一、人抗HBV-前S2抗体轻链基因的克隆及序列分析(论文文献综述)
康棣[1](2021)在《ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制》文中研究指明蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的一种由库蠓传播的严重危害反刍动物的急性非接触性传染病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须上报的动物传染病,我国将其列为一类动物疫病。BTV感染宿主细胞后被模式识别受体识别,继而激活Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)信号通路,诱导IFN-Ⅰ表达,IFN-Ⅰ能进一步激活多种信号通路的级联反应,最终导致数百种干扰素刺激基因(Interferon stimulated gene,ISG)的转录和表达,ISG与其他免疫细胞或细胞因子及抗菌肽等蛋白共同建立起宿主抗病毒免疫的第一道防线。本实验室前期的研究发现,ISG15和ISG20是BTV感染羊睾丸细胞前后表达差异较大的两种蛋白,推测其可能在BTV感染过程中发挥重要的调控作用。本研究首先发现BTV感染羊肾细胞MDOK后,ISG15的转录水平显着上调,并且呈BTV感染时间和感染复数(MOI)依赖性。提取BTV感染的MDOK细胞总RNA,RT-PCR扩增获得羊ISG15基因,构建带HA标签的ISG15基因真核表达质粒,转染MDOK细胞后接种BTV,检测不同时间点BTV的蛋白表达、转录水平和病毒滴度,结果表明,ISG15过表达能够显着促进BTV的复制,此外,利用si RNA技术敲低内源性ISG15基因的表达后,BTV复制水平显着降低。已有研究发现,ISG15能够通过C末端基序对底物蛋白进行ISG化修饰而阻止底物蛋白的泛素化和降解,本研究将ISG15 C末端序列由LRLRGG突变为LRLRAA,ISG15将无法共价结合底物蛋白完成ISG化,发现过表达突变型或野生型ISG15对BTV的复制水平的影响无显着差异,可见ISG15对BTV复制的促进作用由ISG15单体引起而不依赖ISG化。为了进一步阐明ISG15与BTV互作的机制,将ISG15分别与BTV的S1-S10基因共转染MDOK和HEK293T细胞,通过激光共聚焦和免疫共沉淀实验,筛选到4个与ISG15互作的BTV蛋白,分别为VP3、VP4、VP5和NS1。同时发现,ISG15的过表达能够促进VP4和NS1蛋白的表达,且表达丰度与ISG15转染量呈正相关。此外,实验结果表明,VP4与NS1通过泛素蛋白酶和自噬溶酶体途径降解,由于ISG化与泛素途径中的部分酶能够通用,ISG15与泛素间存在竞争关系,说明ISG15的过表达可能导致病毒蛋白泛素化修饰水平降低,从而促进了BTV增殖。BTV感染MDOK细胞后ISG20 mRNA的表达水平显着上调,且呈BTV感染时间和MOI依赖性,利用RT-PCR方法克隆获得了羊ISG20基因,序列分析显示羊ISG20与其他物种ISG20同源性较高,且DEDD外切酶家族的关键序列在各物种间高度保守。构建ISG20基因的真核表达质粒并转染MDOK细胞,感染BTV后在不同时间点收样,结果显示,过表达羊ISG20使BTV蛋白表达量、基因转录水平和病毒滴度均明显下降,显着抑制了BTV的复制,相反,利用si RNA敲低内源性ISG20基因表达后,能够促进BTV的复制水平。利用激光共聚焦和免疫共沉淀方法,发现ISG20与BTV VP4能够发生相互作用。构建外切酶活性缺失的ISG20真核表达质粒,转染MDOK细胞并接种BTV,发现BTV NS1基因的转录、蛋白表达量和病毒滴度在感染后48 h均与转染野生型ISG20的细胞产生明显差异,而VP6的转录和蛋白水平则无显着差异,这说明ISG20的核酸外切酶活性作用于BTV NS1蛋白,同时发现,突变型ISG20与VP4相互作用明显减弱,说明ISG20的酶活性位点是其与VP4蛋白的结合关键位点之一,由此可见,ISG20与VP4互作是ISG20发挥抑制BTV复制作用的重要途径之一。
韩郁茹[2](2021)在《猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定》文中指出猪急性腹泻综合征(SADS)是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)引起的一种新型猪消化道传染性疾病,于2017年初首次暴发。猪群感染后表现出典型的肠道传染病症状,是猪病防控和养猪业发展须面临的巨大难题。因此研发SADS-CoV感染的诊断试剂及疫苗防控显得尤为重要。冠状病毒核衣壳蛋白具有多种重要的生物学意义,一方面可与病毒RNA结合参与多种病毒生物学活性,另一方面其自身较高的免疫原性可使机体在感染病毒后不久就可产生大量抗体。因此冠状病毒N蛋白可作为猪场大规模疫情早期检测和诊断的理想靶抗原。本研究制备了针对SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体,并鉴定了其在不同实验室检测方法中的应用情况。首先,本研究构建了原核表达系统,以此来表达、纯化SADS-CoV N蛋白,并测定蛋白浓度。Western Blot和SDS-PAGE检测结果表明本研究获得高纯度且免疫原性良好的SADS-CoV N蛋白。其次,本研究利用已纯化好的SADS-CoV N蛋白来制备N蛋白的鼠源单克隆抗体。采用间接ELISA检测方法和有限稀释法,本研究最终获得能够稳定分泌抗SADS-CoV N蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞共5株,分别为杂交瘤细胞1A5,3E9,4C6,4H6和5D7。随后,制备腹水抗体。抗体亚类检测试剂盒鉴定结果表明这5株单克隆抗体(MAbs)的轻链均为κ链,MAbs 3E9、4C6和5D7的重链为Ig G1,MAb 4H6的重链为Ig G2a,MAb 1A5的重链为Ig G2b。间接ELISA方法检测其抗体效价,发现5株MAbs在较高稀释梯度时仍可与SADS-CoV N蛋白反应,说明抗体效价较高,具有良好的反应原性。经Western Blot检测,5株MAbs与其它猪冠状病毒均不发生反应,只与SADS-CoV发生特异性反应,且反应原性良好。接着,本研究对已制备的5株MAbs进行功能应用的验证。结果发现这5株MAbs(1A5,3E9,4C6,4H6和5D7)通过间接免疫荧光均可检测出感染Vero E6细胞的SADS-CoV。其中对MAb 3E9进行了进一步试验验证,发现该单抗可用于免疫组织化学试验来检测SADS-CoV。利用MAb 3E9还可通过免疫共沉淀试验与Vero E6细胞中的SADS-CoV反应。最后,本研究对MAbs 3E9和4C6所识别的SADS-CoV N蛋白抗原表位进行了鉴定。即利用生物信息学软件和真核表达系统,Western Blot鉴定结果表明,MAbs 3E9和4C6识别同一线性表位,即343DAPVFTPAP351。随后分析比对该区域的氨基酸序列,可看到该抗原表位序列在SADS-CoV分离株和其它SADS相关冠状病毒中高度保守,也进一步说明了MAbs 3E9和4C6识别的N蛋白抗原表位具有高度特异性。综上所述,本研究共筛选出5株针对SADS-CoV N蛋白的杂交瘤细胞并制备腹水;鉴定了这5株MAbs的亚型,检测了其免疫原性及特异性等特征;分析了它们在ELISA、IFA、IHC、Co-IP等方面的应用情况。另外,本研究鉴定了MAbs 3E9和4C6识别的N蛋白抗原表位。
张凡庆[3](2020)在《猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究》文中研究表明仔猪腹泻占新生仔猪总死亡率的50%以上,是对养猪业造成经济损失的重要疾病之一。目前临床常见的仔猪腹泻病原包括猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)。发病仔猪表现为腹泻、脱水、生长迟缓和最终死亡。PEDV和TGEV的预防措施是将疫苗免疫母猪,初生仔猪吸吮乳汁被动获得抗体。然而疫苗不能使所有母猪产生高水平乳源抗体,每头仔猪吮乳时间长短不同,很难保证仔猪都获得足够抗体抵抗病毒感染。ETEC的防控依靠抗生素,然而抗生素的大量使用容易导致ETEC产生耐药性。鉴于此,寻求有效对抗这些病原感染的新型免疫制剂显得极为重要。对于消化道病原感染,给动物口服特异性抗体或抗体衍生物是有效的防治方式。然而传统的抗体制剂存在均一性差、抗体来源与受治动物种属不同易产生免疫排斥等问题。随着生物技术的发展,基因工程抗体成为新型抗体制剂的研究热点,基因工程抗体中最具代表性的是单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)。人类医学领域有关scFv治疗疾病的研究已很成熟,兽医领域的相关研究则刚刚开始,特别是猪源性scFv的研究以及scFv防治猪腹泻病原的感染鲜有报道,而这方面的研究对猪腹泻病原体新型防治策略的研发具有重要意义。基于此,本研究构建了猪源噬菌体-scFv库,筛选了抗猪源腹泻病原体(PEDV、TGEV和ETEC)scFv,并研究了scFv的生物学特性和保护作用。研究内容包括五个方面:1猪源性抗猪腹泻重要病原体scFv的获得为了获得抗猪腹泻重要病原体scFv序列,构建了猪源噬菌体-scFv库,库容量为5.5×107 cfu/m L(VH-Linker-VLκ)和7.2×107 cfu/mL(VH-Linker-VLλ)。从库中随机挑取12个克隆测序,证实构建的库来源于猪抗体序列,具有多样性。分别以PEDV、TGEV全病毒以及提纯的ETEC K88ac菌毛作为抗原,对构建的猪源噬菌体-scFv库进行筛选,获得了3株高亲和力的抗PEDV scFv(PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35)、4株抗TGEV scFv(TZZ 14、TZZ 19、TZZ 43和TZZ 46)以及2株抗ETEC K88ac scFv(EZZ 3和EZZ 24)。将scFv序列进行原核表达及纯化,获得了具有活性的可溶性蛋白。这些猪源scFv应用于仔猪时避免了因抗体与受治动物种属不同而造成机体对抗体产生免疫排斥。2 scFv的生物学特性研究2.1抗PEDV和TGEV scFv的生物学特性研究为了研发抗PEDV和TGEV的新型scFv口服制剂,对针对PEDV和TGEV scFv的生物学特性进行研究。稳定性试验发现4℃保存时添加蛋白酶抑制剂延长了scFv的活性。亲和力试验证实这些scFv的亲和力均在107-108 M-1。