结果,总共得到STR潜在化合物125个,删除重复靶点后得到437个蛋白靶点基因。通过GEO数据库筛选出HBV相关的HCC数据库GSE121248基因芯片数据,筛选出HBV-HCC的DEGs 888个。将STR药物预测的靶点与GEO数据库筛选出的DEGs进行配对,发现51个共同靶点基因,GO富集在971个条目中,KGEE通路富集分析显示靶点基因共富集了33条通路,其中与代谢相关的通路有酪氨酸代谢、细胞色素P450对外源性药物代谢的影响、视黄醇代谢通路;与炎症相关IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样信号通路、松弛素信号通路等;与细胞周期相关的通路有细胞衰老、细胞周期、凋亡、p53信号通路等;与激素调节有关的雌激素信号通路、卵巢类固醇生成等;与血管生成有关的通路有VEGF信号通路,另外,还有广泛参与细胞生物学行为的PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等。2.细胞实验表明,STR能够抑制人肝癌细胞株Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H的增殖,并呈时间和剂量依赖性。划痕实验表明,STR能够抑制Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H细胞的迁移能力,统计学结果见显着性差异（Hep G2.2.15 12h及24h划痕P<0.05,Hep G2 24h划痕P<0.05,MHCC97-H 12h及24h划痕P<0.05）。Transwell实验表明,STR能够抑制Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H细胞株的迁移,统计学结果提示STR低、中、高剂量组与对照组比较有显着性差异（P<0.05）。3.动物实验表明,STR组的瘤体积和瘤重都较阴性对照组小,其中STR中、高剂量组与对照组比较,结果具有显着性差异（P<0.05）。说明STR能够抑制荷Hep G2.2.15肝癌裸鼠肿瘤的生长。4.荷瘤裸鼠肿瘤组织样本转录组测序得到有效差异表达的m RNA 221个,其中上调185个,下调36个。GO功能注释GO分析显示这些差异基因主要参与的生物学过程（biological process,BP）有蛋白质糖基化（protein glycosylation）、激素的分泌调节（regulation of hormone secretion）、不饱和脂肪酸代谢（unsaturated fatty acid metabolic process）,细胞基质粘附（cell-substrate adhesion）、先天免疫反应激活细胞表面受体信号通路（innate immune response activating cell surface receptor signaling pathway）等463个过程;细胞组分（cell component,CC）结果分析显示与高尔基体腔（Golgi lumen）、含胶原细胞外基质（collagen-containing extracellular matrix）、肌节（sarcomere）、肌原纤维（myofibril）等55个条目;分子功能分析（molecularfunction,MF）结果表明,这些基因主要与细胞外基质结构成分（extracellular matrix structural constituent）、钙依赖性磷脂绑定（calcium-dependent phospholipid binding）、溶血磷脂酶的活动（lysophospholipase activity）等51个功能有关。此外,KEGG通路富集分析发现,这些差异表达基因与PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TGF-β信号通路、谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）等通路有关。5.对荷瘤裸鼠STR治疗组瘤组织和对照组瘤组织进行WGBS检测,共得到DMRs 80510个,DMRs长度共8056280,共筛选出8986个基因。其中启动子区域异常甲基化基因3760个,高甲基化基因1600个,低甲基化基因2160个。将其与转录组测序筛选的m RNA与WGBS筛选出的差异甲基化基因进行重叠取交集,得到甲基化水平与差异表达基因呈负相关关系的重叠基因151个,GO富集了499个条目,KEGG分析显示与12条通路密切相关。6.临床HBV-HCC首次术后标本WGBS分析与动物测序筛选的差异甲基化基因取交集,得到146个共同的差异甲基化基因,通过拓扑分析,最终筛选到了10个与肝癌密切相关的基因,即CD44、LGALS3、ACTA1、LCN2、MUC1、IGFBP3、HAMP、IRS2、PDK4、BDKRB2。结合现有研究及通过外部数据库验证发现,Hub基因中CD44、LGALS3、LCN2、MUC1、IRS2、BDKRB2具有致癌作用,IGFBP3、HAMP、PDK4为抑癌基因,ACTA1作为抑癌因子尚存争议。测序结果提示STR抑制了癌基因LCN2的表达及上调抑癌基因IGFBP3、HAMP、PDK4的表达。人与动物测序共同的到的差异甲基化基因富集分析显示GO富集了509个条目,KEGG富集了13条信号通路,包括与I肝II纤维化密切相关的ECM-受体互作通路,与炎症相关的IL-17信号通路、松弛素信号通路、TGF-β信号通路、补体凝血级联通路,与代谢相关的脂质调节、外源性物质细胞色素P450代谢、蛋白质的消化吸收等途径,以及广泛参与肿瘤生物学调控的PI3K-AKT信号通路、c AMP信号通路等。研究结论本研究通过高通量分子测序揭示了一系列STR作用下的异常甲基化修饰的差异表达基因及通路,为阐述肝癌的诊疗提供新的思路。我们在经STR处理荷瘤裸鼠肝癌组织与对照组肝癌组织中发现了部分癌基因与抑癌基因,其中CD44、LGALS3、LCN2、MUC1、IRS2、BDKRB2具有致癌作用被认为是有致癌活性的,IGFBP3、HAMP、PDK4被认为是抑癌基因,以上基因的表达水平与甲基化状态均呈负相关关系。STR可能通过抑制LCN2的表达及上调IGFBP3、HAMP、PDK4的表达而发挥抗肝癌作用,可能作为STR抗HBV-HCC的潜在靶点。与通过网络药理学方法筛选得到的靶点及通路进行对比,发现有PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路、外源性物质细胞色素P450代谢等共同作用的通路,提示STR可能通过影响这些通路进而发挥抗肿瘤作用。
潘猛[2]（2020）在《延边地区朝、汉族原发性肝癌患者的临床特征比较》文中研究指明目的:回顾性分析朝鲜族和汉族原发性肝癌患者的临床特征,探讨民族差异性对原发性肝癌发生、发展的意义,为制定本地区原发性肝癌防控措施提供有效的科学依据。方法:收集2013年10月至2018年10月期间在延边大学附属医院住院的患者共397例,资料完整并符合标准而进入统计分析351例,主要分为肝癌组179例（原发性肝癌患者）和非肝癌组172例（包括肝硬化以及慢性肝病患者）,并通过延边大学附属医院电子病历管理系统收集两组患者的临床资料（包括患者的基本资料,如年龄、性别、民族、高血压病史、糖尿病病史,实验室化验指标以及影像学检查）,采用SPSS26.0软件进行统计学分析。结果:1.肝癌组179例患者中,朝鲜族123人,汉族56人,朝鲜族诊断年龄年龄为61.34±9.04岁,男性所占比值62.6%,汉族诊断年龄为58.48 ± 10.10岁,男性所占比值62.5%;本研究肝癌组在年龄、性别上民族间无显着差异（P>0.05）;非肝癌组172例患者中,朝鲜族67人,汉族105人,朝鲜族诊断年龄为63.06±9.61岁,男性所占比值40.3%,汉族诊断年龄为55.78±11.53岁,男性所占比值57.1%;朝鲜族的诊断年龄高于汉族,朝鲜族的男性所占比值低于汉族（P<0.05）;2.肝癌组中朝鲜族的高血压史所占比值低于汉族,糖尿病史所占比值高于汉族（P<0.05）;非肝癌组中朝鲜族吸烟史占比低于汉族（P<0.05）;3.两组患者中朝鲜族HCV感染率均高于汉族,汉族HBV感染率均高于朝鲜族（P<0.05）;4.两组患者的实验室检查指标分别比较:肝癌组中朝鲜族的ALB、PA和GLU水平均高于汉族,而TBIL、GP73水平低于汉族（P<0.05）;非肝癌组中朝鲜族的ALT、AST、GGT、TBA、GP73和sAXL水平均高于汉族（P<0.05）。5.肝癌组中在Child-Pugh分级中,朝鲜族中的A级构成所占比值为82.9%,高于汉族（P<0.05）;在肝癌分期、肿瘤大小上民族间无差异（P>0.05）。结论:1.原发性肝癌组中朝鲜族人数明显多于汉族,反而非肝癌组中朝鲜族人数明显少于汉族;无论是非肝癌组还是肝癌组中朝鲜族诊断年龄均高于汉族。2.原发性肝癌组中朝汉族之间性别、年龄无差异,但是整体男性所占比例明显高于女性。3.原发性肝癌朝鲜族患者以HCV感染为主,汉族以HBV感染为主。4.原发性肝癌朝鲜族患者高血压病史所占比例低于汉族,糖尿病病史、Child-Pugh分级A级所占比例高于汉族。5.原发性肝癌朝鲜族患者ALB、PA和GLU水平高于汉族,TBIL、GP73水平低于汉族。
