一、BDNF基因修饰神经干细胞移植后大鼠脊髓损伤移植处的基因表达变化（论文文献综述）
邵亚丽[1]（2020）在《梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的效应及促神经新生作用研究》文中研究指明背景梓醇是中药地黄的主要有效成分之一,既往研究表明,梓醇在脑缺血急性期给药具有神经保护作用,能够改善脑缺血大鼠神经行为学功能,促进缺血区周围血管新生和成体神经干细胞增殖存活,但梓醇延迟给药对于脑缺血大鼠的效应以及对神经干细胞的分化作用暂未研究。基于治疗脑缺血疾病药物匮乏的现状,且目前唯一公认有效的静脉溶栓药物组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator,t PA）的治疗时间窗狭窄（3-4.5 h）,该时段内极大多数患者不能及时就医。梓醇作为缺血性脑损伤的潜在保护剂,如果在t PA治疗时间窗外能够保护缺血脑区及周围组织,研究其药效学作用及对新生神经干细胞的分化作用,具有重要的科学价值和临床意义。本课题受国家自然科学基金项目（81873034）资助。目的观察梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的神经行为学影响以及神经新生效应和神经干细胞分化作用研究。方法1.SD大鼠随机分为6组,分为假手术组,模型组,造模后6 h首次给药组（5 mg/kg和10 mg/kg）,造模后4 d首次给药组（5 mg/kg和10 mg/kg）,电凝法制备局灶性永久性脑缺血（permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO）模型,给药组腹腔注射梓醇,对照组注射同等剂量生理盐水,每日一次,连续7天。各组大鼠分别于给药后1,4,7,14,21,28天进行体重测量及Bederson评分,神经功能缺损评分（modified neurologic severity score,m NSS）,肌力测试评分（muscle strength）,对神经功能恢复进行评价。2.结合Brd U体内标记细胞增殖,梓醇给药7,14,21,28天后各组大鼠取材,免疫荧光双标Brd U/Nestin检测室管膜下区（subventricular zone,SVZ）神经干细胞增殖存活情况,Brd U/GFAP,Brd U/DCX和Brd U/Neu N荧光双标检测神经干细胞分化为星形胶质细胞及神经元情况;免疫印迹法（Western Blot,WB）检测各组损伤侧SVZ区Nestin/DCX以及损伤侧皮层GFAP和Neu N的蛋白表达。3.由于新生鼠SVZ数量少且难以分离,本研究选择原代培养24 h内新生鼠海马区神经干细胞,进行纯化鉴定,Brd U标记细胞增殖,cck-8检测不同浓度的梓醇对神经干细胞活力的影响,加入分化培养基诱导干细胞分化,免疫荧光MAP-2,GFAP,MBP检测细胞分化,WB检测分化表型相关蛋白的表达。结果1.成功制备局灶性脑缺血模型,梗死体积为9.62±2.43%。行为学实验结果表明,梓醇给药组不同程度促进脑缺血大鼠体重增长,降低脑缺血大鼠Bederson和神经功能缺损评分,提高肌力测试评分,6h,5mg/kg组肌力测评分在14天时有显着差异（P<0.05,vs model）,21天时各组神经功能基本恢复至假手术水平,各给药组间无显着差异（P>0.05,vs sham）。2.梓醇给药后不同时点促进局灶永久性脑缺血大鼠损伤侧SVZ区神经干细胞增殖存活,Brd U/Nestin荧光结果提示脑区成体神经干细胞存在的事实。脑缺血后7天及14天,星形胶质细胞数量显着增加（P<0.05,vs model）,新生神经干细胞与神经元数量与模型组相比显着增加（P<0.05,vs model）,14天时DCX表达增强,6 h,5 mg/kg剂量组与模型组相比有显着差异（P<0.05,vs model）,其余给药组与假手术相比有显着差异（P<0.05,vs sham）,21天时各给药组GFAP表达降低,Nestin,Neu N表达增强,与模型组相比有显着差异（P<0.05,vs model）,与行为学结果基本一致。3.海马神经干细胞培养7 d后可增殖为直径为200μm左右的神经球,神经球呈现Brd U/Nestin免疫双标阳性;cck-8筛选出促进神经干细胞生长的梓醇浓度为0.1,1,10,100μM;用不同浓度的梓醇诱导P3代神经干细胞分化7天,可见MAP-2阳性的神经元,GFAP阳性的星形胶质细胞及MBP阳性表达的少突胶质细胞;10μM梓醇促进NSCs向神经元方向分化,0.1μM促进向星型胶质细胞方向分化。结论1.梓醇延迟给药促进局灶性永久性脑缺血大鼠体重增长,改善神经行为学评分。2.梓醇延迟给药促进局灶性永久性脑缺血大鼠损伤侧SVZ区神经干细胞增殖,促进缺血区域附近神经元存活,减少星形胶质细胞增殖。3.原代培养的海马神经干细胞具有旺盛的自我增殖和多向分化潜能,梓醇对神经干细胞向神经元和胶质细胞分化的作用有剂量效应。
曾友根[2]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中研究说明目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
唐浩帅[3]（2020）在《慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究》文中提出【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）后的神经功能恢复一直是困扰医学界的难题,其中轴突的再生和髓鞘化是突破这一难题的重要修复方式,本研究通过慢病毒介导音猥因子（Sonic Hedgehog,Shh）转染大鼠雪旺细胞,持续稳定分泌Shh因子,同时促进雪旺细胞的增殖活性以及分泌神经营养因子功能,移植稳定表达Shh因子的雪旺细胞于脊髓损伤部位,探讨Shh因子联合雪旺细胞在修复脊髓损伤中的作用及其发挥协同作用的相关机制,为细胞移植联合基因修饰促进SCI修复提供新策略。【方法】1.大鼠雪旺细胞的分离、培养和鉴定:本研究选取出生后3-5天的SD（Sprague Dawley）大鼠,在其坐骨神经中分离雪旺细胞（Schwann Cells,SCs）,通过双酶消化和差速贴壁对雪旺细胞进行分离、培养以及纯化,S-100免疫荧光对雪旺细胞进行鉴定。2.慢病毒转染雪旺细胞及筛选:构建p LVX-IRES-Puro-Shh慢病毒表达载体,将纯化后的雪旺细胞传代至6孔板中加入病毒工作液,转染成功后加入嘌呤霉素筛选出稳定表达Shh因子的雪旺细胞（S-SCs）。3.检测细胞活性及表达因子:利用MTT法进行细胞活性测定,绘制细胞生长曲线;多时间点ELISA法检测Shh因子及BDNF、NGF的表达水平的变化。4.动物模型的建立及移植后行为学评价:雌性SD大鼠（240±10g）,8周龄,采用Impactor Model II打击系统,建立脊髓挫伤模型,大鼠SCI后7天,在损伤部位进行移植。行为学评价包括SCI后当天以及SCI后12周内每隔2周对各组大鼠进行BBB评分,评估各组大鼠后肢功能的恢复情况。5.移植后损伤区域神经细胞改变:SCI后第12周,通过NF200标记轴突,损伤中心横切染色,观察脊髓损伤局部轴突改变情况;SCI后第2、12周,通过Nestin标记神经干细胞、Olig2标记少突胶质细胞前体细胞、GFAP标记星形胶质细胞,损伤中心横切染色,观察神经细胞的增殖和分化情况。6.移植后损伤区域白质和髓鞘改变:SCI后第2、12周,各组大鼠以损伤部位为中心进行横切,行甲苯胺蓝染色,高倍镜下观察损伤局部的白质和髓鞘改变。