分析scFv结合的病毒蛋白,发现PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35均与PEDV S蛋白的S1亚基结合,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46与TGEV S蛋白结合,TZZ 43与TGEV N蛋白结合。病毒中和实验证实上述针对S蛋白的scFv具有抗病毒效果,而且将PZZ21、PZZ 24和PZZ 35联合使用的抗病毒效果好于单个scFv,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46也显示出协同作用。分析scFv影响PEDV感染细胞的阶段,发现PZZ21、PZZ 24和PZZ 35在病毒结合细胞时发挥抗病毒作用,而在入侵阶段无作用。2.2抗ETEC K88ac菌毛scFv的生物学特性研究ETEC K88ac菌毛介导细菌对肠上皮的黏附,是引起腹泻的先决条件。细胞黏附抑制实验证实抗ETEC K88ac的scFv EZZ 3和EZZ 24能抑制ETEC黏附IPEC-J2细胞,抑制率达51.9±2.7%和46.7±2.1%,EZZ 3和EZZ 24联合使用对细菌的黏附抑制率达62.6±1.5%。进一步建立了ETEC感染小鼠的腹泻模型,使用该模型分析了EZZ 3和EZZ 24对小鼠的保护作用。结果发现,与ETEC攻毒组相比,scFv处理组小鼠感染ETEC后仅表现轻度腹泻症状,肠道结构完整。此外scFv口服不会造成小鼠组织细胞损伤,不影响小鼠生长,具有安全性。3壳聚糖纳米scFv口服制剂的研制虽然上述研究证明抗PEDV和TGEV scFv在体外中和病毒感染,抗ETEC scFv对ETEC引起的小鼠腹泻具有保护作用,但仔猪消化道环境复杂,抗体口服后可能会受到胃部酸性环境和蛋白酶影响导致疗效降低。为了提高scFv在仔猪胃肠道稳定性,本研究以羧甲基壳聚糖为原料制备了p H响应性scFv纳米口服制剂(CMCS/CS-scFv)。通过优化投入比例和反应条件,得到的CMCS/CS-scFv粒径为292±21 nm,PDI为0.24±0.12。CMCS/CS-scFv纳米制剂眼观呈光泽的乳白色,透射电镜下呈现球形,大小均一。CMCS/CS-scFv能抵抗胃酸对scFv的破坏,其释放具有p H响应性,酸性环境下少量释放,碱性环境中快速释放。此外CMCS/CS-scFv对肠道细胞和仔猪没有毒性,具有安全性。本研究为开发scFv口服制剂的新剂型提供了科学依据。4纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪病原性腹泻的保护作用研究为了验证CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护功能,首先比较了scFv和CMCS/CS-scFv对仔猪感染单一病原体的保护效果。PEDV的仔猪保护实验发现,CMCS/CS-PZZ(PZZ包括scFv PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35)和PZZ灌服后对仔猪感染PEDV具有保护作用,而且CMCS/CS-PZZ处理后仔猪的腹泻指数显着低于口服PZZ(p<0.05),显示出更好的保护效果。TGEV动物实验也证实CMCS/CS-TZZ(TZZ包括scFv TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46)处理组对仔猪腹泻的保护效果好于TZZ处理组,粪便病毒载量显着低于TZZ处理组(p<0.05)。ETEC动物实验证实CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC提供保护,而且CMCS/CS-EZZ口服后保护效果好于EZZ。针对仔猪腹泻往往是多个病原混合感染,将CMCS/CS-scFv(包括PZZ、TZZ、EZZ)联合应用,发现CMCS/CS-scFv灌胃后粪便中病毒粒子和细菌数量显着低于攻毒组(p<0.05),存活率高于攻毒组,说明CMCS/CS-scFv联合应用对病原混合感染具有保护效果,为临床大规模应用和制剂优化奠定了基础。5分泌表达scFv的乳酸乳球菌对仔猪病原性腹泻的保护作用研究scFv治疗仔猪腹泻时,其在肠道存留时间越长效果越好,为了使scFv在肠道持续释放,受乳酸菌活载体疫苗的启发,将抗猪腹泻病原体scFv与乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)表达系统结合,构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv(scFv包括PZZ 21、TZZ 19和EZZ 3)。体外实验测定了重组L.lactis-scFv的酸碱耐受性,体内实验证实重组L.lactis-scFv靶向定殖在仔猪肠道黏膜并分泌scFv。细胞保护实验证实了分泌的抗病毒scFv对PEDV、TGEV的中和效果,抗K88ac scFv对ETEC黏附细胞的抑制作用。动物保护实验证实重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原产生保护作用,PEDV、TGEV或ETEC感染引起的腹泻症状减轻。本研究为治疗仔猪腹泻的新型scFv口服投递系统研发提供了科学依据。综上所述,本研究首先构建了猪源噬菌体-scFv库,从中筛选到具有活性的抗PEDV、TGEV和ETEC K88ac scFv;然后通过细胞实验分析了抗PEDV和TGEV scFv结合的病毒蛋白及中和病毒作用,细胞黏附抑制实验和小鼠保护实验证实了抗ETEC K88ac scFv防治腹泻的功能;进一步研制了抵抗胃部酸性环境和蛋白酶的纳米口服制剂CMCS/CS-scFv,增加了scFv口服稳定性;仔猪保护实验证实了scFv和CMCS/CS-scFv对PEDV、TGEV和ETEC引起的仔猪腹泻均具有保护作用,并且口服CMCS/CS-scFv具有比scFv更好的保护效果;将CMCS/CS-scFv联合应用,证实对仔猪腹泻病原混合感染提供保护;构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv,证实了重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原体具有良好的保护作用。本研究为仔猪腹泻病原的防治探索了新的途径,也为其它动物疫病的抗体制剂防治提供了有益借鉴。
夏静[4](2019)在《丙型肝炎(HCV)广谱中和抗体表位分析和作用机制研究》文中指出丙型肝炎(HCV)感染是一个全球性健康问题,全球范围共有7100万人感染了HCV。80%的患者急性感染后转化为潜伏感染,随着时间的推移,逐渐转变为肝硬化和肝癌。目前,HCV是唯一一种疫苗尚未商业化的肝炎病毒,尽管目前高效的直接抗病毒在HCV治疗方面取得了重要的进展,小分子药疗法会因出现耐药株(RAV)而治疗失败,并且直接抗病毒药物因其昂贵的售价,使得发展中国家的病人对其望而却步。更重要的是,尽管治愈,再次感染依旧会发生。世界卫生组织(WHO)计划在2030年内将HCV新感染患者人数降低90%,所以,一个有效的预防性疫苗对于对抗全球HCV流行至关重要。诱导出能与病毒包膜糖蛋白结合的广谱中和抗体是HCV疫苗研究的主要目标。因此,对于自然感染患者中的广谱中和抗体研究是必不可少的。我们从一个慢性丙肝感染患者体内分离出一株能与HCV包膜糖蛋白E2结合的人源抗体,命名为8D6。这株抗体展示出广谱中和抗体活性,即能中和细胞培养产生的所有亚型的HCV病毒颗粒(HCVcc)。通过功能和表位分析,我们发现8D6可以通过靶向E2保守区域进而阻断E2和受体CD81的结合。更重要的是,8D6对直接抗病毒药物(Direct-acting antiviral reagents,DAA)耐药毒株也显示出了广谱中和活性。随后,我们对抗体序列进行分析时发现,8D6 CDRH3区域上存在一个二硫键桥基序(C-C),并且在二硫键桥中恒定存在4个氨基酸(CX4C),进一步研究发现,该二硫键桥一旦发生突变,抗体的广谱中和活性会大大降低,甚至丧失。并且这一基序在一类抗体之中都是保守的,说明抗体广谱中和活性的获得与二硫键桥息息相关。最后,我们重建了8D6推测的胚系(iGL)抗体基因并测试其与HCVcc的结合能力和中和活性,并从中找到了一个1b亚型的毒株PR79L9,8D6胚系抗体可以对PR79L9毒株产生很强的中和效果。这暗示了PR79L9毒株的E2序列可以作为疫苗抗原设计来诱导产生类似8D6的广谱中和抗体(bNAbs)。总之,我们发现了一个新的结合E2保守区的广谱中和抗体8D6,并且其胚系抗体可以作为一种潜在HCV疫苗株的探针。
焦茜[5](2019)在《单克隆抗体KM113生物学活性检测及质量标准研究》文中指出单克隆抗体药物生物学活性检测项目是抗体质量控制中的一个关键指标。生物学活性与药效密切相关,为产品的有效和质量可控提供了重要保障。KM113抗体是由北京康明百奥新药研发有限公司研制的阿达木单抗生物类似药,建立KM113抗体生物学活性(结合活性和体外细胞生物学活性)方法及企业质量内控标准对该公司KM113成品的临床申报具有重要意义。本研究以KM113抗体(CKP-A20150704)为对照品,运用间接ELISA(酶联免疫吸附)法和细胞毒性法测定其生物学活性。通过对ELISA法和对细胞毒性法的建立及优化,并对以上两种方法的专属性、重复性、中间精密度和准确度进行验证,确定了KM113抗体生物学活性的检测方法。运用两种活性方法对三批KM113样品、三批市售生物类似药和三批KM113长期稳定性样品进行测定,依据中国药典单抗类产品质量标准及样品的测定结果,最终建立了 KM113生物学活性的质量标准。首先,建立了KM113单抗在两个活性方法,两种方法均存在明显的量效关系,且四参数方程R2均大于0.95。结合活性中,重复试验EC50平均值为(82.83±7.04)ng/ml,其RSD为8.50%,准确度验证的相对效价分别为(83.74±1.09)%和(120.43±4.04)%,对应的回收率分别为(104.68±1.36)%和(100.36±3.37)%,其RSD均小于 10%;细胞生物学活性中,重复试验IC50平均值为(27.63±1.73)ng/ml,其RSD为6.29%;中间精密度的IC50平均值分别为(27.57±0.12)ng/ml和(25.40± 1.59)ng/ml,其RSD为0.42%和6.25%,准确度验证的相对效价分别为(85.83±3.63)%和(115.90±2.93)%,对应的回收率分别为(107.29±4.54)%和(96.58±2.44)%,RSD均不大于10%。其次,对同一市售生物类似产品和对照品进行的三次平行实验,得到市售产品相对结合活性平均值为(96.67±7.64)%,RSD为7.90%,市售产品细胞生物学活性平均值为(101.00±7.21)%,RSD为7.14%;对三批次的KM113抗体和三批次的市售产品进行相对结合活性检测平均值为(98.97±4.09)%和(104.63±7.02)%,RSD为4.13%和6.71%,生物学活性平均值为(98.33±2.08)%和(93.00±2.65)%,RSD为2.12%和2.84%。依据检测结果和中国药典收录单抗质量标准,制定了生物学活性质量标准,即供试品相对结合活性应为对照品的70~130%,供试品细胞生物学活性应为对照品的 70~130%。本研究成功建立了KM113抗体的结合活性和体外细胞生物学活性的测定方法,并证明该方法的专属性强,精密度良好,准确度较高,为KM113样品生物学活性检测提供了切实可行的方法。通过样品活性分析结果成功建立了生物学活性的质量标准。
