一、乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异特点的研究（论文文献综述）
聂源[1]（2019）在《HIV/HBV合并感染治疗队列HBV变异特征及其对长期HBV病毒学应答和炎性反应的影响》文中提出研究背景:HIV、HBV有相似传播途径,HIV/HBV合并感染常见。总体上,HIV感染者中有5%20%可同时感染HBV。HIV/HBV合并感染可相互促进疾病进程,与HBV单一感染相比,合并感染终末性肝病进程明显加快;与HIV单一感染相比,合并感染免疫重建延缓。高效抗逆转录病毒疗法（HAART）可同时抑制合并感染者体内HIV和HBV复制,但不能彻底清除HIV储存库和HBV储存库（肝细胞内的HBV cccDNA）,终末性肝病成为目前HIV感染者死亡的首要原因。我国HBV传播方式主要为母婴传播,基因型以B型、C型为主。鉴于我国HBV与西方不一样的流行特点和更差的预后转归,HIV/HBV合并感染者治疗过程中应考虑我国HBV感染的独特性。HBV基因组序列变异含有多种形式,包括PreS区缺失。PreS/S区编码翻译的多肽包含HBV多个重要的抗原表位,表位的免疫原性改变,可使病毒逃避宿主的免疫监视而致持续的免疫反应。HBV在宿主体内复制过程中因序列变异可产生大量的错配的但不构成基因型差异的种群,其中具有逃避宿主免疫攻击的准种逐渐发展为优势准种是HBV持续感染和慢性化的重要原因。HIV/HBV合并感染治疗前PreS区准种变异特征及是否影响合并感染纵向队列治疗过程中的HBV病毒学应答及炎性反应,尚缺乏全面的研究报道。我们课题组前期的研究发现,治疗前HBV PreS准种缺失与HIV/HBV合并感染者治疗后免疫重建（CD4+T淋巴细胞数及CD4/CD8比值的回升）相关,提示治疗前合并感染者的HBV基因组序列变异可能对治疗效果甚至预后产生影响。已有研究发现:与HCC相关的PreS、A1762T/G1764A等HBV基因组变异在HIV/HBV合并感染中更常见,HBV基因组特定序列变异（主要包括点突变和PreS区缺失）,与HBV单一感染肝硬化、HCC等终末性肝病发病率增加显着相关。那么HIV/HBV合并感染队列中的HBV序列变异是否与疾病进程加快相关?可能通过什么机制导致疾病进程加快?回答这个问题需要依托HIV/HBV合并感染的纵向治疗队列,研究分析HIV/HBV合并感染队列治疗前HBV序列变异特征及其对治疗过程中的HBV病毒学应答和炎性反应的影响。本课题目的是研究HIV/HBV合并感染队列HBV变异特征及其对长期HBV病毒学应答和宿主炎性反应的影响,以探讨HIV/HBV合并感染的疾病进程加快的可能机制。研究分为三部分:第一部分基于横断面的HBV全基因序列,分析HIV/HBV合并感染抗病毒治疗前出现的已知肝病进展相关的HBV变异的特征,从全基因组角度深度分析合并感染HBV变异及与宿主免疫相关性;第二部分研究是在第一部分全基因组分析的基础上,分析HIV/HBV合并感染队列治疗前HBV PreS准种变异特征和异质性;第三部分是在第二部分研究的基础上,基于随访6年的HIV/HBV合并感染纵向治疗队列,从长期治疗过程中HBV病毒学应答（采用相关指标:HBV DNA、HBsAg、HBV PgRNA）和炎性反应活化（采用相关指标:sCD14、sCD163、IP-10、IL-18）角度出发,研究分析治疗前HBV PreS准种缺失对长期治疗过程中HBV病毒学应答、宿主炎性反应的影响。第一部分HIV/HBV合并感染者治疗前HBV全基因组变异特征研究目的深度分析HIV/HBV合并感染治疗前HBV全基因组序列变异特征,为进一步研究治疗前HBV序列变异对HIV/HBV合并感染纵向治疗队列的可能影响提供依据。研究方法以HIV/HBV合并感染者、HBV单一感染者为研究对象。采集患者抗病毒前外周静脉血,提取血浆中DNA,以DNA为模板进行HBV全基因组PCR扩增（nest-PCR）,PCR产物经Sanger测序后,序列经Contig Express软件拼接,Bio Edit7.0软件将拼接序列与相应基因型的HBV野生株序列进行比对,比较两组HBV序列中肝病进展相关变异（A1762T、G1764A、G1896A、G1613A、C1653T、T1753V、A1846T、G1899A、Pre S1缺失、Pre S2缺失）和HBV Pre S/S表位变异发生率;以HIV/HBV合并感染CD4+T淋巴细胞数100个/ul为临界值分组,比较两组肝病进展相关变异发生率;以HIV/HBV合并感染有无Pre S缺失分组,比较两组同时发生点突变的比例。