罗飞凤[3]（2020）在《基于网络药理学研究人参皂苷治疗中晚期原发性肝癌的作用机制》文中研究说明目的:运用网络药理学的方法,研究人参皂苷治疗中晚期原发性肝癌的潜在靶点和作用机制。方法:使用TCMSP、Drug Bank、BATMAN-TCM数据库及平台和Pharm Mapper服务器,检索并收集人参中药化学成分、潜在作用靶点,并通过CTD、数据库获取原发性肝癌的相关靶蛋白,进而筛选出人参活性成分与原发性肝癌的共享基因。利用Cytoscape软件构建的“药物成分-疾病靶点”网络关系图。通过DAVID数据库进行基因和KOBAS软件对靶标进行基因本体（GO）功能富集分析和KEGG通路分析。结果:共收集到人参皂苷药物活性成分共167个,预测靶点共194个以及原发性肝癌靶点32285个;网络分析显示关键靶蛋白有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、胰岛素样生长因子（INS）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）以及TP53等;药物成分-疾病靶点网络图显示CCND1、CASP8、AKT1、TNF、IL6、TP53、INS、EGFR等靶点排名靠前;Pathways in cancer（癌症信号通路）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt信号通路）、Hepatitis B（乙型病毒性肝炎信号通路）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并发症年龄相关信号通路）和Measles（麻疹信号通路）是主要生物途径。结论:人参皂苷可能通过抑制细胞分裂周期、调节胰岛素代谢、控制炎症反应等方面,发挥多靶点、多通路抑制肝癌细胞生长、促进凋亡的抗肿瘤作用。
王亚梦[4]（2020）在《盐酸安罗替尼治疗晚期原发性肝癌的临床疗效、安全性及预后分析》文中研究说明背景及目的肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是发生于肝细胞内的恶性肿瘤,至少占原发性肝癌（Primary hepatic carcinoma,PHC）的90%;胆管细胞癌是发生于肝内胆管细胞的恶性肿瘤,两者均属于PHC。中国为PHC高发国家,约占世界PHC发生总数的70%,发病率达（145～190）/10万,在恶性肿瘤中居第4位;死亡率约20.37/10万,在恶性肿瘤中居第2位。根据巴塞罗那分期系统,患者出现门静脉癌栓或肝外转移为晚期患者。原发性肝癌发病隐匿,恶性程度高,多数患者确诊时已发展至癌症晚期,失去根治性治疗机会,5年生存率极低。传统的治疗方法迄今并未取得令人满意的效果。上世纪九十年代,分子生物学与肿瘤细胞学迅速发展起来,有着精确的高选择性、低毒性性等优点的抗肿瘤靶向药物越来越多的应用到恶性肿瘤的治疗中。2007年靶向药物索拉非尼的上市,延长了晚期原发性肝癌患者的总生存,开启了 PHC治疗的新纪元,但由于其耐药性、价格昂贵、获益有限、毒性大等特点,探寻新的靶向药物的脚步从未停歇。直至近两年,瑞戈非尼、仑伐替尼、卡博替尼和雷莫芦单抗才相继上市,其疗效进一步证实了分子靶向药物在PHC上的潜在价值,尤其是多靶点药物。盐酸安罗替尼是我国在同类药物索拉非尼基础上改构而成一种新型的多靶点酪氨酸激酶抑制剂,具有抑制肿瘤生长和抗肿瘤血管生成的双重作用。在多种实体瘤的临床研究中展现出了较好的疗效和安全性,已被国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准用于晚期NSCLC、SCLC患者的三线治疗及软组织肉瘤患者的二线治疗,目前正在进行包括肝癌、胃癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤Ⅱ/Ⅲ期临床试验。有研究表明,盐酸安罗替尼可能通过抑制Erk和Akt通路,抑制Bcl-2和Survivin的表达,促进Bax的表达,对HCC可能具有直接的抑制作用;体外研究证实,盐酸安罗替尼对人肝内胆管细胞癌（ICC）细胞系HCCC-9810细胞的转移与侵袭。为了探讨盐酸安罗替尼治疗晚期PHC的临床疗效,我们设计此研究,回顾性分析盐酸安罗替尼治疗晚期肝癌的临床疗效、安全性及预后影响因素。材料与方法本研究纳入了 2018年7月至2019年4月至我院就诊的接受了盐酸安罗替尼治疗的55例晚期原发性肝癌患者,其中肝细胞性肝癌50例（90.9%）,胆管细胞癌5例（9.1%）。前期随访是通过电子病历系统采集患者相关临床资料,分析患者开始治疗及出现疾病进展的日期,同步记录患者的血液学及影像学结果,随时记录患者出现的不良反应。后期随访主要是通过电话随访,重点是对OS的随访、停用盐酸安罗替尼时间及后续治疗等。应用SPSS23.0统计软件处理数据;采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线;采用Cox回归分析分析影响晚期肝癌患者预后的影响因素,将Cox单因素分析中P<0.10的变量纳入多因素Cox回归分析,P<0.05为有统计学差异。结果（1）本研究共纳入55例晚期肝癌患者,其中1线使用盐酸安罗替尼患者42例,2线及以上使用患者为13人,中位总生存时间分别为8.5个月（255.0d）和 2.7 个月（80.0d）（P=0.032）,总体人群 mOS 为 8.3 个月（95%CI:80.5～415.5）。在该研究中纳入晚期HCC患者50例,ICC患者5例,mOS分别为8.3个月（248.0d）和10.6个月（318.0d）（P=0.820）,差异无统计学意义。（2）大多数患者（79.02%）的AEs为轻中度（1-2级）,经对症处理可以好转或耐受,总不良反应发生率为72.73%（40/55）。55例患者最常见不良反应是高血压28例（50.91%）、血小板计数降低16例（29.09%）、乏力23例（21.82%）、关节疼痛10例（18.18%）、白细胞计数降低10例（18.18%）、中性粒细胞绝对值降低10例（18.18%）、腹泻9例（16.36%）、腹胀7例（12.73%）、食欲减退7例（12.73%）、手足综合征6例（10.92%）;≥3级AEs包括高血压7例（12.73%）、血小板计数降低5例（9.09%）、乏力4例（7.27%）、中性粒细胞绝对值降低3例（5.45%）、白细胞计数降低2例（3.64%）、血红蛋白降低2例（3.64%）、腹泻2例（3.64%）、手足综合征1例（1.82%）、关节疼痛1例（1.82%）、腹胀1例（1.82%）、食欲减退1例（1.82%）;研究期间,2例患者因3级高血压剂量下调至10mg,其中1例患者血压仍控制不佳剂量下调至8mg,1例患者因频发腹泻剂量将至10mg,无患者因不能耐受不良反应停药;有1例合并重度食管静脉曲张的HCC患者使用盐酸安罗替尼3天后,出现致死性消化道出血,为非药物相关性死亡。（3）盐酸安罗替尼治疗前的总胆红素（HR=2.012、P=0.001）、白蛋白（HR=1.452、P=0.047）、联合 TACE（HR=1.648、P=0.024）是影响晚期原发性肝癌预后的独立危险因素。结论（1）盐酸安罗替尼治疗晚期原发性肝癌有临床疗效,可以延长患者的总生存,且不良反应可控,耐受性好,为晚期原发性肝癌患者提供了治疗选择。（2）盐酸安罗替尼在既往接受过系统治疗的晚期肝癌患者中获益有限,可根据患者的一般情况、疾病状态、经济状况、个人意愿等综合选择。（3）盐酸安罗替尼治疗前总胆红素（HR=2.012、P=0.001）、白蛋白（HR=1.452、P=0.047）、联合 TACE（HR=1.648、P=0.024）是影响晚期肝癌预后的独立危险因素。
焦红彬[5]（2020）在《AFP在原发性肝癌不同因素分层诊断中的作用研究》文中研究指明目的1通过探讨原发性肝癌不同标准分层的影响因素,以期为原发性肝癌的精准诊断提供参考。2通过检测原发性肝癌不同分层诊断患者的AFP表达水平,以此进一步明确AFP在不同标准分层原发性肝癌中的诊断效率。方法回顾性选取2013年至2019年华北理工大学附属医院初诊为原发性肝癌患者289例为病例组（已通过影像学检查或病理组织学检查确诊并且尚未进行治疗的肝癌患者）,同时选取慢性乙型肝炎患者217例（HBs Ag阳性6个月以上的乙型肝炎患者）和肝硬化患者279例（已通过影像学检查或病理组织学检查确诊的肝硬化患者）为对照组。1根据肝功能Child-Pugh分级、肝硬化临床分期、肝癌大小分型以及BCLC分期等标准分别对原发性肝癌患者进行分层,比较各分层标准下不同组别在肝癌高危因素（年龄、男性、HBV感染、HCV感染、吸烟史、饮酒史、非酒精性脂肪肝、肝硬化）的分布情况;2检测原发性肝癌组、慢性乙型肝炎组及肝硬化组中AFP的表达水平及其诊断阳性率（AFP>400 ng/m L为肝癌的诊断标准）,初步明确血清AFP对于肝癌总体的诊断价值;3检测不同分层标准下原发性肝癌患者AFP的表达水平及其诊断阳性率,进一步明确AFP在不同标准分层原发性肝癌中的诊断价值;4通过ROC曲线分析得出AFP在不同标准分层原发性肝癌中的诊断效率,并筛选出诊断效率较低的原发性肝癌;5 AFP诊断效率较低的原发性肝癌,采用ROC曲线分析AFP、CEA、CA-199和GGT四项指标联合诊断的诊断效能。结果1不同标准分层原发性肝癌的影响因素:1)将肝功能Child-Pugh分级作为分层标准中,不同肝功能Child-Pugh分级原发性肝癌患者吸烟史比率和饮酒史比率差异均具有统计学意义（P均<0.05）;两两比较得出:Child-Pugh C级比ChildPugh A级原发性肝癌患者饮酒史比率显着性升高（P<0.0167）;Child-Pugh C级较Child-Pugh B级原发性肝癌患者吸烟史比率明显升高（P<0.0167）。