【结果】1.细胞形态与生长情况观察:经筛选后转染Shh因子的雪旺细胞符合典型雪旺细胞特征,S-100染色观察转染Shh因子雪旺细胞与正常细胞形态一致。纯化培养后光镜下观察各组雪旺细胞生长情况,S-SCs组细胞密度高于SCs组与V-SCs组,慢病毒转染后未对细胞生长产生负担。2.细胞增殖活性及表达因子检测:通过MTT法检测发现细胞增殖曲线为指数型,S-SCs组细胞增殖活性高于V-SCs组和SCs组,无负代谢影响,其差异具有统计学意义（P<0.05）;通过ELISA法进行不同时间点Shh、BDNF和NGF含量检测,S-SCs组明显高于SCs组和V-SCs组,可持续稳定分泌至第8周。3运动功能评价:脊髓损伤后12周内对动物进行BBB评分,各组大鼠后肢功能均有恢复,在损伤后第12周,与DMEM移植组和SCs移植组相比,S-SCs移植组BBB评分最高,其差异具有统计学意义（P<0.01）,S-SCs移植组更好的促进了大鼠后肢的运动功能恢复。4.移植后损伤区域神经细胞改变:免疫荧光染色结果显示,与SCs移植组组和DMEM移植组相比,S-SCs移植组的损伤中心NF200阳性细胞数最多（P<0.01）;在损伤后第2周和12周,免疫荧光染色结果显示损伤中心Nestin阳性细胞、损伤中心及周围白质的Olig2阳性细胞数,S-SCs移植组最多,SCs移植组和DMEM移植组较少（P<0.01）;损伤后第2周,损伤区域GFAP阳性细胞数DMEM移植组多于SCs移植组和S-SCs移植组（P<0.05）,至第12周S-SCs移植组GFAP阳性细胞数最少,其差异具有统计学意义（P<0.01）。5.移植后损伤局部白质和髓鞘的改变:在SCI第2周时,各组SCI中心白质区损伤严重;第12周时,DMEM组白质区域神经纤维结构不清,排列紊乱;而S-SCs组白质区域神经纤维结构清晰,可见囊性结构中有髓鞘出现,与DMEM组相比可明显改善SCI后损伤面积,减少慢性期的空洞形成。【结论】1.雪旺细胞通过慢病毒转染Shh基因后,能够持续、稳定表达Shh因子,提高雪旺细胞的增殖活性以及神经营养因子BDNF、NGF的表达水平,并且其效果具有长期稳定的特征。2.脊髓损伤局部移植持续稳定表达Shh因子的雪旺细胞,较单纯移植SCs或DMEM,可显着减少损伤区域胶质瘢痕形成,促进损伤区域轴突再生和髓鞘化,促进大鼠后肢功能恢复。3.Shh因子能够增强雪旺细胞的自身活性,并维持稳定表达,通过基因修饰手段将雪旺细胞与Shh因子联合,优势互补,产生协同作用,在损伤后激活内源性神经细胞,促进神经干细胞向少突胶质细胞方向分化,保护轴突并促进轴突的再髓鞘化,为基因修饰联合细胞移植修复脊髓损伤提供新策略。
吴秋丽[4]（2019）在《低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究》文中认为【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是一种严重的创伤性疾病,修复手段主要有手术治疗、药物治疗、细胞移植等。神经干细胞移植能够有效促进SCI后神经功能的恢复,是当前研究的热点。iPSCs诱导的神经干细胞（induced Pluripotent Stem Cells-Neural Stem Cells,iPS-NSCs）是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,自体取材避免了伦理学争议和免疫排斥,应用于细胞移植治疗脊髓损伤具有显着的优势。然而干细胞在体内存活率低、向神经方向分化较难,因此如何更好的促进其增殖、定向分化是众多研究者关注的焦点。国内外研究表明低强度脉冲超声（Low Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS）是一种可以促进多种细胞增殖、分化的物理刺激手段,本研究旨在明确LIPUS对iPS-NSCs细胞特性的影响以及LIPUS介导的iPS-NSCs对脊髓损伤的修复作用,为干细胞的优化和SCI的治疗提供一种新的策略。本研究通过:1)体外培养iPS-NSCs,将自主研制的LIPUS激励系统作用于iPS-NSCs细胞,观察细胞的形态学、增殖、分化和神经营养因子（Neurotrophic Factors,NTFs）分泌含量的改变,明确LIPUS最佳的刺激参数,并初步探索LIPUS干预后细胞增殖的调控机制;2)建立脊髓损伤的动物模型,于脊髓损伤局部移植iPS-NSCs和LIPUS-iPS-NSCs细胞,评价细胞移植后SCI大鼠损伤局部组织学形态、神经营养因子含量以及运动功能的改变,初步探讨LIPUS介导iPS-NSCs细胞移植修复脊髓损伤的效果。【方法】本实验研究分为体外实验和体内实验两部分:体外实验:利用自主搭建LIPUS细胞激励系统,以不同的刺激参数干预iPS-NSCs细胞,观察细胞的形态,采用CCK-8检测其增殖活性的改变,明确LIPUS最佳的刺激参数;借助最佳的激励参数,通过TUNEL、ELISA、Western Blot以及免疫组化等方法,观察LIPUS对iPS-NSCs细胞凋亡、分化以及NTFs分泌的影响,并初步探讨细胞增殖与Notch信号通路的潜在关系。体内实验:采用Impactor model-Ⅲ打击器建立Wistar大鼠脊髓损伤动物模型,分为假手术组、单纯损伤组、iPS-NSCs移植组和LIPUS-iPS-NSCs移植组,在大鼠脊髓损伤后7天进行细胞移植。术前1天、术后1天至8周,采用BBB评分评估大鼠后肢运动功能恢复情况;术后8周大鼠进行灌注取材切片,采用HE染色观察损伤局部空洞的面积,免疫荧光染色观察神经再生和胶质瘢痕形成的情况,ELISA检测局部脊髓组织中营养因子的含量。数据由统计学软件SPSS20.0进行分析,结果以均数±标准差（Mean±SD）形式表示,p<0.05表示具有统计学意义。【结果】1.本实验成功搭建了LIPUS细胞激励系统,LIPUS体外刺激iPS-NSCs细胞可以提高其增殖活性,且最佳的刺激参数为1MHz、8V（69.3 mW/cm2）;2.在最佳刺激参数下,LIPUS可以提高iPS-NSCs细胞活性,而对细胞凋亡没有产生明显的影响,因此1MHz、8V（69.3 mW/cm2）的LIPUS是一种安全、无创的物理刺激因子,同时能够促进iPS-NSCs细胞向神经元方向分化,促进上清液中BDNF、NGF的表达;3.在最佳刺激参数下,LIPUS干预可以促进iPS-NSCs细胞中受体Notch1和靶基因HES1蛋白水平的表达;4.在脊髓损伤体内实验中,细胞移植后,尤其是LIPUS-iPS-NSCs移植组,脊髓组织的空洞减小,轴突增生活跃,反应性星形胶质细胞减少,脊髓组织局部BDNF、NGF表达水平提高;5.功能学评分结果显示LIPUS-iPS-NSCs移植组大鼠的后肢运动功能恢复明显优于其他损伤组,差异具有统计学意义。【结论】1.本研究中自主搭建的LIPUS激励系统可以明显提高体外培养的iPS-NSCs细胞的增殖活性,增加细胞中神经营养因子的表达,促进其向神经元方向分化,其中Notch信号通路可能是调控LIPUS促进iPS-NSCs细胞活性的潜在机制;2.移植LIPUS优化的iPS-NSCs种子细胞,可以明显的改善脊髓损伤大鼠的后肢运动功能,减少局部胶质瘢痕的形成,促进轴突的再生和NTFs表达。本研究证明LIPUS是一种安全、无创的体外激励方法,可以提高iPS-NSCs细胞在脊髓损伤修复中的作用,为优化细胞移植的种子细胞提供了新策略,为脊髓损伤修复提供新思路。