张帆[6](2019)在《中国猕猴浆母细胞的表型鉴定及其在筛选流感特异性抗体中的应用》文中进行了进一步梳理猕猴(macaca mulatta)是与人类更接近的动物物种,通常用作评估疫苗,同时也可以用于克隆与人源抗体高度相同的单克隆抗体。浆母细胞在人体中定义明确且易于分离,但仍不清楚是否可以将人的浆母细胞表型标记用于分离中国猕猴的浆母细胞。在本研究中,我们评估了一系列细胞表面和细胞内标记,并将中国猕猴浆母细胞的表型鉴定为CD3-CD14-CD56-CD19-CD27-CD20-/lowCD80+HLA-DR+CD95+。中国猕猴在接种流感病毒疫苗后,外周血单核细胞(PBMC)中的浆母细胞瞬时增加,在加强免疫接种后第4-7天达到高峰,并在第14天恢复到检测不到的水平。抗原特异性Elispot检测证实了分泌的流感特异性抗体来自这些浆母细胞。中国猕猴浆母细胞与人类浆母细胞相比,二者具有类似的转录特征。使用免疫球蛋白重链和轻链引物的单细胞PCR,可以在疫苗接种后第4-7天从中国猕猴CD3-CD14-CD56-CD19-CD27-CD20-.lowCD80+HLA-DR+CD95+浆母细胞克隆流感特异性单克隆抗体。我们的工作定义了用于分离抗体分泌的中国猕猴浆母细胞的表型标记,并且对于评估疫苗接种诱导的浆母细胞应答以及使用中国猕猴快速有效地克隆单克隆抗体具有重要意义。
周兵[7](2018)在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中研究指明感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植(常用噬菌体展示等抗体库技术)、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:(1)FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;(2)有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;(3)还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;(4)最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒(Flu-B)的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒(RSV)的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白(HBsAg)上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker(Gly4Ser)3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
费忠伟[8](2018)在《靶向TGF-β1的治疗性基因重组抗体药物研发及表征》文中指出TGF-β(transforming growth factors-β,转化生长因子TGF-β)在肿瘤的发生以及发展过程中的作用极其复杂。体细胞基因突变所导致的对TGF-β的抑制增殖作用的破坏,是恶性肿瘤形成的关键因素。随之而来的是,这种对于TGF-β抑制增殖作用的脱敏,常常导致肿瘤细胞以及被招募到肿瘤微环境的正常细胞大量表达TGF-β细胞因子。有研究表明,在肿瘤微环境下一定浓度的TGF-β细胞因子会促进肿瘤生长以及转移的发生。因此,选择性抑制肿瘤细胞周围的表达上调的TGF-β,逐渐成为治疗TGF-β相关疾病的热门治疗策略。大量实验证据表明,在小鼠移植瘤模型中,使用靶向TGF-β的特异性抗体药物、可溶性受体以及针对TGF-β信号转导通路的小分子抑制剂可有效抑制肿瘤生长。在本研究中,我们基于已经披露部分信息的两个抗体:一个是R&D公司的杂交瘤来源的1D11工具抗体;另一个是Eli Lilly公司的LY-2382770人源化抗体,来开发出具有独立知识产权的能有效结合hTGF-β1的单抗药物先导分子,验证它的抗肿瘤效果,并最终用于下一步与PD-1单抗组建双功能抗体或联合用药。在比较两个抗体的生物活性以及理化特性之后,我们发现1D11抗体的亲和力以及生物学活性均显着低于LY-2382770抗体,而且两者结合的抗原表位近似,但后者却存在热力学稳定性方面的不足。在综合考虑各方面因素以后,我们选择Eli Lilly公司的LY-2382770抗体作为抗体工程改造的优选分子。其次,考虑到抗体的Vh(重链可变区)基因在抗原识别的特异性方面占据主导作用,为了降低改造单抗对于TGF-β抗原的特异性识别能力的削弱,并且同时进行热稳定性改造,我们只对LY-2382770单抗进行轻链替换,并借此寻找热稳定性提高的突变体。实验结果表明,使用轻链替换能有效的提高抗体的热稳定性以及表达量,改善抗体的聚集情况,并且对抗体自身的亲和力不会产生明显的影响。配合使用亲和力成熟的方法可以弥补亲和力的降低,联合使用这两种方法可以加速先导分子的研发速度和研发效率。
沈晨光[9](2018)在《乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究》文中研究表明季节性流感主要由乙型流感病毒和甲型流感病毒引起,流感的季节性流行每年在全球范围内造成大量的重症和死亡病例,可在局部范围内暴发疫情的乙型流感,约占流感总发病率的25%左右,其对人类健康造成的危害不容忽视。由于病毒种类的多样性和病毒表面抗原的高变性,当今流感疫苗和抗病毒药物对乙型流感的防治效果均不理想,研制乙型流感新型特效药物和疫苗意义重大。流感表面血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白为流感病毒包膜上最主要的膜蛋白,存在包括病毒受体结合位点(Receptor binding site,RBS)在内的多个病毒生命周期中必需的功能区,可诱导宿主产生多种类型的保护性抗体,是新型广谱抗流感药物和疫苗研究的主要靶蛋白。近几年来,流感HA广谱抗体的研发和广谱表位的鉴定,为流感高效抗病毒药物及疫苗的研制带来了新希望。研究显示,乙型流感HA蛋白RBS区存在广谱中和表位,但当前的乙型流感疫苗并不能诱导机体产生针对两种病毒亚系的广谱中和抗体。因此,乙型流感RBS区广谱中和表位是否较普遍存在,何种免疫方式能够刺激此类广谱表位在机体高效诱导跨亚系广谱中和抗体,识别RBS区保守表位的跨亚系中和抗体通过何种机制发挥抗病毒作用等科学问题均值得深入研究。本研究尝试了多种乙型流感RBS区广谱抗体诱导策略,通过活毒滴鼻序贯免疫策略,制备出一株IgG亚型的乙型流感RBS区广谱中和抗体C12G6。C12G6识别病毒RBS区高度保守表位,同已报道的乙型流感HA广谱单抗相比,具更优的体外抗病毒活性,为第一株发现的对Yamagata和Victoria亚系乙型流感均具血凝抑制(Hemagglutination Inhibition,HI)活性的抗体。在小鼠和雪貂动物保护模型中,C12G6显示出良好的体内抗病毒效果,具备一定的晚期抗病毒疗效,保护活性优于已报道的其他广谱中和单抗和流感抗病毒药物“达菲”,并同“达菲”联合使用具协同抗病毒效果。Cl2G6所具备的多种高效抗病毒机制解释了其良好的体内外抗病毒活性的原因,其可通过直接抑制病毒感染细胞、抑制病毒子代释放、抑制病毒基因组释放、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(CDC)协同抑制病毒,值得关注的是,C12G6为目前发现的抗病毒机制最多样化的流感广谱抗体。乙型流感病毒不断变异,C12G6虽具备良好的抗病毒反应性,但其逃逸突变病毒株仍随时可能进化产生,开发由多种类型乙型流感广谱单抗联合组成的抗病毒鸡尾酒药物,可大大降低因病毒逃逸突变使药物失效的风险。为诱导不同类型的乙型流感RBS区广谱中和单抗,本研究发现,对于乙型流感活毒滴鼻免疫,IgM亚型抗体含量高的免疫初期血清,其抗病毒反应谱强于IgG亚型抗体含量高的免疫后期血清,提示IgM亚型抗体可能具备更为广谱的抗病毒反应性。据此,本研究制备出数株具高效效抗病毒活性的乙型流感RBS区广谱中和单抗,其中抗病毒活性最优的IgM亚型RBS区广谱抗体C7G6-IgM,可高效抑制所有测试病毒对细胞的感染,其体外抗病毒谱和活性均大大优于包括C12G6在内的本研究中的和已报道的所有乙型流感HA广谱中和抗体,并在小鼠和雪貂动物模型上显示出了良好的抗病毒保护活性。上述研究结果表明,乙型流感病毒RBS区确实存在跨亚系广谱表位,但常规的免疫策略很难激发机体产生针对此类表位的有效应答,活毒滴鼻序贯免疫策略是诱导此类表位产生应答的有效手段,为乙型流感通用疫苗的设计提供重要科学依据;本研究筛选到针对乙型流感RBS表位区的多个广谱中和单抗,证明识别乙型流感RBS区广谱中和单抗具备多种抗病毒作用机制,为乙型流感新型抗病毒药物的研制提供科学依据;本研究还发现识别乙型流感RBS区特定表位的IgM亚型抗体,可高效抑制多亚系病毒感染细胞,提示IgM亚型抗体的研究可为高变异病原体提供新的防控手段。