2)将肝硬化临床分期作为分层标准中,不同肝硬化临床分期原发性肝癌患者感染HBV比率差异具有统计学意义（P<0.05）;两两比较得出合并代偿期和失代偿期肝硬化原发性肝癌患者均比无肝硬化原发性肝癌患者感染HBV比率明显增高（P均<0.0167）。3)将肝癌大小分型作为分层标准中,具有不同体积大小的原发性肝癌患者之间合并肝硬化比率的差异具有统计学意义（P<0.05）;两两比较得出小肝癌患者较巨块型肝癌患者合并肝硬化比率显着性增高（P<0.005）。4)将BCLC分期作为分层标准中,不同BCLC分期原发性肝癌患者感染HBV比率和合并肝硬化比率差异均具有统计学意义（P均<0.05）;两两比较得出:BCLC D期较BCLC A期、BCLC B期和BCLC C期原发性肝癌患者感染HBV比率以及合并肝硬化比率均明显增高（P均<0.0083）。2原发性肝癌组AFP水平和诊断阳性率均明显高于慢性乙型肝炎组和肝硬化组（P分别<0.05和0.0167）。3比较不同分层标准下各组别AFP水平和诊断阳性率得出:1)肝硬化临床分期、肝癌大小分型和BCLC分期作为分层标准下,不同组别之间血清AFP表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。其中代偿期肝硬化和失代偿期肝硬化原发性肝癌患者AFP水平较无肝硬化患者均明显升高（P分别为0.004和0.005均小于0.05）;弥漫型肝癌患者较小肝癌患者AFP水平显着性升高（P=0.007<0.05）;BCLC D期肝癌患者较BCLC A期肝癌患者AFP水平明显增高（P=0.009<0.05）。2)肝硬化临床分期和肝癌大小分型作为分层标准下,不同组别之间诊断阳性率差异具有统计学意义（P<0.05）。其中合并代偿肝硬化原发性肝癌患者较未合并肝硬化患者显着增高（P=0.007<0.0167）;弥散型肝癌患者较小肝癌患者增高（P=0.001<0.005）。4 ROC曲线分析表明:AFP对Child-Pugh A级、B级、C级原发性肝癌,代偿期肝硬化原发性肝癌,失代偿期原发性肝癌,巨块型肝癌,弥散型肝癌以及BCLC B、C、D期原发性肝癌的诊断价值较高（AUC均>0.7）;对小肝癌和BCLC A期肝癌的诊断价值较低（AUC均<0.6,P均>0.05）。5通过ROC曲线分析四项指标联合对于小肝癌和BCLC A期肝癌的诊断价值,得出AFP、CEA、CA-199和GGT四项指标联合较单独一项指标诊断效率均有所提高（AUC为0.810和0.846,P均<0.0001）。结论1 AFP对于肝功能较差的肝癌、中晚期肝癌、体积较大的巨块型肝癌及肿瘤数目较多的弥散型肝癌均具有较高的诊断价值,但是AFP对于小肝癌和早期肝癌的诊断效率较低。2对于小肝癌和早期肝癌,建议采用AFP、CEA、CA-199和GGT四项指标联合诊断来提高其诊断效率。图2幅;表10个;参54篇。
向俊宇[6]（2020）在《肌细胞增强因子MEF2D在肝癌免疫逃逸中的作用和分子机制研究》文中研究说明肝癌是世界上最常见也是致死率最高的癌症类型之一,而现有的靶向治疗手段对其疗效甚微。肌细胞增强因子（myocyte enhancer factor 2,MEF2）作为一个被广泛研究的转录因子家族,其参与并调控肌肉和神经发育过程。值得一提的是,该家族成员中,MEF2D的蛋白结构特异性以及在肿瘤中的作用逐渐被人们关注。MEF2D作为转录因子,其蛋白结构的N端包含一个MADS/MEF2结构域,介导MEF2D自身的二聚化、MEF2D与DNA的结合以及与其他蛋白的相互作用,该结构域在MEF2家族各成员中具有保守性。而MEF2D蛋白的C端则包含多个转录激活结构域,且与MEF2家族其他成员有明显差异。MEF2D在以肝癌为主的多种肿瘤中高表达,并提示疾病的进展和不良预后。具体作用上,MEF2D可以促进肿瘤的生长、侵袭转移和血管化等过程,不仅调控肿瘤细胞自身生物学行为,也影响整个肿瘤微环境。由于炎症相关的发病机制,很多肝癌都具有免疫原性,反映为其微环境中有各种类型的免疫细胞浸润。其中一些免疫细胞,如效应性T细胞介导的抗肿瘤免疫反应可以抑制肝癌的进程。相反,肝癌也利用各种机制进行免疫逃逸。尽管有前期研究关注肝癌细胞MEF2D与肿瘤微环境的相互作用,但是研究中所采用的实验方法,例如体外细胞培养体系或免疫缺陷鼠移植瘤模型,并没有将免疫细胞纳入观察和考虑。此外,MEF2D蛋白的乙酰化修饰可以显着增强其DNA结合能力进而促进其下游多种靶基因的转录激活。包括乙酰基转移酶p300和去乙酰化酶HDAC3在内的多种酶可以调控MEF2D乙酰化。上述研究现状表明,MEF2D及其乙酰化调控机制在肝癌免疫微环境中的作用及定位有待明确。目前,阻断免疫检查点细胞程序性死亡受体1（programmed cell death 1,PD-1）及其配体PD-L1相互作用的免疫疗法在多种肿瘤治疗中被应用,并且展现出令人满意的疗效。但是大多数肝癌患者对该疗法不敏感。前期研究发现PD-1/PD-L1阻断疗法的疗效可能与肿瘤细胞表达PD-L1的水平有关。随后越来越多的证据表明,原本在肝癌细胞中沉默的PD-L1在多种因素的刺激下被激活表达,并促进肝癌免疫逃逸,这些因素包括干扰素γ（interferon gamma,IFNG）,细胞周期相关激酶抑制剂,乙型肝炎病毒以及癌基因MYC等。因此,明确肝癌细胞PD-L1表达的调控机制或上游信号通路,可能为提高靶向PD-L1/PD-1疗法的疗效提供理论和实验基础。PD-L1的表达调控涉及多种机制:细胞内PD-L1蛋白水平会受到蛋白转运机制和蛋白翻译后修饰机制的调控,也会受到基因转录和RNA稳定性调控机制的影响。肿瘤浸润的免疫细胞分泌的IFNG也可以诱导PD-L1表达:肿瘤细胞中IFNG信号通路被激活会显着上调IFN调节因子的表达,进而激活PD-L1基因CD274的转录。但无论是PD-L1的哪种调控机制,在肝癌中都尚未完全阐明。基于上述研究现状,我们试图通过这项研究明确MEF2D能否调控PD-L1等关键效应分子并影响肝癌的免疫逃逸过程,以期为肝癌的临床治疗提供新的策略。本研究的实验设计和结果如下:实验设计:利用流式细胞术分析20例新鲜肝癌组织中MEF2D的表达和免疫细胞浸润及活化情况。利用免疫组化技术观察和分析225例肝癌标本中MEF2D的表达,免疫细胞的浸润情况以及和预后相关性。构建MEF2D肝脏条件性敲除小鼠(MEF2DLPC-KO mice)并在SMMC-7721,Huh7,H22和Hepa1-6等多种人源和鼠源肝癌细胞系中敲除或敲低MEF2D,p300和/或sirtuin 7（SIRT7）等基因的表达,利用RNA测序,Western blot,双荧光素酶报告基因系统以及染色质免疫共沉淀技术在上述组织和细胞中分析基因的表达及调控机制。利用蛋白质免疫共沉淀技术和pull-down实验检测MEF2D乙酰化水平和蛋白之间的相互作用。构建同源野生型小鼠肝脏原位移植瘤模型,系统给予抗体阻断体内T细胞功能或系统给予PD-1单抗治疗,评估移植瘤生长情况和小鼠生存情况,免疫组化和流式细胞术检测瘤内浸润免疫细胞的数量和活化程度。本研究主要的实验结果如下:1.在临床肝癌表本中,我们发现MEF2D的表达与CD4+和CD8+T细胞浸润数量呈负相关,与PD-1阳性或TIM3阳性的CD8+T细胞数量呈现正相关。在H22细胞中敲除MEF2D显着抑制对应移植瘤在同源野生型小鼠,而非免疫缺陷小鼠或抗体抑制CD8+T细胞功能的小鼠体内的生长。同源野生型小鼠体内MEF2D缺失的移植瘤相比对照组,其瘤内浸润的T细胞数量和活化程度增加。2.敲除MEF2D导致肝癌细胞中PD-L1的表达降低。MEF2D可以直接与编码PD-L1蛋白的CD274基因启动子结合并激活基因转录。肝癌细胞中过表达乙酰基转移酶p300或敲除去乙酰化酶SIRT7,可以促进MEF2D的乙酰化进而增强其DNA结合能力和结合位点的组蛋白乙酰化,最终促进CD274基因转录。IFNG可以诱导肝癌细胞表达p300并促进其结合MEF2D,并抑制SIRT7和MEF2D的直接结合。IFNG通过MEF2D影响PD-L1的机制与已知的IRF1/9-PD-L1通路在肝癌细胞中相互独立发挥作用。当没有IFNG刺激肝癌细胞时,SIRT7和MEF2D持续结合并削弱MEF2D乙酰化和PD-L1的表达。3.敲除SIRT7显着抑制肝癌细胞自身增殖和免疫缺陷鼠中移植瘤的生长。但相比对照组,同源野生型小鼠中SIRT7缺失的移植瘤PD-L1表达增加,T细胞的浸润和活化程度降低。在此基础上使用PD-1单抗治疗可以明显抑制移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。本研究主要的结论如下:1.敲除MEF2D可以通过促进CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程抑制肝癌的进展。2.在IFNG的作用下,MEF2D通过直接转录激活CD274基因,增强免疫检查点分子PD-L1的表达进而削弱T细胞介导的抗肿瘤免疫过程。3.乙酰基转移酶p300介导的MEF2D乙酰化过程在IFNG诱导肝癌细胞PD-L1表达的过程中发挥重要作用。4.在缺乏IFNG的情况下,去乙酰化酶SIRT7能直接结合并抑制MEF2D乙酰化,进而抑制肝癌细胞PD-L1的表达。5.SIRT7缺失导致的肝癌细胞免疫逃逸依赖MEF2D-PD-L1通路。6.抑制SIRT7联合PD-1单抗显着抑制肝癌的进展。综上所述,本研究发现肝癌细胞中MEF2D可以促进PD-L1的表达,并进一步抑制CD8+T介导的抗肿瘤免疫反应。当IFNG刺激肝癌细胞时,p300促进MEF2D乙酰化过程,进而促进MEF2D与CD274基因启动子区域结合并上调PD-L1表达。当没有IFNG刺激肝癌细胞时,SIRT7抑制MEF2D乙酰化和PD-L1的表达。由于SIRT7显着促进肝癌细胞自身增殖。因此,相比单一免疫检查点抑制剂,我们提出干预SIRT7联合PD-1/PD-L1单抗可能是更为有效的肝癌治疗策略。