陈茂华[5]（2014）在《HIF-1α基因及GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究》文中提出研究目的：探讨经HIF-1α、 GDNF基因修饰的神经干细胞（NSCs）在大鼠脊髓内移植后,神经干细胞的存活和分化情况及其对动物运动功能恢复的影响。为脊髓损伤的基因治疗提供新思路及实验依据。研究方法：采用电控大鼠脊髓损伤打击装置制作SD大鼠脊髓损伤模型95只,25g·c（2.5cm×10g）力致伤T13脊髓,随机分为4组：正常对照（Normal）5只,脊髓损伤组（SCI）30只,神经干细胞移植组（NSC）30只, HIF-1α、GDNF双基因修饰的神经干细胞移植组（HIF-1α、GDNF+NSC）30只,分别于移植后5个时相点（1周、2周、3周、5周、8周）对大鼠进行BBB后肢功能评分和皮层体感诱发电位（cortical somatosensory evoked potential, CSEP）检查后,进行灌注固定,取损伤段脊髓做石蜡切片,运用HE染色、免疫组化、免疫双标检测等方法,通过观察移植处神经干细胞的标记物5-溴-2-脱氧尿苷（bromodeoxy uridine/5-bromo-2-deoxy uridine,BrdU）的表达,观察神经丝-200（NF-200）的表达和观察GFAP+BrdU、NF-200+BrdU双重染色的表达结果,分析HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞的存活、分化情况,进而分析HIF-1α、GDNF双基因修饰的NSC对脊髓损伤的修复作用。实验结果：1.H-E染色显示,损伤组脊髓损伤后损伤区及中央管内、灰质中不同程度出血,神经元变性,脊髓前索、侧索的轴索粗肿胀,坏死缺损区域形成；HIF-1α、GDNF双基因修饰神经干细胞组移植治疗后,出血、坏死等损伤性改变持续时间缩短,细胞残留数目相对增多,尼氏体增加,形态大致正常的细胞数目较多,相同时间点与其它组相比较差异明显。2.BrdU免疫组化染色结果发现,细胞移植组在细胞移植处,均有BrdU染色阳性细胞存在,表明移植细胞在宿主体内可以存活,比较单纯神经干细胞移植组与HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞移植组BrdU染色阳性细胞数,基因修饰组明显多于单纯神经干细胞组（P<0.05）,双基因修饰神经干细胞在宿主内存活的数量增加；免疫双标检测结果,在单纯神经干细胞移植组与HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞移植组均有GFAP+BrdU和NF-200+BrdU双染阳性细胞；分析双染阳性细胞数占所有BrdU染色阳性细胞数的比例,移植后同一时间点,HIF-1α、GDNF双基因修饰神经干细胞组神经干细胞分化率高于单纯神经干细胞组（P<0.01）；NF-200染色,正常组脊髓白质可见轴突阳性着色,排列整齐密集,损伤组NF-200阳性轴突灰度值降低；HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞组与神经干细胞组相比,移植后相同时间,NF-200灰度值均明显增高,且前者高于后者差异明显（P<0.01）。3.CSEP检查结果：所有被检测大鼠受伤前均获得正常CSEP信号,包括1个负向波,潜伏期（17.1±0.5）ms,波幅（66.4±20.2）μV。受伤后各组动物CSEP信号均不同程度消失,潜伏期延长,GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞组从移植后第1周开始,大鼠CSEP信号开始出现恢复，但其波幅较伤前及正常组明显下降,潜伏期也明显延迟（P<0.05）,与单纯神经干细胞组和损伤对照组CSEP潜伏期恢复有明显差异（P<0.01）。4.所有手术组动物BBB评分,移植后BBB评分逐渐升高,移植后同一时间点,NSC+GDNF、 HIF-1α组评分高于SCI和NSC组,结果差异明显（P<0.01）。结论：1.GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞能在损伤脊髓内可以存活。2. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞能在损伤脊髓内可以分化为神经元和神经胶质细胞。3. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植较单纯神经干细胞移植可以增加干细胞的存活和分化。4. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植能促进脊髓损伤动物运动功能的恢复。5. GDNF、HIF-1αt基因修饰神经干细胞可以作为脊髓损伤修复的移植材料。
张立群[6]（2013）在《带神经干细胞的周围神经移植联合氯化锂治疗大鼠脊髓损伤的研究》文中认为目的：大鼠胚胎脊髓来源的神经干细胞（Neural stem cell, NSC）的体外培养和鉴定。方法：采用酶消化和机械分离法结合从孕13.5天的携带绿色荧光蛋白（Greenfluorescent protein，GFP）的转基因大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞，采用免疫荧光染色方法检测培养细胞的巢蛋白（Nestin）、溴脱氧尿苷（Bromodeoxyuridine，BrdU）、神经元核蛋白（Neuronal nuclei，NeuN）和胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表达情况，对培养细胞进行鉴定。结果：GFP转基因大鼠胚胎脊髓来源的神经干细胞在体外培养环境下生长良好，表达GFP和特异性蛋白Nestin，BrdU染色阳性，在添加血清后能表达NeuN和GFAP蛋白。结论：从GFP转基因大鼠胚胎脊髓中分离培养的细胞能表达神经干细胞特异性蛋白，具有自我更新能力和一定条件下的多向分化能力，证实是神经干细胞。目的：研究氯化锂对体外培养的神经干细胞的增殖和分化的影响。方法：在神经干细胞培养液内添加氯化锂，观察不同浓度的氯化锂对神经干细胞生长状态的影响；用免疫荧光方法检测神经干细胞BrdU、NeuN、GFAP的表达情况。结果：添加1mM氯化锂的神经干细胞的生长良好，3mM的氯化锂会抑制神经干细胞的生长，6mM的氯化锂会造成神经干细胞死亡。在保留或去除表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Fibroblast growthfactor-basic，bFGF）的情况下，1mM的氯化锂均能明显增加神经干细胞的BrdU表达；与对照组比较，氯化锂处理组神经干细胞的NeuN阳性神经元比例明显增加，GFAP阳性胶质细胞的比例明显减少。结论：1mM浓度的氯化锂对神经干细胞的生长没有毒性作用，能促进神经干细胞的增殖，促进神经干细胞向神经元方向分化，抑制神经干细胞向胶质细胞方向分化。目的：研究氯化锂对移植到胫神经内的神经干细胞的存活、分化的影响；研究神经干细胞移植和氯化锂处理对宿主神经轴突溃变、炎症细胞浸润及神经营养因子表达的影响。方法：结扎成年大鼠右侧胫神经，将培养的神经干细胞移植到胫神经远端，腹腔注射氯化锂或生理盐水，一周后用免疫荧光染色方法检测神经干细胞的Nestin、NeuN、胆碱乙酰转移酶（Cholin acetyltransferase，ChAT）、GFAP、神经纤丝蛋白200（Neurofilament200kDa，NF200）、巨噬细胞抗原（ED1）的表达情况；用免疫印迹法（Western bloting，WB）检测坐骨神经内脑源性神经营养因子（Brainderived neurotrophic factor，BDNF）的表达。