刘冬兰[10](2017)在《人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库的构建及筛选》文中研究表明【目的】构建人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库,筛选人源抗3型、7型腺病毒中和活性抗体。【方法】从含有抗3型和7型腺病毒高中和效价(﹥1:1000)抗体的志愿者全血中分离外周血单个核细胞(PBMC),提取总RNA后经逆转录PCR(RT-PCR)制备c DNA,然后以cDNA为模板分别扩增抗体轻链、重链可变区序列,再以pComb3噬菌体质粒为模板分别扩增轻链恒定区(Cκ/λ)和重链恒定区(CH1),将轻链可变区和轻链恒定区进行重叠延伸PCR(SOE-PCR),重链可变区和重链恒定区进行SOE-PCR,分别形成κ/λ轻链和Fd重链,再以κ/λ轻链和Fd重链为模板进行SOE-PCR,最终形成完整的Fab基因,Fab基因连接至p Comb3噬菌体质粒中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7进行超感染,构建人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库。以纯化的3型、7型腺病毒完整病毒颗粒作为抗原进行亲和筛选,经过4轮筛选,富集特异性结合抗3型、7型腺病毒噬菌体抗体。化学发光酶免分析法(CLEIA)鉴定每一轮筛选后的总噬菌体以及第四轮筛选后的噬菌体单克隆,同时对获得的阳性克隆进行型别(Adv14、Adv55)特异性检测。获得的阳性单克隆进行DNA测序,然后将抗体序列IMGT/V-QUEST数据库中进行抗体序列分析,确定其CDR区和重轻链型别。从阳性克隆中提取质粒Pcomb3-Fab作为模板,分别扩增特异性轻链、重链可变区基因,并利用同源重组方法分别将轻、重链可变区基因克隆至真核表达载体Igk和IgH。共转染293T细胞进行瞬时表达,转染72h后收取细胞上清先用化学发光酶免分析法(CLEIA)、SDS-PAGE鉴定抗体的表达,然后再用CLEIA鉴定与腺病毒的结合活性。【结果】由于轻链的不同,分别构建了容量为3.0×109(轻链是κ)和1.8×109(轻链是λ)的抗3型、7型腺病毒的Fab噬菌体抗体库,Fab(Κ)和Fab(λ)基因插入率均接近100%。用纯化的3型腺病毒颗粒作为抗原从Fab库中筛选抗体,未筛选到与3型腺病毒特异性结合的阳性克隆;用纯化的7型腺病毒颗粒作为抗原从Fab库中筛选抗体,获得了4株与7型腺病毒特异性结合的阳性克隆,分别是5C、5D、9F、9H,型别特异性检测表明4株阳性克隆与3型、14型、55型腺病毒也有结合活性。阳性克隆进行DNA测序后在IMGT/V-QUEST数据库中进行分析比对,结果显示4株克隆序列各不相同,其中5C、9H的轻链型别是Κ,5D、9F的轻链型别是λ。4株阳性克隆的重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。5C、9H的Κ轻链可变区成功克隆入Igκ,5C、9F和9H重链可变区成功克隆入Ig H,2条轻链和3条重链组合成6个抗体,并在293T细胞表达。表达的细胞上清经CLEIA鉴定,6个抗体均得到表达,其中抗体组合2和组合5表达量相对较好,CLEIA鉴定结果显示与Adv7有结合活性。表达量相对较好的上清经SDS-PAGE鉴定,在还原和非还原状态下均未见目的条带,说明抗体表达量较低。全抗体型别特异性检测结果表明,表达量较好的抗体组合2和组合5与Adv3、Adv14、Adv55也有结合活性。【结论】成功构建了全人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库,筛选到4株与7型腺病毒特异性结合的抗体,并且抗体与3型、14型、55型腺病毒有结合活性。抗体序列转染293T细胞进行全抗体表达,由于抗体表达量较低,抗体活性需要进一步验证。本研究对抗腺病毒噬菌体抗体库的建立和筛选进行了各方面的探索,为未来抗3型、7型腺病毒治疗性抗体的研发提供参考和借鉴。
二、人抗HBV-前S2抗体轻链基因的克隆及序列分析(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人抗HBV-前S2抗体轻链基因的克隆及序列分析(论文提纲范文)
(1)ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 绪论 |
1.1 蓝舌病概述 |
1.2 蓝舌病病毒研究进展 |
1.2.1 BTV的结构特征 |
1.2.2 BTV编码蛋白的功能 |
1.2.3 BTV的复制过程 |
1.3 蓝舌病病毒与先天免疫 |
1.3.1 ISG概述 |
1.3.2 ISG对干扰素通路的调节 |
1.3.3 ISG对病毒增殖的影响 |
1.3.4 ISG15 与病毒感染研究进展 |
1.3.5 ISG20 与病毒感染研究进展 |
1.4 本研究的目的与意义 |
第二章 ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 实验材料 |
2.1.1.1 细胞与毒株 |
2.1.1.2 菌株与质粒 |
2.1.1.3 细胞培养相关材料 |
2.1.1.4 荧光定量PCR相关材料 |
2.1.1.5 质粒构建相关试剂及溶液配制 |
2.1.1.6 细胞转染及RNA干扰相关试剂 |
2.1.1.7 免疫印迹相关试剂及溶液配制 |
2.1.1.8 激光共聚焦相关试剂及溶液的配制 |
2.1.1.9 抗体 |
2.1.1.10 分子生物学软件及数据分析 |
2.1.1.11 其他试剂材料 |
2.1.2 实验方法 |
2.1.2.1 细胞制备及培养相关实验 |
2.1.2.2 BTV感染细胞及总RNA提取 |
2.1.2.3 反转录及荧光定量PCR |
2.1.2.4 基因克隆 |
2.1.2.5 真核表达质粒的构建 |
2.1.2.6 基因的过表达及RNA干扰实验 |
2.1.2.7 免疫印迹 |
2.1.2.8 相对荧光定量PCR实验 |
2.1.2.9 噬斑试验 |
2.1.2.10 间接免疫荧光实验 |
2.1.2.11 免疫共沉淀 |
2.1.2.12 统计学方法 |
2.2 结果 |
2.2.1 真核表达质粒的构建与鉴定 |
2.2.2 ISG15对BTV复制作用的机制研究 |
2.2.2.1 BTV感染刺激ISG15 转录水平升高 |
2.2.2.2 ISG15 单体过表达促进BTV复制 |
2.2.2.3 干扰内源性ISG15 抑制 BTV复制 |
2.2.2.4 ISG15 与病毒蛋白的共定位及相互作用 |
2.2.2.5 ISG15 促进VP4和NS1 蛋白的表达 |
2.2.2.6 过表达ISG15 提高VP4和NS1 蛋白的稳定性 |
2.2.2.7 泛素蛋白酶体和自噬溶酶体途径参与VP4 和NS1 的降解 |
2.2.3 ISG20对BTV复制作用的机制研究 |
2.2.3.1 BTV感染刺激ISG20 转录 |
2.2.3.2 ISG20 基因的克隆及序列分析 |
2.2.3.3 过表达ISG20 抑制BTV增殖 |
2.2.3.4 干扰内源性ISG20 促进BTV复制 |
2.2.3.5 ISG20 与病毒蛋白的共定位及互作分析 |
2.2.3.6 突变型ISG20对BTV复制的抑制作用 |
2.3 讨论 |
2.3.1 ISG15对BTV复制作用及机制研究 |
2.3.2 ISG20 抑制BTV增殖及机制研究 |
第三章 全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(2)猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 绪论 |
1.1 猪急性腹泻综合征概述 |
1.1.1 流行病学 |
1.1.2 临床症状及病理变化 |
1.1.3 基因组结构及功能 |
1.1.4 诊断与防控 |
1.2 抗体 |
1.2.1 单克隆抗体 |
1.3 抗原表位研究进展 |
1.3.1 B细胞抗原表位研究方法 |
1.3.2 T细胞抗原表位研究方法 |
1.4 研究目的与意义 |
第二章 SADS-CoV N蛋白的基因克隆、表达及纯化 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 病毒株、菌株 |
2.1.2 主要试剂及配制 |
2.1.3 主要仪器和设备 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 SADS-CoV N蛋白原核表达重组质粒的构建 |
2.2.2 SADS-CoV N蛋白的表达、鉴定及纯化 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 SADS-CoV N蛋白基因扩增 |
2.3.2 重组质粒的鉴定 |
2.3.3 N蛋白的原核表达及纯化 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 SADS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 细胞系和实验动物 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 相关溶液的配制 |
3.1.4 主要仪器设备 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 小鼠免疫 |
3.2.2 间接ELISA检测方法的建立 |
3.2.3 细胞融合 |
3.2.4 阳性杂交瘤的筛选和克隆 |
3.2.5 阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
3.2.6 单克隆抗体腹水的制备以及抗体效价的测定 |
3.2.7 杂交瘤细胞及MAbs特性的鉴定 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 间接ELISA检测方法的建立 |
3.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
3.3.3 MAbs亚类的鉴定 |
3.3.4 MAbs抗体效价检测 |
3.3.5 MAbs反应原性检测 |
3.3.6 MAbs特异性检测 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 SADS-CoV N蛋白单克隆抗体的功能验证 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 病毒株、菌株、细胞株 |
4.1.2 主要试剂 |
4.1.3 主要仪器及设备 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 间接免疫荧光 |
4.2.2 免疫组织化学染色 |
4.2.3 亚细胞定位试验 |
4.2.4 免疫共沉淀实验 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 抗SADS-CoV N蛋白间接免疫荧光检测 |
4.3.2 免疫组织化学染色 |
4.3.3 亚细胞定位实验 |
4.3.4 免疫共沉淀实验 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 SADS-CoV N蛋白单克隆抗体的抗原表位的鉴定 |
5.1 实验材料及方法 |
5.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒 |
5.1.2 主要试剂 |
5.1.3 主要仪器 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 SADS-CoV N蛋白短肽设计 |
5.2.2 抗原表位的初步鉴定 |
5.2.3 抗原表位的精确定位 |
5.2.4 抗原表位的保守性分析和特异性分析 |
5.3 实验结果 |
5.3.1 N蛋白的抗原表位短肽设计 |
5.3.2 N蛋白的截短表达及表位筛选 |
5.3.3 N蛋白抗原表位的保守性和特异性分析 |
5.4 讨论 |
5.5 小结 |
第六章 全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(3)猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
符号说明 |
第一章 文献综述 |
1 仔猪腹泻的防治研究进展 |
1.1 PEDV的防治研究进展 |
1.2 TGEV的防治研究进展 |
1.3 ETEC的防治研究进展 |
2 scFv及噬菌体展示技术 |
2.1 抗体简介 |
2.2 scFv的分子结构 |
2.3 scFv的表达 |
2.4 scFv的筛选方法 |
2.5 scFv的应用 |
3 壳聚糖纳米制剂药物口服递送系统概述 |
3.1 口服治疗与纳米技术 |
3.2 壳聚糖 |
3.3 壳聚糖的改性 |
3.4 壳聚糖纳米药物载体制备方法 |
3.5 壳聚糖纳米制剂在生物医学领域的应用 |
4 乳酸菌作为口服递送载体的研究进展 |
4.1 LAB |
4.2 LAB载体系统 |
4.3 NICE表达系统 |
4.4 LAB的表达形式 |
4.5 LAB表达系统的应用 |
5 研究目的与意义 |
第二章 猪源噬菌体-scFv库的构建和抗猪腹泻重要病原体scFv的筛选鉴定 |
1 材料 |
1.1 质粒、细胞和菌株 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要溶液 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 猪抗体水平检测 |
2.2 外周血淋巴细胞的分离 |
2.3 cDNA的合成 |
2.4 猪源scFv基因的扩增 |
2.5 猪源噬菌体-scFv库的构建 |
2.6 猪源噬菌体-scFv库的鉴定 |
2.7 PEDV和 TGEV全病毒抗原的制备 |
2.8 ETEC菌毛抗原的提取 |
2.9 M13KO7 辅助噬菌体的扩增 |
2.10 猪源噬菌体-scFv的富集筛选 |
2.11 噬菌体ELISA |
2.12 重组scFv蛋白的表达及纯化 |
2.13 免疫印迹 |
3 结果 |
3.1 猪抗体水平检测 |
3.2 scFv的获得 |
3.3 猪源噬菌体-scFv库的构建和鉴定 |
3.4 病毒的浓缩纯化 |
3.5 ETEC K88ac菌毛的纯化 |
3.6 猪源噬菌体-scFv的筛选鉴定 |
3.7 噬菌体ELISA鉴定 |
3.8 scFv的序列分析与纯化 |
4 讨论 |
5 本章小结 |
第三章 抗猪腹泻重要病原体scFv的生物学功能研究 |
1 材料 |
1.1 质粒、细胞和毒株 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要溶液 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 抗PEDV和 TGEV scFv的特性分析 |
2.2 真核表达质粒的构建 |
2.3 细胞转染 |
2.4 间接免疫荧光 |
2.5 细胞样品处理 |
2.6 病毒滴度的测定 |
2.7 scFv中和实验 |
2.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
2.9 抗K88ac菌毛多克隆抗体的制备 |
2.10 黏附实验和黏附抑制实验 |
2.11 IPEC-J2 细胞的细胞因子测定 |
2.12 ETEC感染小鼠腹泻模型的建立 |
2.13 抗k88ac scFv对感染ETEC小鼠的保护作用研究 |
2.14 小鼠细胞因子水平的检测 |
2.15 小鼠肠道病理切片制作及HE染色 |
2.16 小鼠肠道病理形态的定量分析 |
3 结果 |
3.1 scFv的特异性实验 |
3.2 scFv的稳定性分析 |
3.3 scFv的亲和力分析 |
3.4 scFv的抗原结合位点分析 |
3.5 scFv的细胞毒性实验 |
3.6 scFv与病毒蛋白的结合 |
3.7 scFv的抗病毒作用分析 |
3.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
3.9 多克隆抗体ELISA效价检测 |
3.10 scFv对 ETEC黏附细胞的抑制作用分析 |
3.11 scFv对 ETEC诱导细胞因子表达的影响 |
3.12 小鼠腹泻模型的建立 |
3.13 scFv对小鼠腹泻的保护作用研究 |
4 讨论 |
5 本章小结 |
第四章 壳聚糖纳米口服scFv制剂及其生物学特性研究 |
1 材料 |
1.1 细胞和实验动物 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要溶液 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 CMCS纳米制剂的制备 |
2.2 表征分析 |
2.3 纳米制剂的包封率及载药量的测定 |
2.4 scFv在纳米制剂中的完整性 |
2.5 纳米制剂在模拟胃酸环境中的稳定性 |
2.6 scFv释放实验 |
2.7 纳米制剂的生物安全性实验 |
3 结果 |
3.1 CMCS的制备 |
3.2 纳米制剂的表征 |
3.3 载药率与包封率 |
3.4 scFv在纳米材料中的完整性 |
3.5 scFv在模拟胃酸环境中的稳定性 |
3.6 scFv的释放实验 |
3.7 纳米制剂的生物安全性 |
4 讨论 |
5 本章小结 |
第五章 scFv纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护作用研究 |
1 材料 |
1.1 菌株和实验动物 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要溶液 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 scFv的纯化制备 |
2.2 CMCS/CS-scFv和 scFv的口服鉴定 |
2.3 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用研究 |
2.4 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用研究 |
2.5 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用研究 |
2.6 scFv纳米制剂联合使用对仔猪感染腹泻病原的保护作用研究 |
3 结果 |
3.1 口服CMCS/CS-scFv和 scFv在肠道的分布 |
3.2 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用 |
3.3 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用 |
3.4 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用 |
3.5 纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对腹泻病原体混合感染的保护作用 |
4 讨论 |
5 本章小结 |
第六章 分泌表达scFv的乳酸乳球菌制备及其保护功能研究 |
1 材料 |
1.1 菌株、细胞和实验动物 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要溶液 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 分泌表达scFv 的重组L.lactis-scFv 的构建 |
2.2 L.lactis电转化感受态细胞制备 |
2.3 L.lactis的电转化 |
2.4 重组L.lactis-scFv对模拟胃肠道环境的耐受性及生长曲线 |
2.5 重组L.lactis-scFv对 IPEC-J2 细胞的黏附 |
2.6 重组L.lactis-scFv对仔猪肠道的黏附 |
2.7 重组L.lactis-scFv的诱导表达 |
2.8 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能分析 |
2.9 重组L.lactis-scFv分泌scFv的动物保护功能分析 |
3 结果 |
3.1 scFv分泌表达载体的构建 |
3.2 重组L.lactis-scFv的生长特性 |
3.3 重组L.lactis-scFv的黏附特性 |
3.4 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能鉴定 |
3.5 重组L.lactis-scFv的动物保护作用鉴定 |
4 讨论 |
5 本章小结 |
全文总结 |
创新点 |
展望 |
参考文献 |
附录 |
附录一 常用溶液的配制 |
附录二 补充图 |
附录三 补充表 |
致谢 |
攻读博士学位期间发表的论文 |
授权的发明专利 |
(4)丙型肝炎(HCV)广谱中和抗体表位分析和作用机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 引言 |
1.1 HCV流行病学 |
1.2 HCV基因组分子生物学特征 |
1.3 HCV研究模型 |
1.3.1 细胞培养模型 |
1.3.2 动物模型 |
1.4 HCV生命周期 |
1.5 HCV预防和治疗手段 |
1.5.1 HCV的 DAA治疗 |
1.5.2 HCV的抗体治疗和预防 |
1.6 HCV广谱中和抗体诱导对疫苗设计的启示 |
1.6.1 E1/E2 包膜糖蛋白诱导产生广谱中和抗体 |
1.6.2 HCV胚系抗体对疫苗设计的启示 |
1.7 8D6 筛选过程及表位分析、功能鉴定 |
1.8 课题设计思路 |
1.9 总结与展望 |
第2章 实验材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 细胞 |
2.1.2 HCVcc病毒 |
2.1.3 抗体及蛋白 |
2.1.4 病人血清样本 |