颜培建[7]（2020）在《1.MAML3通过调控ZEB1诱导免疫抵抗型肝癌细胞上皮间质转化 2.MoO2-R837纳米颗粒在肿瘤协同治疗中的应用》文中进行了进一步梳理背景 肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）的发病率以及死亡率均位居世界前列,是最常见的肝脏肿瘤之一,由于肝癌的易复发和转移肝癌的治疗效果不理想,其预后往往不佳。肝NK细胞在肝脏的免疫监视中起着重要作用,NK细胞的耗竭和功能障碍与HCC的发生发展密切相关。并且,随着肝癌的发生发展,逐渐对NK细胞产生免疫抵抗性,从而发生免疫逃逸,更易发生复发转移。大量的研究结果已知,在肝癌发生和发展中,上皮间质转化（EMT）发挥了极其重要的作用。MAML3（mastermind-like 3）是Notch信号传导中的转录调节因子,在细胞发育、增殖和分化等过程中起到重要的作用。有少量研究证实MAML3在癌症细胞的侵袭和转移过程中有重要作用。然而MAML3在肝癌中是否起作用,目前尚未可知。已有很多研究发现ZEB1作为EMT中最为关键的分子之一,能够抑制E-cadheirn蛋白,从而在多种肿瘤中促进EMT发展。目的 本篇研究旨在通过构建经NK细胞长期诱导的免疫抵抗性肝癌细胞（HCC-R）,通过分子生物学的基础研究,阐明MAML3在HCC-R的表达情况及其在肝癌转移和侵袭中的机制,为肝癌免疫抵抗后的治疗提供新的思路。方法我们通过将肝癌细胞与NK细胞长期共培养,诱导产生具有免疫抵抗性的肝癌细胞（HCC-R）,并利用乳酸脱氢酶细胞毒性实验（LDH cytotoxicity assay）验证了HCC-R对NK细胞的耐受性。同时,我们通过CCK-8、Transwell细胞迁移和侵袭实验研究HCC-R在增殖、迁移和侵袭方面的变化。利用qPCR、Western Blot发现HCC-R中的MAML3表达量明显增加,且与EMT标志物E-cadherin有一定关系。最后,我们通过检测敲减MAML3后检测细胞的EMT标志物探究MAML3对HCC-R侵袭转移的影响。结果我们成功构建了 2株免疫抵抗型肝细胞肝癌细胞株,并发现其有更强的转移侵袭能力,并且在敲减MAML3后,这2株免疫抵抗型肝癌细胞株的转移和侵袭能力均明显减弱。结论我们第一次在体外构建了对NK细胞杀伤耐受的免疫抵抗型肝癌细胞株,并发现在免疫抵抗型肝癌细胞中,MAML3可以增强其转移及侵袭的能力。MAML3通过促进ZEB1的表达来抑制E-cadherin,从而导致肝癌的侵袭和转移能力增强。因此,MAML3非常具有成为肝癌治疗的新靶点的潜力。背景肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一,在全世界癌症导致的死亡率中占据第二位,手术切除病灶为目前肝癌的主要治疗手段。由于肝癌发病的隐匿性,部分患者在确诊时已进展至中晚期,常伴有“扩散、转移和免疫抵抗”,手术治疗的效果往往不佳。即便是已行手术治疗的肝癌患者,癌症的复发和转移仍成为其死亡的主要原因。近年来,免疫治疗因其疗效显着,迅速发展成为继手术、放化疗后的新型治疗手段之一,尤其是针对转移瘤,治疗效果独特。免疫检查点阻断治疗在临床癌症治疗中逐渐显现出它的价值。光热疗法（Photothermaltherapy,PTT）可通过外部激光在局部产生高温从而实现肿瘤杀伤作用,避免全身毒性,副作用小,实现局部精准治疗。同时PTT可激活机体免疫反应,联合免疫检查点阻断治疗可提高疗效。纳米技术与新型材料融合,诞生的各种类型的纳米药物载体构建了多功能协同光治疗平台,给包括肝癌在内的癌症的诊治带来了一场全新的变革。目的本研究提出构建多功能纳米载药体系,在PTT杀伤肿瘤的同时调控肿瘤免疫环境,与免疫检查点阻断治疗联合,不同治疗方法之间的协同得以实现,从而有效发挥免疫抗肿瘤效应。方法 我们首先制备了 MoO2-R837纳米材料,利用场发射扫描电子显微镜（FESEM,Hitachi SU-70）和透射电子显微镜（TEM,Tecnai F20,FEI）研究 了材料的微观结构特征。用X射线衍射（XRD,X’pert pro MPD）对纳米材料结构进行了表征。同时,我们构建了免疫抵抗型小鼠肝脏肿瘤细胞（Hep1-6 R）,模拟具有免疫抵抗性的肝癌。通过CCK8细胞增殖试验验证了 MoO2-R837对正常细胞293T、肿瘤细胞Hep1-6 wt、Hep1-6 R都没有毒性,满足进行后续治疗实验的条件。通过体外实验证实近红外（NIR）触发的PTT具有良好的肿瘤细胞杀伤效果,并且通过小鼠肝癌原位成瘤模型构建技术以及双侧皮下肿瘤人工模型的建立研究了 PTT与免疫检查点阻断联合治疗应用对转移瘤的治疗是否有贡献。结果在良好的体外实验结果基础上,我们采用了小鼠肝癌细胞Hep1-6 wt、Hep1-6 R在C57BL/6小鼠上构建肝脏原位成瘤模型及双侧皮下肿瘤模型进行一系列实验。研究发现,所有小鼠的体重都保持在相同的水平,表明MoO2-R837纳米材料在体内不会产生明显的毒性反应。在PTT治疗后,使用MoO2-R837纳米材料的肿瘤体体积迅速缩小,而联合PD-L1免疫检查点阻断治疗的转移瘤体体积亦缩小,且治疗后2周内没有复发现象。结论我们发现MoO2纳米颗粒具有高效率的光热效应,可在808 nm的近红外光照射下,通过光热疗法（PTT）直接杀死小鼠肝癌细胞（Hep1-6 wt）甚至恶性程度更高的Hep1-6 R细胞。其过程中产生肿瘤相关抗原,在免疫佐剂咪喹莫特（R837）的帮助下,可激发强烈的全身抗肿瘤免疫反应,可促进PD-L1免疫检查点阻断治疗,并且该协同疗法对小鼠体内残留的未受照射的远距离肿瘤具有明显的杀伤和抑制作用。
钟裕[8]（2020）在《肝癌免疫微环境中髓系细胞亚群组成及其与肝癌预后的关联研究》文中研究表明肝癌是发病率与致死率较高的实体肿瘤之一,其五年生存率仅有5%-7%且复发率高达60-70%。驱动肝癌的发生发展的因素包括内在因素和外在因素。内在因素指肝实质细胞中发生的突变;而外在因素指肿瘤细胞与周围的基质细胞、免疫系统及非细胞成分的相互作用。对于已经发生突变形成的肿瘤细胞,通过免疫系统或细胞外基质的作用将其清除,从而抑制肿瘤的发展和转移。因此,肿瘤与其外在的环境共同构成肿瘤微环境的相互作用在肿瘤发展、复发及转移中扮演中重要角色。其中,肿瘤浸润免疫细胞及其分泌的细胞因子组成的免疫微环境是影响肿瘤微环境的重要组成部分。由于技术受限,先前对肝癌中复杂的免疫微环境的研究工作大多数是基于大量细胞的水平在原位或经细胞分选后对特定一类细胞进行研究。单细胞测序技术的发展为肿瘤微环境的系统研究提供了有力工具。越来越多的研究表明,免疫微环境中各种免疫细胞以及不同免疫细胞之间的相互作用都影响肿瘤发生和发展,特别在肿瘤的逃逸中也扮演越来越重要的角色。然而目前对于肝癌免疫微环境在单细胞水平的研究,对淋巴细胞类型组成和功能有了初步认识,但肝癌中髓系细胞亚型的特征与肿瘤的作用仍然知之甚少。此外,原发性与复发性肝癌中的免疫微环境之间的异同也尚未知晓。基于肝癌免疫微环境的研究现状,本研究利用单细胞RNA测序和分析技术对6例原发和12例复发肝癌的免疫微环境中免疫细胞组成及其基因表达特征进行鉴定。特别对于髓系细胞,鉴定与肝癌临床表型相关和对肝癌发生发展起到关键作用的细胞亚群。结合免疫组化技术并与公开数据来源的外周血和肿瘤的髓系细胞进行比较分析对鉴定的髓系细胞的组成及功能进行验证。获得以下结果:（1）本研究通过测序并经质控后共获得12,870个CD45+免疫细胞,鉴定了共14个细胞亚型及其特征基因。包括淋巴系的T淋巴细胞、自然杀伤细胞（natural killer,NK）和B淋巴细胞以及髓系的巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAM）、单核细胞和树突状细胞（dendritic cell,DC）等。进一步对髓系细胞进行细胞亚型鉴定获得7个髓系细胞类型及其特征基因。包括TAM,两类单核细胞亚型FCN1＿mono和Mono4以及三个DC亚型DC1、DC2和DC3等。（2）在癌旁组织中有较多CD4+初始/CD8+细胞毒性T细胞和CD160+NK细胞富集,呈现出激活的免疫微环境。而在肿瘤组织中,与免疫调节作用相关的巨噬细胞、调节性T细胞与CD8+耗竭T细胞浸润程度较癌旁高。表明在肿瘤组织中的免疫微环境处于一个免疫抑制且不激活的状态。其中,髓系亚型Mono4在肿瘤组织中富集。对原发与复发性肝癌的细胞组成比较发现,仅DC在复发肝癌中相对较高,特别是DC2亚型,而其他细胞组成在原发与复发肝癌中没有显着差异。表明在复发与原发肝癌中,免疫细胞组成相对较一致。（3）对肝癌微环境与健康人外周血中的DC亚型进行了比较。结果表明,DC1与DC2均存在于外周血与肝癌微环境中,而本研究鉴定的DC3（LAMP3+CCR7+）为肿瘤中新的DC亚型,并在黑色素瘤与头颈癌的公开数据中验证了DC3的存在。肿瘤中的DC细胞具有较高的第二类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex class II,MHC-II）分子表达,且有迁移相关特征。表明在肿瘤中的DC有迁移至肿瘤引流淋巴结或肿瘤中通过MHC-II呈递肿瘤抗原并介导CD4+T细胞活化的功能。此外,本研究发现肿瘤和癌旁中DC1存在不同的募集途径。（4）通过对肝癌微环境中髓系亚型与临床表型的关联分析发现,TAM与FCN1＿mono的高浸润水平均与肝癌组织中的微血管侵犯和高甲胎蛋白水平显着相关。在较高乙肝抗原水平与肿瘤较大的肝癌组织中TAM的浸润水平显着较高。而DC2的高度浸润与肝癌临床中具有较小的肿瘤相关。（5）对各髓系细胞亚型特征与预后的关联分析发现,TAM趋向于M2型极化并在原发性肝癌中指示其不良预后。而两类单核细胞（FCN1＿mono和Mono4）呈现除两种截然不同的免疫功能:FCN1＿mono表达已报道的骨髓来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSC）特征基因,与复发肝癌的二次复发相关;Mono4高表达细胞杀伤性相关基因并与原发肝癌的良好预后相关。三个DC亚型在原发和复发肝癌中均与其良好预后相关。综上所述,本研究通过单细胞RNA-seq对肝癌中髓系细胞亚型及其功能和肝癌的临床表型预后的关联进行了分析和阐述。揭示了肝癌中特有的免疫微环境,鉴定了与临床表型和预后相关的细胞亚型,为未来肝癌的临床诊疗提供潜在的治疗靶点和预后预测指标。