结果：移植到胫神经内的神经干细胞存活良好，并沿神经轴索间隙向周围扩散。移植后的神经干细胞未见明显Nestin阳性表达，大部分移植细胞呈GFAP阳性表达，无明显NeuN或ChAT阳性表达。腹腔注射氯化锂能显着减少移植细胞的GFAP阳性表达比例。胫神经结扎后，神经内轴突溃变明显。与未移植NSC的两组比较，NSC移植组胫神经内NF200阳性表达明显增多，联合应用氯化锂能进一步增加NF200的表达。应用氯化锂显着减少NSC移植后胫神经内的ED1表达。单纯神经干细胞移植组和单纯氯化锂组的宿主坐骨神经的BDNF表达明显上调，两者联用时BDNF表达上调更明显。结论：胫神经内移植的神经干细胞存活良好，大部分分化为GFAP阳性的胶质细胞；氯化锂处理能减少移植后的神经干细胞向胶质细胞方向的分化，神经干细胞移植联合应用氯化锂可以减少宿主神经轴突的溃变程度，抑制神经干细胞移植后的巨噬细胞浸润；上调宿主胫神经内BDNF的表达。目的：研究含有神经干细胞的胫神经移植联合氯化锂对脊髓损伤的治疗作用。方法：在大鼠胫神经内移植神经干细胞一周后，建立胸段脊髓右侧半切损伤模型，将单纯胫神经或预先移植有神经干细胞的胫神经段植入脊髓缺损区，腹腔注射氯化锂或生理盐水，术后2周、4周分别测定大鼠下肢运动功能恢复情况。术后4周用免疫荧光染色方法检测移植后神经干细胞的存活和分化情况，宿主脊髓运动神经元存活情况，移植神经段的轴突再生情况，观察宿主脊髓损伤修复和巨噬细胞浸润情况。结果：脊髓半切损伤移植胫神经后2周及4周，移植神经干细胞或采用氯化锂治疗的大鼠下肢运动恢复较好，神经干细胞移植联合应用氯化锂对脊髓损伤大鼠下肢功能恢复的促进作用更明显。移植的胫神经段与宿主脊髓整合良好，移植到胫神经内的神经干细胞存活良好。氯化锂促进移植的NSC发出轴突长入宿主脊髓，促进神经干细胞分化为NF200阳性的神经元。与单纯胫神经移植比较，神经干细胞移植和氯化锂治疗组损伤侧宿主脊髓神经元数量明显增多，移植神经段内NF200阳性神经纤维明显增多，移植部位GFAP胶质瘢痕范围较小，ED1表达也明显减少。神经干细胞移植联合氯化锂治疗组的上述各指标均高于其他各组。结论：在脊髓半切损伤后移植含有神经干细胞的胫神经或氯化锂治疗能显着促进实验大鼠下肢功能的恢复，显着减少宿主脊髓运动神经元死亡，促进轴突再生，抑制炎症反应，缩小胶质瘢痕的范围。神经干细胞移植联合联合氯化锂治疗能取得更好的治疗效果。
巴迎春[7]（2010）在《NSC移植对SCT大鼠行为改进、神经再生、NTF表达及其信号通路分子的影响》文中认为[目的]：探讨神经干细胞（NSC）脊髓内移植对脊髓全横断（SCT）损伤大鼠运动功能恢复的影响,并研究其与神经再生,神经营养因子（NTF）表达的关系,为应用NSC移植治疗SCI提供理论依据。[方法]：正常成年SD雌性大鼠85只,分为两批；第一批15只动物用于BDA条件实验,分为双侧大脑皮质注射10% BDA 0.5μL／位点,存活2w组；单侧大脑皮质注射10%BDA 1 p L/位点,存活3w组；双侧大脑皮质注射10%BDA 0.5μL/位点,存活3w组。每组各5只动物。第二批SD大鼠共70只,分为3组：①假手术组,②单纯全横断组；③神经干细胞移植组；分别对每组每只动物进行BBB评分、诱发电位CSEP和MEP、电针刺激大脑皮质运动区的测定,观察行为学,神经电生理学变化；对各组动物分别进行BDA追踪,免疫组化染色,RT-PCR检测,观察NSC移植效果,植入细胞存活,分化,宿主神经再生,神经营养因子表达,信号分子变化,以探讨NSC治疗脊髓损伤的分子机制。[结果]：1.在3组进行BDA追踪实验的大鼠中,双侧大脑皮质注射10% BDA 0.5μL/位点,存活3w组的追踪效果最好。2.通过行为学,神经电生理等指标检测,确定大鼠脊髓全横断损伤动物模型构建成功；且进一步证实脊髓神经具有可塑性。3.NSC移植后大鼠的后肢功能BBB评分优于单纯脊髓全横断组。NSC移植后大鼠的皮层体感诱发电位（CSEP）、运动诱发电位（MEP）的潜伏期短于单纯脊髓全横断大鼠。电针刺激大脑皮质运动区发现NSC移植组大鼠双后肢出现明显收缩,且以对侧更为明显。说明NSC移植能促进大鼠感觉,运动行为与神经电生理功能的部分恢复。4.BDA神经束路追踪和5-HT、CGRP免疫组化染色结果显示,损伤脊髓头侧1-3节段的纤维数量明显减少,尤其是临近疤痕的节段。但随时间进程,脊髓存在有限的神经再生。而NSC移植能明显加强这种神经再生（与单纯脊髓全横断组比较）。5.NSC移植明显下调损伤位点头侧脊髓神经生长因子TGF-betal、CNTF和促凋亡基因Bax、CASPESE-3以及相关信号分子BAD的表达；同时明显上调凋亡抑制基因BCL-2的表达；但不改变细胞周期蛋白调控基因CDK4和CyclinD1、CyclinE和BDNF的表达。[结论]：1.BDA条件实验说明,本实验中所使用的BDA示踪剂（美国Molecular Probes公司）是有效的,在双侧大脑皮质上选择多点注射,以每个位点注射0.5μL的10%BDA,注射后大鼠存活3w为最佳的BDA追踪实验方案。2.脊髓全横断模型是成功的,所使用的手术方法是可行,有效的；此外,脊髓损伤后随时间延长,CST纤维有少量再生,说明脊髓具有神经可塑性。3.NSC移植能促进宿主感觉及运动传导功能的部分恢复。4.NSC移植可能通过影响神经再生、细胞凋亡,和调节NTF及信号转导通路分子的表达水平,来实现促进脊髓修复的目的。
王涛[8]（2008）在《TLX基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究》文中研究指明TLX基因最初是作为一个“孤儿”核受体发现的,其功能不明。但近来研究结果表明,TLX基因在神经系统发育过程中具有重要意义,是维持成体干细胞增殖和成神经分化的关键基因。脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）后神经细胞再生能力不足是影响损伤脊髓功能恢复的关键,神经细胞的再生问题一直是困扰神经科学工作者的大难题。目前可用于治疗脊髓损伤的种子细胞来源主要包括:胚胎来源干细胞;来源于神经系统的具有促神经再生作用的细胞;其他具有成神经分化潜能的成体干细胞。胚胎干细胞具有分化全能性和无限增殖的能力,进行成神经诱导分化后用于脊髓损伤治疗时具有替代受损神经元、重建神经元回路的作用,但考虑到伦理学、法律学、组织相容性以及胚胎的来源等难题,其临床应用目前还受到限制。多种来源于神经系统的细胞在脊髓损伤时可作为种子细胞,具有促神经功能恢复作用,但这些细胞在成年个体中数量较少,增殖能力较为有限,并且取材困难,行自体移植时尤为明显;而进行异体移植则要面临组织相容性和免疫相斥等难题。近来多种具有成神经分化潜能的间充质干细胞在脊髓损伤中的研究受到了关注,并有望为脊髓损伤治疗提供新的种子细胞来源。因此,研究真皮多能干细胞高效定向成神经分化的机制及调控将为解决脊髓移植供体细胞来源探索新的途径。基因治疗也是一种促进脊髓损伤再生的有希望的措施,基因修饰DMSCs移植则是结合了两者的优点。为了确定TLX基因对DMSCs增殖和成神经细胞分化的影响以及TLX基因工程化DMSCs对SCI后神经再生和功能修复的影响,本文就此进行了系列研究。⑴大鼠TLX基因的克隆及含TLX基因的全长编码序列的真核表达载体的构建和表达;⑵观察大鼠TLX基因对DMSCs的增殖和成神经分化的影响;⑶将TLX基因修饰DMSCs移植到大鼠脊髓全横断模型的损伤部位,观察移植物能否促进脊髓功能的恢复,来阐明TLX基因修饰DMSCs在SCI恢复中所起的作用。希望通过移植物（TLX基因修饰DMSCs）恒定表达TLX,使移植区具有高浓度的TLX,通过TLX高效、定向诱导DMSCs分化为神经细胞,可能为SCI再生修复提供更合适的种子细胞。