2.1.5 试剂 |
2.1.6 主要实验仪器 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 HCVpp中和实验 |
2.2.2 HCV E2 分选探针制备 |
2.2.3 抗体表达 |
2.2.4 Protein-G亲和层析纯化抗体 |
2.2.5 胚系抗体设计及改造 |
2.2.6 OCTET RED96 仪器检测抗原抗体亲和力 |
2.2.7 8D6 Fab制备 |
2.2.8 小角度X射线散射(SAXS) |
2.2.9 Docking |
2.2.10 HCVcc制备 |
2.2.11 HCV RNA电转 |
2.2.12 HCV耐药株构建 |
2.2.13 微中和实验 |
2.2.14 免疫荧光 |
2.2.15 HCV E2 截短突变体及丙氨酸扫描突变体构建 |
2.2.16 Lipo3000 脂质体DNA转染 |
2.2.17 酶联免疫吸附实验 |
2.2.18 8D6 表位保守性序列分析 |
2.2.19 数据分析 |
第3章 实验结果 |
3.1 HCV广谱中和抗体8D6 的分离和初步评价 |
3.2 8D6 与纯化的重组Con1(1b亚型)E2 蛋白具有高亲和力 |
3.3 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱结合活性 |
3.4 8D6 对不同基因型HCVcc病毒具有广谱结合活性 |
3.5 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱中和活性 |
3.6 8D6 可以中和DAA药物耐药毒株 |
3.7 8D6 通过阻断E2与CD81 的结合来阻断病毒入侵 |
3.8 8D6 是构象表位抗体并且识别保守的E2 表位 |
3.9 8D6 识别E2 的具体表位探究 |
3.10 E2 N448 去糖基化对8D6 识别的影响 |
3.11 8D6 Fab-E2 小角散射(SAXS)模型 |
3.12 重组E2(1b/Con1)与8D6 Fab复合物模型 |
3.13 8D6 通过体细胞超频突变获得广谱中和活性 |
3.14 8D6在CDRH3 上存在一个对抗体广谱活性获得重要的CX_4C基序 |
3.15 通过8D6 胚系抗体筛选疫苗合适的HCV免疫原 |
第4章 讨论 |
第5章 结论 |
参考文献 |
附录一 缩略词表(中英文对照) |
附录二 抗体序列 |
致谢 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
文献综述 |
参考文献 |
(5)单克隆抗体KM113生物学活性检测及质量标准研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 绪论 |
1.1 单克隆抗体 |
1.1.1 治疗性单克隆抗体 |
1.1.2 抗体的基本结构 |
1.1.3 抗体的作用原理 |
1.1.4 单克隆抗体药物的副作用 |
1.2 类风湿性关节炎及其治疗 |
1.2.1 类风湿性关节炎临床特点 |
1.2.2 类风湿性关节炎治疗现状及常用药物 |
1.3 治疗类风湿性关节炎的代表性药物 |
1.3.1 抗CD80/86(T细胞) |
1.3.2 抗CD20抗体(B细胞) |
1.3.3 IL-1受体拮抗剂 |
1.3.4 IL-6及其受体拮抗剂 |
1.3.5 抗肿瘤坏死因子A单抗 |
1.4 KM113单克隆抗体 |
1.5 KM113单克隆抗体药理作用及作用机制 |
1.6 KM113单克隆抗体生物类似药发展历史 |
1.6.1 国外研究进展 |
1.6.2 国内研究进展 |
1.6.3 KM113单抗类似药研发现状 |
1.7 KM113对照品 |
1.7.1 对照品(CKP-A20150704)的研制 |
1.7.2 KM113单抗对照品部分质量研究 |
1.7.3 对照品(CKP-A20150704)的质量评价 |
1.8 课题概述 |
第二章 KM113单克隆抗体结合活性检测方法研究 |
2.1 实验材料与仪器 |
2.1.1 实验材料 |
2.1.2 实验仪器 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 溶液试剂的配制 |
2.2.2 抗原和抗体浓度的初步确定 |
2.3 方法学验证 |
2.3.1 实验步骤 |
2.3.2 专属性 |
2.3.3 精密度 |
2.3.4 准确度 |
2.4 结果与讨论 |
2.4.1 结合活性方法初步确定 |
2.4.2 方法学验证结果 |
2.4.2.1 专属性 |
2.4.2.2 KM113抗体结合活性曲线线性关系 |
2.4.2.3 精密度 |
2.4.2.4 准确度 |
2.4.3 讨论 |
第三章 KM113单克隆抗体细胞活性检测方法研究 |
3.1 实验材料与仪器 |
3.1.1 实验材料 |
3.1.2 实验仪器 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 靶细胞密度的初步确定 |
3.2.2 TNF-α浓度的初步确定 |
3.2.3 ActD浓度的初步确定 |
3.3 方法学验证 |
3.3.1 实验步骤 |
3.3.2 专属性 |
3.3.3 准确度 |
3.3.4 精密度 |
3.3.4.1 重复性 |
3.3.4.2 中间精密度 |
3.4 结果与讨论 |
3.4.1 细胞活性方法初步确定 |
3.4.1.1 靶细胞密度的初步确定 |
3.4.1.2 TNF-α浓度的初步确定 |
3.4.1.3 ActD浓度的初步确定 |
3.4.2 方法学验证结果 |
3.4.2.1 专属性 |
3.4.2.2 准确度 |
3.4.2.3 精密度 |
3.4.3 讨论 |
第四章 KM113单克隆抗体生物学活性质量标准的研究 |
4.1 KM113单抗相对结合活性质量标准研究 |
4.1.1 相对结合活性测定实验方法 |
4.1.2 多批次样品检测 |
4.1.3 质量标准制定 |
4.2 KM113单抗体外细胞生物学活性质量标准研究 |
4.2.1 体外细胞活性测定实验方法 |
4.2.2 多批次样品检测 |
4.2.3 质量标准制定 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 相对结合活性质量标准研究 |
4.3.1.1 相对结合活性样品检测结果及分析 |
4.3.1.2 相对结合活性质量标准 |
4.3.2 体外细胞生物学活性质量标准研究 |
4.3.2.1 体外细胞生物学活性样品检测结果及分析 |
4.3.2.2 体外细胞生物学活性质量标准 |
全文小结 |
参考文献 |
附录 中英文及缩略语对照表 |
致谢 |
作者和导师简介 |
附件 |
(6)中国猕猴浆母细胞的表型鉴定及其在筛选流感特异性抗体中的应用(论文提纲范文)
主要缩略词 |
摘要 |
Abstract |
第一章 前言 |
1.1 猕猴的概述 |
1.1.1 猕猴的生物学特性 |
1.1.2 猕猴是研究人类疾病理想的动物模型 |
1.1.3 猕猴作为动物模型可以用于人源化抗体的制备 |
1.2 浆母细胞的简介 |
1.2.1 浆母细胞的形成 |
1.2.2 浆母细胞的特征 |
1.2.3 浆母细胞的功能 |
1.2.4 猕猴浆母细胞的研究进展 |
1.3 流感病毒相关介绍 |
1.3.1 流感病毒的危害 |
1.3.2 流感病毒的生物学特征 |
1.3.3 流感病毒的预防与治疗研究 |
1.4 抗体的概述 |
1.4.1 抗体的结构 |
1.4.2 抗体的生物学功能 |
1.5 单克隆抗体的制备方法 |
1.5.1 浆母细胞可作为单细胞PCR克隆抗体的来源 |
1.6 提出问题及研究意义 |
第二章 鉴定中国猕猴浆母细胞的表型 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 流式细胞术相关试剂 |
2.1.2 B细胞Elispot相关耗材与试剂 |
2.1.3 实时荧光定量PCR相关耗材与试剂 |
2.2 实验相关仪器 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 猕猴外周血单个核细胞的分离 |
2.3.2 人外周血单个核细胞的分离 |
2.3.3 猕猴与人PBMC流式抗体染色 |
2.3.3.1 猕猴与人PBMC流式分析浆母细胞染色 |
2.3.3.2 猕猴与人PBMC抗体染色用于流式分析浆母细胞动力学 |
2.3.3.3 流式分选猕猴浆母细胞抗体染色 |
2.3.4 B细胞Elispot实验操作步骤 |
2.3.5 实时荧光定量PCR检测基因表达 |
2.4 实验结果 |
2.4.1 人类浆母细胞的表面标志无法应用于中国猕猴 |
2.4.2 人类浆母细胞高表达增值相关抗原Ki67 |
2.4.3 中国猕猴浆母细胞不表达CD19分子 |
2.4.3.1 中国猕猴浆母细胞中Ki67+细胞不表达CD19分子 |
2.4.3.2 中国猕猴浆母细胞中分泌特异性抗体的细胞大多不表达CD19分子 |
2.4.3.3 mRNA水平验证中国猕猴浆母细胞不表达CD19分子 |
2.4.4 中国猕猴浆母细胞不表达CD27分子 |
2.4.4.1 中国猕猴的浆母细胞ki67++细胞不表达CD27分子 |
2.4.4.2 中国猕猴分泌特异性抗体的的浆母细胞不表达CD27分子 |
2.4.4.3 mRNA水平验证中国猕猴浆母细胞不表达CD27分子 |
2.4.5 中国猕猴由疫苗诱导产生的浆母细胞表型为CD3-CD14-CD56-CD19-CD27-CD20-/lowCD80+HLA-DR+CD95+ |
2.4.6 表型鉴定的中国猕猴浆母细胞是正确的 |
2.4.7 中国猕猴浆母细胞与人类浆母细胞具有类似的转录特征 |
2.5 小结 |
第三章 利用鉴定出的中国猕猴浆母细胞筛选流感病毒特异性抗体 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 流式分选相关材料 |
3.1.2 分子克隆相关试剂 |
3.1.3 细胞培养和质粒转染相关试剂 |
3.1.4 蛋白质电泳相关试剂 |
3.1.5 Elisa实验相关试剂 |
3.2 实验仪器 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 配置单细胞裂解体系 |
3.3.2 分选单个中国猕猴浆母细胞到裂解体系中 |
3.3.3 单细胞PCR扩增抗体可变区基因 |
3.3.4 DNA电泳鉴定回收阳性孔 |
3.3.5 构建抗体的表达质粒 |
3.3.5.1 抗体基因两端加上同源重组接头 |
3.3.5.2 抗体表达载体的构建 |
3.3.5.3 抗体基因与表达载体相连 |
3.3.5.4 重组连接产物转化 |