余令兵[9]（2020）在《N-（5-芳苄叉基绕丹宁）环丙沙星酰胺衍生物对人肝癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响》文中研究表明目的:研究N-（5-对氟苄叉基绕丹宁）环丙沙星酰胺衍生物1-环丙基-6-氟-7-（4-甲基-哌嗪-1-基）--N-（5-对氟苄叉基-绕丹宁-3-基）-喹啉-4-（1H）-酮-3-甲酰胺（HGQ-15）对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡和自噬的影响,探讨自噬与凋亡的关系。方法:分别用0.625?mol/L、1.25?mol/L、2.5?mol/L、5?mol/L、10?mol/L的HGQ-15处理SMMC-7721细胞24 h、48 h和72 h（对照组用0?mol/L HGQ-15处理）,采用MTT（四甲基偶氮唑蓝）法检测HGQ-15对细胞增殖的抑制作用;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法和TUNEL法检测细胞凋亡率;使用Beclin-1基因沉默方法及自噬抑制剂氯喹验证自噬在HGQ-15影响细胞增殖和凋亡中的作用;间接免疫荧光法检测细胞自噬标志性蛋白LC3的表达量;免疫印迹法观察LC3Ⅰ/LC3Ⅱ表达量与比值的变化。结果:用不同浓度HGQ-15分别处理SMMC-7721细胞24、48和72h,对SMMC-7721细胞增殖有显着抑制作用（P<0.05,P<0.01）,呈浓度、时间依赖关系,24h、48h和72h的IC50值分别为4.531μmol/L（r2=0.8742）、4.063μmol/L（r2=0.8573）和3.894μmol/L（r2=0.9590）。用0、1.25和2.5μmol/L的HGQ-15处理SMMC-7721细胞24 h,细胞凋亡率分别为3.01%、35.68%和57.28%;与对照组（0μmol/L）比较,HGQ-15处理组的细胞凋亡率显着增高,差别有统计学意义（P<0.01）。应用间接免疫荧光方法观察细胞质中的自噬标志物LC3的表达,结果显示,HGQ-15处理SMMC-7721细胞24h,细胞质LC3荧光亮点显着增加;免疫印迹实验结果显示,用HGQ-15处理SMMC-7721细胞后,细胞的LC3-Ⅱ蛋白表达量增加,说明HGQ-15诱导SMMC-7721细胞发生自噬。使用Beclin-1 siRNA处理SMMC-7721细胞24h,Beclin1 mRNA的表达量显着降低,细胞质内的LC3表达量明显减少,说明Beclin-1基因沉默能显着抑制细胞自噬。单独使用Beclin-1 siRNA对SMMC-7721细胞增殖和凋亡率的影响不明显,而与HGQ-15共同处理可明显降低细胞增殖率（P<0.01）并增加细胞凋亡率（P<0.05）。单独使用自噬抑制剂氯喹（62.5μmol/L）也对SMMC-7721细胞增殖和凋亡率的影响不明显,但能增强HGQ-15对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用,并提高HGQ-15诱导的细胞凋亡率。结论:1.N-（5-芳苄叉基绕丹宁）氟喹诺酮类衍生物（HGQ-15）显着诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡。2.HGQ-15诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中也诱导自噬的发生。3.HGQ-15诱导的自噬对SMMC-7721细胞具有保护作用,能显着降低HGQ-15所致的SMMC-7721细胞凋亡率。
蒋广宜[10]（2020）在《雄激素受体通过调节肝细胞肝癌PD-L1表达影响肝癌免疫检查点治疗》文中提出原发性肝细胞肝癌（HCC）是世界上第六大常见肿瘤,肝癌的发生发展与许多因素相关,例如:病毒性肝炎,肝硬化,长期暴露在致癌环境中和其他原因导致的慢性肝损等等。缺乏有效的治疗手段是肝癌预后较差的一个主要原因。近年来,肿瘤的免疫治疗成为热点研究,同时研究发现肝癌的性别差异与雄激素受体（AR）有关。研究目的:本篇研究通过分子生物学基础研究,阐明AR基因在肝细胞肝癌的发生发展过程中对肝癌的免疫微环境状态的影响,以及其作用的分子机制。同时针对HCC进行免疫治疗时,探究AR及雄激素对肝癌免疫治疗的影响,并寻找潜在的免疫治疗方案。研究方法:我们利用共培养实验,表面分子结合试验,细胞杀伤试验和流式胞内因子检测试验探究HCC细胞差异表达AR对T细胞功能的影响。随后利用RT-q PCR对差异表达AR的肝癌细胞株进行表面免疫检查点测定并确定目标靶点,随后通过蛋白印迹,流式细胞术实验和免疫组化对靶点进行验证。通过细胞去势实验,荧光素酶报告基因试验和CHIP试验探究AR对HCC免疫微环境调控的分子机制。我们利用临床肝癌患者标本进行免疫组化染色探究体内AR与免疫检查点表达的相关性,并通过小鼠原位成瘤的动物模型试验探究AR对于免疫检查点治疗的影响。研究结果:实验结果证实,肝癌细胞中的AR可以通过抑制免疫检查点PD-L1表达从而引起T细胞的功能改变并影响细胞毒效应。在HCC细胞系中,雄激素受体AR与PD-L1的表达呈负相关性。过表达AR通过结合PD-L1的启动子区域来抑制PD-L1的表达。免疫组化证实在临床标本中也存在AR与PD-L1的负相关性。动物实验证实雄激素可以通过AR协同作用调节PD-L1单抗的治疗作用。研究结论:肝癌作为一种存在性别差异的恶性肿瘤,目前针对进展期的肝癌还缺乏特效的治疗方法。免疫治疗作为一种兴起的治疗方法目前正在广泛应用,影响肝癌性别差异的关键分子AR通过调节细胞的免疫检查点来干扰T细胞对肝癌细胞的免疫监视作用和杀伤功能。在体内肿瘤AR的高表达及血清高雄激素分泌会降低PD-L1单抗的药物敏感性。这些证据提示在未来肝癌免疫治疗中,雄激素及雄激素受体或许可以成为预测抗PD-L1治疗的预测因子。雄激素受体抑制剂与PD-L1单抗联用或许会成为治疗肝癌的有效免疫治疗。
二、原发性肝癌免疫治疗及基因治疗现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原发性肝癌免疫治疗及基因治疗现状（论文提纲范文）
（1）基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 肝癌的流行病学研究 |
| 1.2 肝癌的西医治疗现状 |
| 1.3 中医对肝癌的认识及诊疗进展 |
| 1.3.1 中医治疗肝癌的历史沿革 |
| 1.3.2 当代肿瘤学家对肝癌的认识 |
| 1.3.3 中西医结合治疗肝癌的研究进展 |
| 1.4 参桃软肝方治疗肝癌的研究进展 |
| 1.4.1 参桃软肝片的组方基础 |
| 1.4.2 参桃软肝方的研究现状 |
| 1.5 高通量测序的发展现状 |
| 1.5.1 高通量测序概述 |
| 1.5.2 转录组测序研究进展 |
| 1.5.3 基因功能富集分析 |
| 1.6 肝癌的表观遗传研究进展 |
| 1.6.1 表观遗传与甲基化 |
| 1.6.2 甲基化在肝癌中的研究现状 |
| 1.6.3 中医证候的DNA甲基化研究现状 |
| 1.7 网络药理学的发展概况 |
| 第二章 基于网络药理学的参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 参桃软肝方冻干粉的制备及质谱分析 |
| 2.1.2 主要药物化学成分搜集及筛选 |
| 2.1.3 药物靶点搜集与整理 |
| 2.1.4 GEO数据库寻找乙肝相关性肝癌的靶点 |
| 2.1.5 参桃软肝方化学成分-作用靶点网络的构建及关键靶点的分析 |
| 2.1.6 基因本体功能(GO)及KEGG通路富集分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 STR质谱分析及STR在网络药理学平台筛选的化合物及其对应靶点筛选结果 |
| 2.2.2 GEO数据库中乙肝相关性肝癌靶点基因获取结果 |
| 2.2.3 STR抗 HBV-HCC靶点基因的获取和GO功能注释及KEGGG通路富集分析 |
| 2.2.4 “药物-活性成分-关键作用靶点-通路”网络构建及分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 参桃软肝方的体外疗效研究 |
| 3.1 细胞实验研究 |
| 3.1.1 STR抑制人肝癌细胞株 HepG2.2.15、HepG2、MHCC97-H 的增殖 |
| 3.1.2 STR 对人肝癌细胞株 HepG2.2.15、HepG2、MHCC97-H 迁移的影响 |