主要结果如下:1、利用设计合成的TLX简并引物,以成年大鼠大脑组织总RNA为模板,进行RT-PCR,我们首次成功扩增出大鼠TLX全长编码序列,序列在线BLAST发现,其与大鼠预测的TLX序列99%相似,证实扩增和克隆成功,将大鼠TLX序列登陆GeneBank,获得Gene accession number:EU316216。2、利用RT-PCR的产物,采用定向克隆的方法,先进行T/A克隆,然后成功地将TLX cDNA全长序列亚克隆到pEGFPN1真核表达载体上。在此基础上,将重组质粒pEGFPN1-TLX转染到DMSCs中,用荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达和用RT-PCR方法检测到TLXmRNA的表达,说明TLX已成功转染DMSCs并能在DMSCs中表达。3、MTT法研究显示TLX可以促进DMSCs的增殖;DMSCs经诱导后可分化成神经细胞,分化出来的细胞中,星形胶质细胞的比例较高,而神经元比例较低。TLX可以促进DMSCs向神经元方向分化,TLX/DMSCs分化出来的细胞中,与未转染TLX的DMSCs相比,神经元的比例明显增高,而星形胶质细胞比例降低。4、将DMSCs和TLX基因修饰DMSCs移植入大鼠脊髓全横断处,结果显示DMSCs和TLX基因修饰DMSCs都能在宿主脊髓内存活和整合,并使脊髓形态学结构达到部分恢复;行为学检测检测显示大鼠脊髓运动功能得到部分恢复,其中移植TLX基因修饰DMSCs使大鼠的功能恢复更好一些。综上所述,我们首次成功的地扩增出大鼠TLX基因并构建了含TLX基因全长编码序列的真核表达载体。进一步研究显示TLX基因可以促进DMSCs增殖和向神经元方向分化,抑制DMSCs向星形胶质细胞的分化;移植TLX基因修饰DMSCs可以促进大鼠脊髓损伤后功能和形态的部分恢复,表现为行为学评分明显增高、损伤区空洞和瘢痕面积缩小和通过损伤区的神经纤维数量增多,与移植单纯DMSCs相比较,移植TLX基因修饰的DMSCs治疗效果要显着一些。结果提示TLX基因可能通过提高DMSCs向神经元分化而抑制星形胶质细胞的产生、减少胶质瘢痕形成具有促进脊髓损伤后神经再生和功能重建的作用,为临床治疗脊髓损伤提供新思路。
林森[9]（2008）在《胚胎脊髓源性神经干细胞体内外诱导分化及其最佳移植时间和防止骨骼肌失神经萎缩效果的实验研究》文中研究表明臂丛神经下干以及高位正中神经和尺神经损伤后导致的手内在肌萎缩的治疗是周围神经领域的一大难题,手内肌功能的丧失实质上意味着上肢核心功能的丧失,给患者及其家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担,因此,加强基础研究、寻找有效方法防治手内在肌萎缩有着重要的理论和现实意义。近年来的研究证明,神经干细胞具有良好的组织相容性和多向分化潜能,体内移植后对神经系统损伤和疾病均具有一定的修复作用。本课题以大鼠胫神经损伤为实验动物模型,较为系统地探讨了胚胎脊髓源性神经干细胞体内外增殖分化的特点以及体内外诱导分化效果,并对基因修饰的胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩效果进行评价,而且确定了胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩的最佳移植时间。以期为临床防治骨骼肌失神经萎缩、恢复骨骼肌运动功能提供新的策略和方法。目的:（1）探讨胚胎脊髓源性神经干细胞的分离、培养、鉴定、体外增殖特点和多向分化特性。（2）观察NT3在体内外能否诱导胚胎脊髓源性神经干细胞向胆碱能神经元分化。（3）观察NT3基因修饰的胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩疗效是否更佳。（4）探讨胚胎脊髓源性神经干细胞移植防止骨骼肌失神经萎缩的最佳移植时间。方法:（1）选用孕龄14—16天SD大鼠胚胎脊髓组织,采用机械分离法获得神经干细胞,并应用无血清神经元限定性培养基进行原代和传代培养,对获得的神经干细胞进行单克隆纯化,然后进行Nestin（巢蛋白）免疫组织化学鉴定;同时将获得的神经干细胞进行体外分化,对分化细胞进行βⅢ-tubulin（βⅢ-微管蛋白）和GFAP（胶质纤维酸性蛋白）免疫组织化学鉴定。在神经干细胞增殖和分化过程中,进行细胞形态学观察。（2）选用孕龄14—16天SD大鼠胚胎脊髓组织获得神经干细胞。体外诱导分化研究:实验组在培养脊髓源性神经干细胞时,应用加入20ng/mlNT3的神经干细胞分化培养液进行诱导培养;对照组则用未加NT3的神经干细胞分化培养液进行分化培养。培养后48小时、1周及3周以ChAT和βⅢ-tubulin为标志物对分化细胞进行免疫组化分析。体内诱导分化研究:应用胫神经切断的方法建立大鼠腓肠肌失神经支配动物模型。将胫神经切断后的40只SD大鼠,随机分成2组:脊髓源性神经干细胞组（对照组）和脊髓源性神经干细胞+NT3组（实验组）,每组20只,各分为术后4、8周两个观察时间点,每个时间点10只动物。实验组将加有20ng/mlNT3的脊髓源性神经干细胞分化培养液混合悬液0.02毫升（105/μl）,应用自制微量注射器将其移植于切断胫神经远端神经外膜下,对照组则用相同方法移植未加NT3的脊髓源性神经干细胞分化培养液混合悬液0.02毫升（105/μl）于切断胫神经远端神经外膜下。于移植后4、8周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经,以ChAT和βⅢ-tubulin为标志物进行免疫组化分析。（3）选用孕龄14—16天SD大鼠胚胎脊髓组织获得神经干细胞,应用胫神经切断的方法建立大鼠腓肠肌失神经支配动物模型。构建神经营养因子-3基因慢病毒表达载体,并转染神经干细胞,转染后以RT-PCR和Westernblot检测转染效果。转染后第3,5天观察其体外分化情况。将胫神经切断后的90只SD大鼠,随机分成3组:脊髓源性神经干细胞组、脊髓源性神经干细胞+NT3组和NT3基因修饰脊髓源性神经干细胞组,每组30只,各分为术后1、4、12周三个观察时间点,每个时间点10只动物,应用自制微量注射器移植脊髓源性神经干细胞悬液0.02毫升（105/μl）至切断胫神经远端神经外膜下。于移植后1周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经,进行免疫组化分析检测神经干细胞存活;于移植后4周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经,胫神经标本以免疫组化及图像分析方法分析神经干细胞分化;于移植后12周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经以及腓肠肌并行EMG检查,胫神经标本处理方法同4周组,腓肠肌标本以HE染色及图像分析方法计算腓肠肌肌纤维横截面积。（4）选用孕龄14—16天SD大鼠胚胎脊髓组织获得神经干细胞,应用胫神经切断的方法建立大鼠腓肠肌失神经支配动物模型。将胫神经切断后的90只大SD鼠,随机分成9组,每组10只,分别于胫神经切断后0、1、2、3、4、6、8、12及16周,应用自制微量注射器移植脊髓源性神经干细胞悬液0.02毫升（105/μl）至切断胫神经远端神经外膜下,移植后4周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经以及腓肠肌。胫神经标本以免疫组化及图像分析方法计数神经元数量;腓肠肌标本以HE染色及图像分析方法计算腓肠肌肌纤维横截面积。