3.3.5.5 菌液PCR鉴定阳性菌落 |
3.3.6 分析测序结果 |
3.3.7 挑取正确的菌液进行扩大培养小量提取质粒 |
3.3.8 293T细胞中表达抗体 |
3.3.9 SDS-PAGE蛋白电泳验证抗体的表达 |
3.3.10 Elisa验证抗体功能 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 单细胞PCR扩增出抗体重轻链基因 |
3.4.2 抗体的基因序列分析 |
3.4.3 抗体表达质粒的构建 |
3.4.3.1 表达载体的线性化 |
3.4.3.2 抗体基因两端加上重组接头 |
3.4.3.3 菌液PCR鉴定阳性菌落 |
3.4.3.4 比对抗体基因序列 |
3.4.4 抗体的表达 |
3.4.5 Elisa验证抗体的结合活力 |
3.5 小结 |
第四章 结果与讨论 |
4.1 结果 |
4.2 讨论 |
参考文献 |
附录 |
待发表文章 |
致谢 |
(7)快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 前言 |
1.1 抗体(Antibody)的概述 |
1.1.1 抗体的结构与功能 |
1.1.2 抗体的人源化 |
1.1.3 抗体药物市场 |
1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
1.2.1 HBV基因组 |
1.2.2 HBV的病毒结构 |
1.2.3 HBV的生命周期 |
1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
1.2.5 HBV的基因型 |
1.2.6 HBV的流行病学 |
1.2.7 HBV的预防 |
1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
1.3 本研究的目的、意义和思路 |
第二章 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 主要仪器 |
2.1.2 主要耗材 |
2.1.3 主要试剂 |
2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
2.2 方法 |
2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
2.2.2 常规细胞生物学方法 |
2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
2.2.4 免疫学相关实验方法 |
2.2.5 体外调理吞噬实验 |
2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
2.2.8 亲和力常数测定 |
2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
2.2.12 数据处理统计学分析 |
第三章 结果与分析 |
第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
3.3 第一部分小结 |
第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
3.5 第二部分小结 |
第四章 讨论 |
4.1 鼠源抗体人源化方法 |
4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
4.3 FR区人源化点突变规则 |
4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
第五章 结论与展望 |
参考文献 |
在校期间的科研成果 |
致谢 |
(8)靶向TGF-β1的治疗性基因重组抗体药物研发及表征(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 引言 |
1.1 TGF-β概述 |
1.2 功能 |
1.3 TGF-β在肿瘤中的作用方式以及相关疾病 |
1.3.1 TGF-β在肿瘤环境中的具体作用形式 |
1.3.2 TGF-β第一重身份:肿瘤抑制剂 |
1.3.3 TGF-β第二重身份:肿瘤促进剂 |
1.3.3.1 间充质转化在肿瘤侵袭和转移过程中的作用 |
1.3.3.2 间充质转化会使癌细胞表现出干细胞的一些特性 |
1.3.3.3 逃避免疫监视和极化骨髓细胞 |
1.3.4 TGF-β相关疾病 |
1.4 治疗药物概述 |
1.4.1 配体陷阱-抗体类药物、Fc融合蛋白类药物 |
1.4.2 反义寡核苷酸 |
1.4.3 小分子受体激酶抑制剂 |
1.4.4 寡肽核苷酸适配子 |
1.4.5 接种疫苗 |
1.4.6 临床数据:配体陷阱 |
1.5 目前靶向TGF-β抗体药物的研究进展 |
1.6 存在的问题以及课题研究意义 |
1.7 技术路线 |
第2章 两个TGF-β1 抗体分子的活性评价与筛选 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料 |
2.2.1 抗体序列发现以及基因合成 |
2.2.2 载体质粒 |
2.2.3 材料 |
2.2.4 各种试剂的配制 |
2.2.5 仪器 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 构建质粒 |
2.3.2 标准DH5α感受态的制备流程 |
2.3.3 质粒的重组反应 |
2.3.4 质粒的转化流程 |
2.3.5 质粒的小量提取及测序鉴定 |
2.3.6 质粒的大量提取 |
2.3.7 悬浮HEK293F细胞瞬转表达抗体蛋白 |
2.3.7.1 质粒无菌处理 |
2.3.7.2 悬浮HEK293F细胞培养以及传代 |
2.3.7.3 HEK293F细胞转染 |
2.3.7.4 抗体的收集与纯化 |
2.3.8 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
2.3.9 HPLC高效液相色谱检测抗体聚集情况 |
2.3.10 DSC差示扫描量热法测量抗体热稳定性 |
2.3.11 Octet生物分子相互作用仪检测抗体亲和力以及结合表位 |
2.3.12 抗原抗体的结合曲线以及竞争结合曲线 |
2.3.13 HT-2 细胞中和实验 |
2.4 实验结果讨论与分析 |
2.4.1 大提质粒的酶切验证 |
2.4.2 悬浮HEK293F细胞瞬转表达抗体蛋白的纯化与鉴定 |
2.4.3 HPLC-SEC检测抗体的聚集以及降解情况 |
2.4.4 DSC差示扫描量热法检测抗体热稳定性 |
2.4.5 Octet检测抗体的亲和力以及结合表位 |
2.4.6 抗体在ELISA水平的结合实验以及阻断实验 |
2.4.7 HT-2 细胞中和实验 |
2.5 本章小结 |
第3章 TGF-β1 抗体分子的改造 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料 |
3.2.1 材料 |
3.2.2 各种试剂的配制 |
3.2.3 仪器 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 Kappa chain shuffling噬菌体文库的构建 |
3.3.1.1 PCR扩增LY-2382770 重链基因 |
3.3.1.2 噬菌体载体质粒小提 |
3.3.1.3 质粒连接以及电转 |
3.3.2 噬菌体文库的淘选 |
3.3.2.1 第一轮噬菌体扩增 |
3.3.2.2 免疫磁珠淘选 |
3.3.2.3 阳性克隆检测 |
3.3.3 单点Phage ELISA以及70°C高温筛选目标分子 |
3.4 实验结果讨论与分析 |
3.4.1 PCR扩增LY-2382770 抗体重链Vh基因 |
3.4.2 PCR鉴定文库的插入率 |
3.4.3 阳性克隆的检测 |
3.4.4 单点噬菌体酶联免疫反应以及70°C高温筛选目标分子 |
3.5 本章小结 |
第4章 TGF-β1 抗体目标分子的体外表征 |
4.1 引言 |
4.2 实验材料 |
4.2.1 抗体序列发现以及基因合成 |
4.2.2 载体质粒 |
4.2.3 材料 |
4.2.4 各种试剂的配制 |
4.2.5 仪器 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 构建质粒 |
4.3.2 标准DH5α感受态的制备流程 |
4.3.3 质粒的重组反应 |
4.3.4 质粒的转化 |
4.3.5 质粒的小量提取及测序鉴定 |
4.3.6 质粒的大量提取 |
4.3.7 悬浮HEK293F细胞瞬转表达抗体蛋白 |
4.3.7.1 质粒无菌处理 |
4.3.7.2 悬浮HEK293F细胞培养以及传代 |
4.3.7.3 HEK293F细胞转染 |
4.3.7.4 抗体的收集与纯化 |
4.3.8 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
4.3.9 DSF差示扫描荧光法测量抗体热稳定性 |
4.3.10 抗原抗体的结合曲线、中和曲线以及抗体表位鉴定 |
4.3.11 HT-2 细胞中和实验 |
4.3.12 A549 细胞中和实验 |
4.4 实验结果讨论与分析 |
4.4.1 大提质粒的酶切验证 |
4.4.2 悬浮HEK293F细胞瞬转表达抗体蛋白的纯化与鉴定 |
4.4.3 基于DSF原理的抗体热稳定检测 |
4.4.4 抗体在ELISA水平的结合和阻断实验以及表位鉴定 |
4.4.5 HT-2 细胞中和实验 |
4.4.6 A549 细胞中和实验 |
4.5 本章小结 |
第5章 结论与展望 |
5.1 结论 |
5.2 进一步工作的方向 |
致谢 |
参考文献 |
附录 |
攻读学位期间的研究成果 |
综述 |
参考文献 |
(9)乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 前言 |
1.1 乙型流感病毒综述 |
1.1.1 流感病毒的分类和命名 |
1.1.2 乙型流感病毒的结构 |
1.1.3 乙型流感的编码蛋白 |
1.1.4 流感病毒的生命周期 |
1.1.5 乙型流感的进化 |
1.1.6 乙型流感的宿主 |
1.1.7 乙型流感的流行病学和临床特征 |
1.1.8 乙型流感的抗病毒治疗及预防 |
1.2 流感病毒血凝素广谱单抗的研究概述 |
1.2.1 甲型流感病毒血凝素广谱单抗概述 |
1.2.2 乙型流感病毒血凝素广谱单抗概述 |
1.2.3 乙型流感病毒血凝素广谱单抗的中和机制 |
1.2.4 流感病毒血凝素广谱单抗的制备策略 |
1.3 本研究的意义及主要研究内容 |