| 3.2 STR对 BALB/c裸鼠皮下成瘤模型的抑瘤作用及安全性研究 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于高通量测序筛选STR治疗HBV-HCC的潜在靶点及机制 |
| 4.1 STR对 HepG2.2.15 荷瘤裸鼠疗效的转录组学研究 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 对HepG2.2.15 荷瘤裸鼠肿瘤组织全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)分析 |
| 4.2.1 实验步骤 |
| 4.2.2 实验结果 |
| 4.3 转录组测序和WGBS关联分析 |
| 4.3.1 关联基因的筛选 |
| 4.3.2 关联基因的GO注释与KEGG通路富集分析 |
| 4.4 临床HBV-HCC肝癌术后标本WGBS及差异甲基化基因筛选 |
| 4.4.1 临床样本的搜集 |
| 4.4.2 肝癌及癌旁组织样本WGBS测序 |
| 4.4.3 检测结果 |
| 4.5 临床样本WGBS与动物测序结果关联分析 |
| 4.5.1 临床样本WGBS测序与动物样本测序的关联基因筛选 |
| 4.5.2 临床样本WGBS测序与动物样本测序的关联基因GO与 KEGG分析 |
| 4.5.3 Hub基因的外部数据库验证 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 第六章 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）延边地区朝、汉族原发性肝癌患者的临床特征比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 入选标准和排除标准 |
| 2.1.2 肝癌的TNM分期 |
| 2.1.3 肝功能Child-Pugh评分标准 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 临床资料的收集 |
| 2.2.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2.3 研究标本的采集与处理 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 朝、汉族在非肝癌组和肝癌组中一般资料对比分析 |
| 3.2 朝、汉族在非肝癌组和肝癌组中HBV、HCV感染率的对比分析 |
| 3.3 朝、汉族在非肝癌组和肝癌组中血小板、肝功、肾功、血糖、凝血指标的比较 |
| 3.4 朝、汉族在非肝癌组和肝癌组中AFP、GP73、sAXL水平对比分析 |
| 3.5 朝、汉族在原发性肝癌中不同肿瘤特征比较 |
| 3.5.1 朝、汉族在肝癌临床TNM分期比较 |
| 3.5.2 朝、汉族在肝癌肿瘤大小比较 |
| 3.5.3 朝、汉族在肝癌Ghild-Pugh评分比较 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述: 原发性肝癌的细胞免疫治疗进展 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间发表的文章 |
（3）基于网络药理学研究人参皂苷治疗中晚期原发性肝癌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究背景 |
| 1 中医学研究 |
| 1.1 中医对肝癌的认识 |
| 1.2 中医对人参的认识 |
| 2 人参皂苷对原发性肝癌的作用机制 |
| 3 原发性肝癌的现代研究进展 |
| 3.1 手术治疗 |
| 3.2 肝移植 |
| 3.3 射频消融术(RFA) |
| 3.4 动脉化疗栓塞术(TACE) |
| 3.5 放射治疗 |
| 3.6 全身化疗 |
| 3.7 靶向治疗 |
| 3.8 免疫治疗 |
| 3.9 原发病治疗 |
| 4 原发性肝癌的中西医结合治疗 |
| 4.1 中药结合西医治疗现状 |
| 4.2 其他中医治疗方法结合西医治疗现状 |
| 5 总结 |
| 第二章 数据分析与结果讨论 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 数据库检索 |
| 1.2 人参皂苷药物活性成分收集与筛选 |
| 1.3 原发性肝癌靶点蛋白获取 |
| 1.4 人参皂苷对原发性肝癌作用蛋白的互作网络构建 |
| 1.5 人参皂苷-原发性肝癌网络关系图的构建 |
| 1.6 人参皂苷对原发性肝癌靶点的GO分析和KEGG通路注释 |
| 2 结果 |
| 2.1 人参皂苷活性成分收集与靶点预测的结果 |
| 2.2 原发性肝癌靶点蛋白收集结果 |
| 2.3 人参皂苷对原发性肝癌作用蛋白互作图的构建与分析 |
| 2.4 药物预测靶点-疾病靶点关系图的构建结果 |
| 2.5 人参皂苷对原发性肝癌靶点的GO分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 结论 |
| 1 总结 |
| 2 不足 |
| 参考文献 |
| 综述 人参皂苷治疗中晚期原发性肝癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
（4）盐酸安罗替尼治疗晚期原发性肝癌的临床疗效、安全性及预后分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词索引 |
| 前言 |
| 1 研究对象及方法 |
| 2 临床资料分析 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 原发性肝癌靶向治疗现状 |
| 参考文献 |
| 个人简历和在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）AFP在原发性肝癌不同因素分层诊断中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 AFP在原发性肝癌不同因素分层诊断中的作用研究 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 资料收集 |
| 1.1.3 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 不同标准分层原发性肝癌的影响因素 |
| 1.2.2 原发性肝癌患者AFP表达情况分析 |
| 1.2.3 不同标准分层原发性肝癌患者AFP表达水平及其诊断阳性率 |
| 1.2.4 AFP对于不同标准分层原发性肝癌的诊断效率 |
| 1.2.5 AFP、CEA、CA-199和GGT联合诊断小肝癌和早期肝癌 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 不同标准分层原发性肝癌的影响因素 |
| 1.3.2 AFP对不同标准分层原发性肝癌的诊断价值 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 肝癌免疫微环境的研究进展 |
| 2.1 肿瘤微环境的重要性 |
| 2.2 肝癌免疫微环境中的免疫抑制成分 |
| 2.2.1 髓来源抑制细胞 |
| 2.2.2 肝星状细胞 |
| 2.2.3 肿瘤相关成纤维细胞 |
| 2.2.4 调节性T细胞 |
| 2.2.5 M2型巨噬细胞 |
| 2.2.6 肿瘤相关中性粒细胞 |
| 2.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（6）肌细胞增强因子MEF2D在肝癌免疫逃逸中的作用和分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 肝癌细胞MEF2D通过抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫促进肿瘤生长 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.3.1 细胞培养与基因敲除单克隆细胞系制备 |
| 2.2.3.2 免疫组化技术分析临床肝癌标本 |
| 2.2.3.3 肝癌组织制备单细胞和流式分析 |
| 2.2.3.4 构建T细胞耗竭的同源野生型小鼠肝脏原位移植瘤模型 |
| 2.2.3.5 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 干扰MEF2D表达可显着抑制肝癌细胞原位移植瘤在同源野生型小鼠体内的生长 |
| 2.3.2 临床肝癌样本中的肿瘤细胞MEF2D表达与T细胞瘤内浸润负相关,与CD8~+T细胞耗竭正相关 |
| 2.3.3 敲除MEF2D抑制肝癌细胞移植瘤生长的过程依赖CD8~+T细胞 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MEF2D激活PD-L1 基因转录促进肝癌免疫逃逸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.3.1 q RT-PCR实验 |
| 3.2.3.2 染色质免疫共沉淀(ChIP/re-ChIP)实验 |