结果:（1）采用机械分离法和无血清培养法可获得大量的神经干细胞,体外培养达两个月之久仍能保持增殖活性,单克隆培养可获得神经干细胞球,对其进行Nestin免疫细胞鉴定为阳性,证明为神经干细胞;神经干细胞体外分化细胞βⅢ-tubulin和GFAP鉴定结果为阳性,证明可分化为神经元和神经胶质细胞。（2）经NT3诱导的脊髓源性神经干细胞用细胞免疫荧光化学法鉴定,体外培养48小时、1周及3周后均可检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞且细胞数量随时间推移增加,而对照组则未检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞但可检测到βⅢ-tubulin阳性细胞然而细胞数量随时间推移减少;体内诱导后4及8周后均可检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞且细胞数量随时间推移增加,而对照组则未检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞但可检测到βⅢ-tubulin阳性细胞然而细胞数量无明显变化。（3）成功构建神经营养因子-3基因慢病毒表达载体,转染NT3基因的神经干细胞经RT-PCR可扩增出750bp大小片断,而未转染NT3基因的神经干细胞无特异性条带出现。Western blot检测到NT3基因所表达蛋白条带。移植后1周三组均可检测到GFP和Nestin阳性细胞。移植后4周NT3基因组及NT3+NSC组均可检测到GFP和ChAT阳性细胞,但后者数量少于前者（p＜0.01）,移植后12周仅NT3基因组可检测到GFP和ChAT阳性细胞,且NT3基因修饰脊髓源性神经干细胞组的组织学和电生理指标均优于其他两组（p＜0.05）。（4）胫神经切断后1周移植组,其神经元数量及腓肠肌肌纤维横截面积均优于其他组（p＜0.01）,其次为胫神经切断后6周移植组（p＜0.05）。结论:（1）应用无血清神经元限定性培养基可从胚胎脊髓组织中分离获得大量的神经干细胞,这些神经干细胞具有多向分化潜能,能够分化为神经元等多种神经终末细胞。（2）NT3在体内外均可诱导脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元。（3）以慢病毒为载体的NT3基因可成功转染胚胎脊髓源性神经干细胞。NT3基因修饰的胚胎脊髓源性神经干细胞在体内外均可存活并可在体内分化为胆碱能神经元,其防止骨骼肌失神经萎缩效果明显优于单纯神经干细胞移植组及NT3诱导的神经干细胞移植组。（4）胚胎脊髓源性神经干细胞移植防止骨骼肌失神经萎缩的最佳移植时间是损伤后1周,其次为6周。
赵宁,杨万章[10]（2007）在《神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的应用进展》文中研究指明
二、BDNF基因修饰神经干细胞移植后大鼠脊髓损伤移植处的基因表达变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、BDNF基因修饰神经干细胞移植后大鼠脊髓损伤移植处的基因表达变化（论文提纲范文）
（1）梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的效应及促神经新生作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 梓醇延迟给药对局灶性脑缺血大鼠神经行为学影响 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验主要试剂 |
| 1.1.2 实验主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 电凝法制备局灶性永久性脑缺血模型 |
| 1.2.3 药物干预 |
| 1.2.4 模型纳入标准 |
| 1.2.5 神经行为学评分 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 电凝法制备局灶性脑缺血模型 |
| 1.3.2 脑缺血损伤模型大鼠神经功能缺失 |
| 1.3.3 梓醇延迟给药对脑缺血大鼠体重的影响 |
| 1.3.4 梓醇延迟给药对脑缺血大鼠Bederson评分的影响 |
| 1.3.5 梓醇延迟给药对脑缺血大鼠肌力的影响 |
| 1.3.6 梓醇延迟给药对脑缺血大鼠mNSS评分的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 梓醇延迟给药对局灶性脑缺血大鼠缺血侧脑区神经干细胞分化作用研究 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验主要试剂与材料 |
| 2.1.2 实验主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 动物分组及药物干预 |
| 2.2.3 BrdU体内标记 |
| 2.2.4 脑组织取材 |
| 2.2.5 脑组织冰冻切片 |
| 2.2.6 免疫荧光染色 |
| 2.2.7 Western Blot检测相关蛋白表达 |
| 2.2.8 免疫荧光染色图像采集与量化分析 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 梓醇对脑缺血大鼠SVZ区神经干细胞的影响 |
| 2.3.2 梓醇对脑缺血大鼠SVZ区未成熟神经元的影响 |
| 2.3.3 梓醇对脑缺血大鼠缺血周围区成熟神经元的影响 |
| 2.3.4 梓醇对脑缺血大鼠缺血周围区星形胶质细胞的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 梓醇对离体神经干细胞分化作用研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验试剂及材料 |
| 3.1.2 实验主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 神经干细胞的分离培养 |
| 3.2.2 神经干细胞的传代培养 |
| 3.2.3 免疫荧光鉴定NSCs |
| 3.2.4 免疫荧光鉴定NSCs增殖 |
| 3.2.5 cck-8 检测NSCs细胞活力 |
| 3.2.6 免疫荧光检测细胞分化 |
| 3.2.7 WB检测细胞分化相关蛋白表达 |
| 3.2.8 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 细胞形态观察 |
| 3.3.2 神经干细胞鉴定 |
| 3.3.3 神经干细胞增殖能力测定 |
| 3.3.4 神经干细胞分化能力测定 |
| 3.3.5 梓醇对神经干细胞细胞活力影响 |
| 3.3.6 梓醇对神经干细胞分化作用影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文总结 |
| 创新点及意义 |
| 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究现状 |
| 参考文献 |
| 硕士学位期间科研工作汇报 |
| 致谢 |
| 附:中英文缩略名词对照表 |