第二章 材料与方法 |
2.1 研究中用到的主要仪器 |
2.2 主要试剂及实验动物 |
2.2.1 E.coli菌株 |
2.2.2 质粒 |
2.2.3 细胞株 |
2.2.4 流感病毒 |
2.2.5 实验动物 |
2.2.6 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
2.2.7 其他常规试剂 |
2.3 实验用溶液及培养基配制 |
2.3.1 细胞培养用溶液的配制 |
2.3.2 常规分子生物学实验溶液的配制 |
2.3.3 抗原和分子检测用溶液的配置 |
2.3.4 病毒培养及检测用溶液的配置 |
2.4 实验方法 |
2.4.1 常规分子克隆实验方法 |
2.4.2 常规细胞生物学实验方法 |
2.4.3 流感病毒相关实验方法 |
2.4.4 鼠单克隆抗体的制备和纯化 |
2.4.5 免疫学相关实验方法 |
2.4.6 单抗可变区编码序列的测定及分析 |
2.4.7 单克隆抗体Fab片段的制备 |
2.4.8 人鼠嵌合抗体的构建与表达纯化 |
2.4.9 高效排阻色谱和抗体亲和力测定方法 |
2.4.10 逃逸突变病毒株筛选方法 |
2.4.11 小鼠动物实验方法 |
2.4.12 雪貂动物实验方法 |
2.4.13 结构生物学相关实验方法 |
2.4.14 抗体中和机制研究相关实验方法 |
2.4.15 本研究的抗体和病毒序列在Genbank中的检索号 |
2.4.16 本研究的统计学分析 |
第三章 结果与分析 |
3.1 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗的筛选与鉴定 |
3.1.1 乙型流感的进化及抗原性分析 |
3.1.2 乙型流感RBS区广谱单抗制备策略的初步摸索 |
3.1.3 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗活性鉴定 |
3.1.4 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗研究小结 |
3.2 乙型流感RBS区跨亚系广谱单抗的筛选与鉴定 |
3.2.1 乙型流感RBS区跨亚系广谱单抗的诱导 |
3.2.2 乙型流感RBS区多功能性广谱单抗的筛选 |
3.2.3 乙型流感RBS区广谱单抗12G6体外抗病毒活性鉴定 |
3.2.4 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6体外抗病毒活性鉴定 |
3.2.5 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6体内保护活性鉴定 |
3.2.6 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6识别表位鉴定 |
3.2.7 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6中和病毒机制分析 |
3.2.8 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6研究小结 |
3.3 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的筛选与鉴定 |
3.3.1 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的制备 |
3.3.2 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的初步活性鉴定 |
3.3.3 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗嵌合抗体的制备 |
3.3.4 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗体外抗病毒活性鉴定 |
3.3.5 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗体内保护活性分析 |
3.3.6 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗识别表位分析 |
3.3.7 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗抗病毒机制分析 |
3.3.8 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗研究小结 |
第四章 讨论 |
4.1 流感HA广谱表位诱导机体产生有效免疫应答的困难与对策 |
4.2 多功能抗体作为新型治疗性药物的重要性 |
4.3 IgM广谱抗体在防治高变异病原体中的重要性 |
4.4 流感HA广谱抗体应用于流感治疗的前景与挑战 |
4.5 流感HA广谱表位应用于通用流感疫苗设计的前景与挑战 |
4.6 本研究的局限性 |
第五章 结论与展望 |
参考文献 |
在校期间的科研成果及奖励 |
致谢 |
(10)人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库的构建及筛选(论文提纲范文)
主要缩略词表 |
摘要 |
Abstract |
前言 |
1 腺病毒相关简介 |
1.1 腺病毒生物学特征和流行病学特点 |
1.2 腺病毒感染临床表征 |
1.3 腺病毒感染治疗情况 |
2 抗体药物在感染性疾病中的应用 |
3 抗体药物的发展历程 |
4 噬菌体抗体库技术 |
4.1 机体原始抗体库的形成过程 |
4.2 噬菌体抗体库技术原理 |
4.3 噬菌体抗体库类型 |
4.4 噬菌体抗体库展示系统 |
4.5 噬菌体抗体库技术常用表达载体 |
4.6 噬菌体抗体库的筛选方法 |
4.7 噬菌体展示技术的应用 |
材料与方法 |
1 材料 |
1.1 菌株和质粒 |
1.2 细胞和病毒株 |
1.3 试剂和耗材 |
1.4 主要仪器 |
1.5 PCR扩增抗体基因所用引物,引物序列参照噬菌体展示实验室手册 |
2 构建抗3型、7 型腺病毒的人源Fab抗体文库 |
2.1 标本采集和人血清抗Adv3、Adv7中和抗体滴度的测定 |
2.2 人外周血淋巴细胞的分离 |
2.3 人外周血淋巴细胞总RNA的提取 |
2.4 cDNA的合成 |
2.5 PCR扩增抗体可变区基因 |
2.6 PCR扩增抗体恒定区基因 |
2.7 PCR产物的纯化回收 |
2.8 第一轮SOE- PCR |
2.9 第二轮SOE- PCR |
2.10 噬菌粒载体pComb 3XTT、pComb3XLambda质粒DNA的制备 |
2.11 pComb3XTT载体和PCR产物Fab酶切片段的制备 |
2.12 XLI-Blue电转感受态细胞制备及转化效率鉴定 |
2.13 辅助噬菌体M13KO7的制备和滴度测定 |
2.14 Fab(Κ)抗体库和Fab(λ)抗体库的构建、制备及滴度测定 |
2.15 Fab抗体库库容鉴定 |
3 人源抗3型、7 型腺病毒Fab噬菌体抗体库的筛选 |
3.1 3 型、7 型腺病毒的大量培养与纯化(抗原制备) |
3.2 噬菌体抗体库的4轮富集筛选 |
3.3 每一轮筛选后总噬菌体化学发光酶免疫法(phage CLEIA)检测 |
3.4 phage CLEIA初步鉴定第四轮筛选后的单克隆菌落 |
3.5 phage CLEIA再次鉴定初筛阳性克隆 |
3.6 phage CLEIA鉴定阳性克隆型别特异性 |
3.7 阳性克隆基因序列分析 |
4 真核表达载体构建和全抗体分泌及抗体功能鉴定 |
4.1 重轻链真核表达载体构建 |
4.2 抗体表达鉴定 |
结果 |
1 人血清抗Adv3、Adv7中和抗体滴度的测定 |
2 Fab抗体库的构建 |
2.1 Fab(Κ)和Fab(λ)基因的扩增结果 |
2.2 噬菌体Fab抗体库的建立 |
3 Fab抗体库的筛选 |
3.1 SDS-PAGE分析纯化的Adv3和Adv7腺病毒 |
3.2 辅助噬菌体滴度测定结果 |
3.3 噬菌体抗体库的富集筛选 |
3.4 总Phage CLEIA检测 |
3.5 单克隆Phage CLEIA |
3.6 阳性克隆噬菌体抗体特异性检测 |
3.7 人源抗Adv7 Fab抗体的序列分析 |
4 真核表达载体构建及抗体表达鉴定 |
4.1 抗体基因真核表达载体构建 |
4.2 IgG抗体功能鉴定 |
讨论 |
1 噬菌体展示的抗体基因类型及优点 |
2 Fab抗体库的构建方法 |
3 噬菌体抗体库展示系统的选择 |
4 抗体库库容量影响因素 |
5 抗体库多样性影响因素 |
6 抗体库富集效果影响因素 |
7 抗体亲和力检测和阳性结果判定 |
8 全抗体真核表达及抗体功能检测 |
9 抗体亲和力问题 |
10 噬菌体展示技术的局限性 |
11 研究展望和改进 |
结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
四、人抗HBV-前S2抗体轻链基因的克隆及序列分析(论文参考文献)
- [1]ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制[D]. 康棣. 中国农业科学院, 2021
- [2]猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 韩郁茹. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究[D]. 张凡庆. 上海交通大学, 2020(01)
- [4]丙型肝炎(HCV)广谱中和抗体表位分析和作用机制研究[D]. 夏静. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [5]单克隆抗体KM113生物学活性检测及质量标准研究[D]. 焦茜. 北京化工大学, 2019(02)
- [6]中国猕猴浆母细胞的表型鉴定及其在筛选流感特异性抗体中的应用[D]. 张帆. 安徽大学, 2019(07)
- [7]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [8]靶向TGF-β1的治疗性基因重组抗体药物研发及表征[D]. 费忠伟. 南昌大学, 2018(03)
- [9]乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究[D]. 沈晨光. 厦门大学, 2018(08)
- [10]人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库的构建及筛选[D]. 刘冬兰. 广州医科大学, 2017(02)