| 3.2.3.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 3.2.3.4 Western blot实验 |
| 3.2.3.5 PD-1蛋白与细胞结合实验 |
| 3.2.3.6 基于肝癌细胞和T细胞共培养体系下的杀伤实验 |
| 3.2.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡实验(Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒) |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除MEF2D抑制免疫检查点分子PD-L1在肝癌细胞中的表达 |
| 3.3.2 MEF2D直接结合CD274基因启动子并激活其转录 |
| 3.3.3 MEF2D参与IFNG诱导肝癌细胞PD-L1表达的过程 |
| 3.3.4 肝癌细胞MEF2D通过PD-L1抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 IFNG刺激条件下p300通过促进MEF2D乙酰化上调PD-L1表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.3.1 蛋白质免疫共沉淀实验 |
| 4.2.3.2 His或GST标签pull-down实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肝癌细胞p300缺失抑制IFNG诱导的MEF2D乙酰化和PD-L1表达 |
| 4.3.2 p300结合MEF2D并促进其及CD274基因启动子组蛋白乙酰化 |
| 4.3.3 p300通过MEF2D的多赖氨酸位点促进其乙酰化及PD-L1表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 SIRT7通过抑制MEF2D乙酰化和PD-L1表达影响肝癌免疫逃逸 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.2.3.1 共培养体系中T细胞胞内细胞因子流式检测 |
| 5.2.3.2 共培养体系中T细胞胞外分泌细胞因子ELISA检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SIRT7 直接结合MEF2D并抑制其乙酰化 |
| 5.3.2 IFNG缺乏条件下,SIRT7 通过MEF2D抑制肝癌细胞PD-L1表达 |
| 5.3.3 SIRT7 缺失的肝癌细胞通过MEF2D-PD-L1通路抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 敲除SIRT7联合PD-1单抗可以抑制肝癌细胞移植瘤的生长 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.2.3.1 构建用PD-1单抗治疗的同源野生型小鼠肝脏原位移植瘤模型 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 免疫检查点抑制剂在原发性肝癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）1.MAML3通过调控ZEB1诱导免疫抵抗型肝癌细胞上皮间质转化 2.MoO2-R837纳米颗粒在肿瘤协同治疗中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要(第一部分) |
| 英文摘要(第一部分) |
| 中文摘要(第二部分) |
| 英文摘要(第二部分) |
| 缩略词及中、英文对照 |
| 第一部分: MAML3通过调控ZEB1诱导免疫抵抗型肝癌细胞上皮间质转化 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 2.1. 实验所用的细胞及细胞培养方法 |
| 2.2. 实验动物及饲养 |
| 2.3. 建立对NK细胞耐受的免疫抵抗型HCC细胞株 |
| 2.4. 试剂和仪器 |
| 2.5. 稳定敲减相关基因的肝癌细胞株的建立 |
| 2.6. RNA提取、逆转录、实时荧光定量PCR (qPCR) |
| 2.7. Western Blot检测相关蛋白表达变化 |
| 2.8. 细胞迁移、侵袭能力检测(Migration、Invasion) |
| 2.9. 乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒检测试验 |
| 2.10. 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.11. 裸鼠尾静脉注射肿瘤转移实验 |
| 2.12. 伦理审批 |
| 2.13. 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 构建免疫抵抗型肝细胞肝癌细胞株(HCC-R) |
| 3.2. 免疫抵抗型肝癌细胞的功能学变化 |
| 3.3. 免疫抵抗型肝癌在裸鼠体内成瘤能力增强 |
| 3.4. MAML3在免疫抵抗型肝癌细胞中高表达 |
| 3.5. MAML3的敲减及其对免疫抵抗型肝癌细胞的功能学影响 |
| 3.6. MAML3促进免疫抵抗型肝癌细胞转移侵袭的机制研究 |
| 3.7. MAML3能够增强免疫抵抗型肝癌细胞在裸鼠体内的转移和侵袭能力 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 第二部分: MoO_2-R837纳米颗粒在肿瘤协同治疗中的应用 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 2.1. MoO_2-R837纳米材料的制备 |
| 2.2. 测试分析方法及主要仪器 |
| 2.3. 实验细胞及培养方法 |
| 2.4. 细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞毒性研究 |
| 2.5. 细胞活死染色 |
| 2.6. 免疫抵抗型小鼠肝脏肿瘤细胞(Hep1-6R)的诱导方法 |
| 2.7. 酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测IFN-γ、TNF-α、IL-6的水平变化 |
| 2.8. 石蜡组织切片制备及HE染色 |
| 2.9. 实验动物及饲养 |
| 2.10. 小鼠肝细胞肝癌原位移植鼠模型构建 |
| 2.11. 小鼠双侧皮下肿瘤人工模型构建 |
| 2.12. 伦理审批 |
| 2.13. 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 构建Hep1-6R细胞 |
| 3.2. MoO_2纳米材料的表征 |
| 3.3. MoO_2-R837的合成检测 |
| 3.4. MoO_2及MoO_2-R837的胞外光热特性 |
| 3.5. 纳米材料生物相容性研究 |
| 3.6. PTT下MoO_2、MoO_2-R837纳米材料的体外治疗肿瘤效果 |
| 3.7. 肝原位肿瘤的光热效果研究 |
| 3.8. 免疫阻断联合PTT对转移瘤的治疗 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 综述 纳米材料在肝癌中的应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取的科研成果 |
| 学习经历 |
| 攻读博士期间发表的SCI论文 |
| 攻读博士学位期间从事的科研项目 |
（8）肝癌免疫微环境中髓系细胞亚群组成及其与肝癌预后的关联研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的概述 |
| 1.1.1 肝癌的全球趋势 |
| 1.1.2 肝癌的致病因素和分子机制 |
| 1.1.3 肝癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤微环境的研究现状 |
| 1.2.1 肿瘤微环境的概念 |
| 1.2.2 肿瘤微环境中的免疫细胞及其功能 |
| 1.3 单细胞RNA测序技术的发展及应用 |
| 1.4 本课题的研究意义及主要内容 |
| 1.4.1 本课题的研究意义 |
| 1.4.2 本课题的主要研究方法和内容 |
| 第二章 单细胞RNA测序方法及数据预处理 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 单细胞RNA测序样本 |
| 2.2.2 组织消化及细胞悬液制备 |
| 2.2.3 免疫细胞的流式分选 |
| 2.2.4 单细胞转录组文库制备及测序 |
| 2.3 单细胞RNA-seq数据的预处理 |
| 2.3.1 单细胞RNA-seq数据的过滤与表达量定量 |
| 2.3.2 单细胞样本和基因质控 |
| 2.3.3 管家基因表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 解析肝癌微环境的免疫细胞图谱 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 单细胞聚类分析及可视化 |
| 3.2.2 细胞亚群特征基因的鉴定 |
| 3.2.3 福尔马林固定石蜡包埋组织样本 |
| 3.2.4 免疫组化分析 |