（2）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（3）慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、慢病毒介导Shh因子转染雪旺细胞的体外研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验仪器与试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 雪旺细胞的分离培养和转染后形态学观察 |
| 1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性 |
| 1.2.3 ELISA 法检测细胞 Shh 和神经营养因子 BDNF 及 NGF 的表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 Shh因子促进雪旺细胞增殖及增强分泌活性的机制 |
| 1.3.2 Shh因子的表达及其通路在脊髓损伤中的作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、转Shh因子的雪旺细胞移植修复脊髓损伤 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验分组 |
| 2.1.3 实验仪器与试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠行为学功能评价 |
| 2.2.2 大鼠损伤后局部的轴突改变 |
| 2.2.3 大鼠损伤后局部神经干细胞的改变 |
| 2.2.4 大鼠损伤后局部少突胶质细胞的改变 |
| 2.2.5 大鼠损伤后局部星形胶质细胞的改变 |
| 2.2.6 大鼠损伤后局部白质和髓鞘的改变 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 雪旺细胞在修复脊髓损伤中的作用 |
| 2.3.2 Shh 因子联合雪旺细胞移植对损伤局部内源性神经细胞的影响 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 细胞移植在脊髓损伤中的现状与展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、LIPUS激励iPS-NSCs最佳物理参数的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验器械 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 低强度脉冲超声系统的搭建 |
| 1.1.4 iPS-NSCs传代培养及细胞鉴定 |
| 1.1.5 低强度脉冲超声激励细胞模型的建立 |
| 1.1.6 CCK-8 检测iPS-NSCs增殖活性 |
| 1.1.7 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 成功搭建低强度脉冲超声激励系统 |
| 1.2.2 iPS-NSCs细胞的形态学观察及细胞鉴定 |
| 1.2.3 LIPUS对 iPS-NSCs增殖活性的影响以及最佳激励条件的确定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 LIPUS在生物组织中的理学效应及其在骨科学中的应用 |
| 1.3.2 神经干细胞在神经系统中的起源、特点和作用 |
| 1.3.3 诱导神经干细胞的来源及诱导体系 |
| 1.3.4 LIPUS对细胞增殖的作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、在最佳生物学参数下,LIPUS优化iPS-NSCs细胞特性的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验器械 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 低强度脉冲超声系统的搭建 |
| 2.1.4 iPS-NSCs传代培养及细胞鉴定 |
| 2.1.5 低强度脉冲超声激励细胞模型的建立 |
| 2.1.6 TUNEL检测iPS-NSCs细胞凋亡的情况 |
| 2.1.7 ELISA检测iPS-NSCs细胞上清液中神经营养因子的含量 |
| 2.1.8 Western Blot检测Notch信号通路及细胞分化情况 |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞凋亡率的变化 |
| 2.2.2 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞中NTFs含量的变化 |
| 2.2.3 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞分化的情况 |
| 2.2.4 LIPUS激励iPS-NSCs后 Notch信号通路相关蛋白含量的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 LIPUS对 iPS-NSCs细胞生物特性的影响 |
| 2.3.2 LIPUS激励iPS-NSCs可能的作用机制 |
| 2.3.3 LIPUS修复神经损伤的潜力 |
| 2.4 小结 |
| 三、LIPUS介导iPS-NSCs细胞移植修复脊髓损伤的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验器械 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 脊髓损伤动物模型建立 |
| 3.1.4 细胞移植 |
| 3.1.5 BBB运动功能评分 |
| 3.1.6 脊髓标本取出及制作切片 |
| 3.1.7 石蜡切片的制备 |
| 3.1.8 HE染色 |
| 3.1.9 免疫荧光观察移植细胞在体内分化情况 |
| 3.1.10 ELISA检测测定脊髓组织内的营养因子的表达情况 |
| 3.1.11 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 HE染色结果 |
| 3.2.2 GFAP、NF200 免疫荧光染色结果 |
| 3.2.3 脊髓组织内的营养因子的表达情况 |
| 3.2.4 BBB评分结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 脊髓损伤动物模型的制备及运动功能评价指标的选择 |
| 3.3.2 NSCs在脊髓损伤修复中的作用及应用 |
| 3.3.3 多潜能干细胞在神经损伤等再生医学方面的应用 |
| 3.3.4 LIPUS介导的iPSc-NSCs修复脊髓损伤可能的作用机制 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 低强度脉冲超声在神经修复中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）HIF-1α基因及GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 序言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 胶质细胞源性神经营养因子体外转染神经干细胞的研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 附图 |
| 1.7 小结 |
| 第二部分 HIF-1α、GDNF基因修饰的神经干细胞移植在大鼠损伤脊髓内的存活和分化的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间所取得的科研成果 |