| 3.3 肝癌微环境中免疫细胞类型鉴定 |
| 3.3.1 免疫细胞的聚类分析及降维可视化 |
| 3.3.2 差异表达分析及细胞类型鉴定 |
| 3.4 肝癌微环境中髓系细胞亚型鉴定 |
| 3.4.1 髓系细胞的聚类及降维可视化 |
| 3.4.2 差异表达分析及细胞类型鉴定 |
| 3.5 肝癌中免疫细胞的浸润差异 |
| 3.6 肝癌中髓系细胞亚型的浸润差异 |
| 3.7 本章小节 |
| 第四章 肝癌微环境与数据库中外周血的DC细胞组成及转录组差异的对比分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 数据来源 |
| 4.2.1 外周血DC单细胞转录组数据获取 |
| 4.2.2 肿瘤微环境数据获取 |
| 4.3 肝癌微环境与数据库中外周血的DC细胞组成及转录组差异 |
| 4.3.1 肝癌微环境与外周血中DC细胞的整合分析 |
| 4.3.2 肝癌微环境与外周血中DC细胞的差异表达基因鉴定 |
| 4.4 DC3在黑色素瘤与头颈癌中的鉴定 |
| 4.5 肝癌微环境中DC的募集 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肝癌微环境中髓系细胞与肝癌临床表型和预后的关联分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 数据来源与分析方法 |
| 5.2.1 癌症数据库中肝癌数据获取 |
| 5.2.2 TAM的极化状态分析 |
| 5.2.3 生存分析 |
| 5.3 肝癌微环境中髓系细胞与肝癌临床表型的关联分析 |
| 5.4 TAM的极化状态与肝癌预后的关系 |
| 5.4.1 TAM的极化状态 |
| 5.4.2 肝癌中TAM与预后的关联 |
| 5.5 微环境中单核细胞与肝癌预后的关系 |
| 5.5.1 FCN1_mono的特征与预后的关系 |
| 5.5.2 Mono4的特征与预后的关系 |
| 5.6 微环境中DC亚型与肝癌预后的关系 |
| 5.6.1 微环境中DC亚型的特征 |
| 5.6.2 肝癌微环境中DC与预后的关联 |
| 5.7 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）N-（5-芳苄叉基绕丹宁）环丙沙星酰胺衍生物对人肝癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1.实验仪器、试剂和材料 |
| 1.1 细胞培养 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂与实验材料 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.4.1 细胞培养液 |
| 1.4.2 磷酸盐缓冲液(PBS) |
| 1.4.3 MTT工作液 |
| 1.4.4 胰蛋白酶储备液 |
| 1.4.5 胰蛋白酶工作液 |
| 1.4.6 30%Acr-Bis溶液 |
| 1.4.7 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 |
| 1.4.8 1.0 mol/L Tris·HCl(pH6.8)溶液 |
| 1.4.9 1.0 mol/L Tris·HCl(pH8.8)溶液 |
| 1.4.10 10%过硫酸铵溶液 |
| 1.4.11 10%SDS溶液 |
| 1.4.12 2×转移电泳缓冲液 |
| 1.4.13 10×电泳缓冲液 |
| 1.4.14 10×TBS缓冲液 |
| 1.4.15 TBST缓冲液 |
| 1.4.16 10mmol/L的氯喹溶液 |
| 1.4.17 20%Tween20溶液 |
| 1.4.18 100μg/ml碘化丙啶染液 |
| 1.4.19 5×TBE缓冲液 |
| 1.4.20 10mg/ml溴化乙锭染液 |
| 1.4.21 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液 |
| 1.4.22 脱脂奶粉封闭液 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MTT法检测细胞生长抑制率 |
| 2.2 TUNEL法测定细胞的凋亡率 |
| 2.3 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.4 间接免疫荧光检测LC3在细胞中的表达 |
| 2.5 免疫印迹法检测LC3蛋白表达量 |
| 2.5.1 蛋白质样品的制备 |
| 2.5.2 蛋白凝胶电泳 |
| 2.5.3 蛋白质转移电泳 |
| 2.5.4 抗体杂交和ECL显色 |
| 2.6 细胞转染及RNA干扰 |
| 2.7 RT-PCR |
| 2.7.1 RNA提取 |
| 2.7.2 逆转录体系 |
| 2.7.3 PCR反应体系 |
| 2.7.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 10种氟喹诺酮类衍生物对人肝癌细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 HGQ-15对SMMC-7721 细胞的增殖抑制作用 |
| 3.3 HGQ-15 诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用 |
| 3.4 HGQ-15对SMMC-7721 细胞自噬的影响 |
| 3.5 Beclin-1 siRNA和氯喹对HGQ-15 抑制细胞增殖作用的影响 |
| 3.5.1 Beclin-1 siRNA载体的构建与表达检测 |
| 3.5.2 Beclin-1 siRNA对 HGQ-15 抑制细胞增殖作用的影响 |
| 3.5.3 自噬抑制剂氯喹对HGQ-15抑制细胞增殖作用的影响 |
| 3.5.4 Beclin-1 siRNA和氯喹对HGQ-15 诱导细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 原发性肝癌药物治疗的现状及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间科研情况 |
| 致谢 |
（10）雄激素受体通过调节肝细胞肝癌PD-L1表达影响肝癌免疫检查点治疗（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语及中英文对照 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验所用的细胞及细胞培养方法 |
| 2.2 实验所需的肝癌标本 |
| 2.3 实验动物及饲养 |
| 2.4 试剂和仪器 |
| 2.5 稳定过表达及敲减相关基因的肝癌细胞株的建立 |
| 2.6 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 2.7 免疫组化(IHC)检测相关基因表达情况 |
| 2.8 PD-1/PD-L1表面受体结合试验 |
| 2.9 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.10 CD8~+T细胞的提取及激活 |
| 2.11 Western Blot检测相关蛋白表达变化 |
| 2.12 染色质免疫共沉淀(CHIP) |
| 2.13 启动子荧光素酶报告基因(Luciferase)构建以及检测 |
| 2.14 流式细胞学检测 |
| 2.15 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.16 小鼠去势(Castration)模式建立 |
| 2.17 小鼠肝脏原位成瘤实验 |
| 2.18 统计分析 |
| 3 技术路线 |
| 4 结果 |
| 4.1 雄激素受体影响T细胞对肝细胞肝癌的免疫监视作用 |
| 4.2 雄激素受体通过负调控PD-L1表达影响T细胞功能 |
| 4.3 肝细胞肝癌中的雄激素受体转录抑制PD-L1表达 |
| 4.4 肝癌实体瘤内AR与PD-L1的关系 |
| 4.5 雄激素与AR协同作用调节抗PD-L1治疗的疗效 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤细胞调节 PD-L1 的机制探究 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读博士学位期间所取得的科研成果 |
四、原发性肝癌免疫治疗及基因治疗现状（论文参考文献）
- [1]基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制[D]. 贺凡. 广州中医药大学, 2020(09)
- [2]延边地区朝、汉族原发性肝癌患者的临床特征比较[D]. 潘猛. 延边大学, 2020
- [3]基于网络药理学研究人参皂苷治疗中晚期原发性肝癌的作用机制[D]. 罗飞凤. 广西中医药大学, 2020(02)
- [4]盐酸安罗替尼治疗晚期原发性肝癌的临床疗效、安全性及预后分析[D]. 王亚梦. 郑州大学, 2020(02)
- [5]AFP在原发性肝癌不同因素分层诊断中的作用研究[D]. 焦红彬. 华北理工大学, 2020(02)
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