（6）带神经干细胞的周围神经移植联合氯化锂治疗大鼠脊髓损伤的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 绿色荧光蛋白转基因大鼠胚胎来源神经干细胞的分离、培养和鉴定 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第二部分 氯化锂对体外培养的神经干细胞的影响 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第三部分 氯化锂对移植到周围神经内神经干细胞的影响 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第四部分 含神经干细胞的胫神经移植联合氯化锂治疗大鼠脊髓损伤的研究 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（7）NSC移植对SCT大鼠行为改进、神经再生、NTF表达及其信号通路分子的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 BDA追踪显示皮质脊髓束的条件实验研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 大鼠脊髓全横断损伤模型建立与脊髓神经可塑性研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 神经干细胞移植促进脊髓全横断损伤大鼠功能恢复及神经再生研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 神经干细胞移植促进脊髓全横断损伤大鼠功能恢复过程中神经营养因子和相关信号分子的变化 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（8）TLX基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究（论文提纲范文）
| Abstract |
| 摘要 |
| 论文正文 TLX 基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠TLX 基因克隆及真核表达载体的构建 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TLX 对真皮多能干细胞增殖和定向成神经细胞分化的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TLX 修饰真皮多能干细胞移植治疗SCI |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述 脊髓损伤的移植治疗研究 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 英文论着 |
（9）胚胎脊髓源性神经干细胞体内外诱导分化及其最佳移植时间和防止骨骼肌失神经萎缩效果的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语注释 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| (一) 失神经骨骼肌萎缩防治的现状 |
| (二) 神经干细胞-防治骨骼肌失神经萎缩最具临床应用前景的移植细胞 |
| (三) 神经干细胞应用于骨骼肌失神经萎缩防治前景 |
| (四) NT-3和GFP相关研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胚胎脊髓源性神经干绌胞分离、培养以及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NT_3体内外诱导胚胎脊髓源性神经干细胞分化的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NT_3基因修饰胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩的实验研究 |
| 实验一 携带NT3基因慢病毒表达载体的构建及鉴定 |
| 实验二 携带NT3基因慢病毒表达载体体外转染神经干细胞及其表达的研究 |
| 实验三 NT3基因修饰神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩研究 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 胚胎脊髓源性神经干细胞移植防止骨骼肌失神经萎缩最佳移植时间的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 神经干细胞移植防止骨骼肌失神经萎缩 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的应用进展（论文提纲范文）
| 1 神经干细胞研究现状 |
| 1.1 神经干细胞移植的生物学特性 |
| 1.2 神经干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性 |
| 1.3 神经干细胞的移植来源 |
| 1.4 神经干细胞的移植途径 |
| 1.5 神经干细胞的移植时机 |
| 2 神经干细胞治疗脊髓损伤的研究现状 |
| 2.1 神经干细胞单独移植治疗脊髓损伤 |
| 2.2 神经干细胞综合移植治疗脊髓损伤 |
| 3 结 语 |
四、BDNF基因修饰神经干细胞移植后大鼠脊髓损伤移植处的基因表达变化（论文参考文献）
- [1]梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的效应及促神经新生作用研究[D]. 邵亚丽. 西南大学, 2020(05)
- [2]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [3]慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究[D]. 唐浩帅. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究[D]. 吴秋丽. 天津医科大学, 2019(02)
- [5]HIF-1α基因及GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究[D]. 陈茂华. 浙江大学, 2014(09)
- [6]带神经干细胞的周围神经移植联合氯化锂治疗大鼠脊髓损伤的研究[D]. 张立群. 福建医科大学, 2013(12)
- [7]NSC移植对SCT大鼠行为改进、神经再生、NTF表达及其信号通路分子的影响[D]. 巴迎春. 昆明医学院, 2010(08)
- [8]TLX基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究[D]. 王涛. 第三军医大学, 2008(03)
- [9]胚胎脊髓源性神经干细胞体内外诱导分化及其最佳移植时间和防止骨骼肌失神经萎缩效果的实验研究[D]. 林森. 复旦大学, 2008(06)
- [10]神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的应用进展[J]. 赵宁,杨万章. 中西医结合心脑血管病杂志, 2007(05)