系统进化树分析使用MEGA6.0软件。统计学分析采用Office2010和SPSS19.0软件,P<0.05表示差异有统计学意义,采用单因素和多因素的Logistic回归分析多变量模型中的相关因素。研究结果1.成功扩增全长基因组序列的HIV/HBV合并感染者82例、HBV单一感染者50例,性别组成、年龄、HBe Ag状态、基因型、ALT、AST、HBV DNA比较均无统计学意义。2.除G1613A变异外,其他肝病进展相关的HBV变异发生率在HIV/HBV合并感染都较高,其中T1753V变异比较具有统计学意义。3.HIV/HBV合并感染有Pre S缺失组与无Pre S缺失组的肝病进展相关的点突变比例比较发现,除C1653T外,其余位点在Pre S缺失组均有较高的变异比例,其中A1762T、G1764A、G1613A、T1753V变异率比较具有统计学意义。4.单因素和多因素Logistic回归分析发现,合并HIV感染是T1753V变异发生的相关因素;HBV基因C型是A1762T、G1764A变异发生的相关因素;HBV基因B型是G1896A变异发生的相关因素;HBe Ag阴性是G1896A、A1846T、G1899A变异发生的相关因素。5.除C1653T、G1899A位点外,HIV/HBV合并感染CD4+T淋巴细胞数≤100个/ul组比CD4+T淋巴细胞数≤100个/ul组其余位点变异率较高。6.遗传进化分析发现有Pre S缺失的患者进化关系较远。HIV/HBV合并感染较HBV单一感染所有的细胞毒性T细胞（CTL）表位变异发生率均偏高,Pre S2aa1-15表位比较具有统计学意义,Pre S2 aa1-15表位缺失率也明显偏高。除Pre S2aa1-26外所有的B细胞表位和所有的Th细胞表位变异发生率比较无统计学意义。研究结论HIV/HBV合并感染者治疗前HBV肝病进展相关变异及Pre S区表位变异均高于HBV单一感染者,且免疫功能低下的HIV/HBV合并感染者有着更多的肝病进展相关变异,提示HBV的变异与宿主免疫状态相关,HIV/HBV合并感染者有着更高的肝病进展风险。第二部分HIV/HBV合并感染者治疗前HBV Pre S准种变异特征研究目的从准种角度出发,分析HIV/HBV合并感染者Pre S区准种变异特征、异质性及其与宿主免疫状态的相关性。研究方法以HIV/HBV合并感染者、HBV单一感染者为研究对象。采集患者抗病毒前外周静脉血,提取血浆中DNA,以DNA为模板进行HBV Pre S区PCR扩增（nest-PCR）,选取HBV Pre S扩增阳性产物进行T-A克隆,单克隆PCR后选取阳性克隆菌液送公司菌液测序,采用Chromas2.4软件、Bio Edit7.0软件与相应基因型的HBV野生株序列进行比对,比较两组发生Pre S缺失患者数比例;Pre S准种缺失频率、异质性。异质性采用Golang语言程序包、MEGA6.0软件计算。统计学分析采用Office2010和SPSS19.0软件,P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.PCR成功扩增HBV Pre S区样本分别来自HIV/HBV合并感染组（71例）和HBV单一感染组（76例）,两组患者性别组成、年龄、HBe Ag状态、基因型、ALT、AST、HBV DNA比较均无统计学意义。2.HIV/HBV合并感染组与HBV单一感染组Pre S缺失患者数比例比较发现（准种序列中出现一条HBV Pre S缺失归为有Pre S缺失的患者）,HBV单一感染组中发生Pre S缺失患者数比例高于HIV/HBV合并感染组,比较无统计学意义。3.HIV/HBV合并感染发生Pre S缺失患者的Pre S缺失准种频率高于HBV单一感染组;发生Pre S1缺失的Pre S1准种频率在HIV/HBV合并感染中显着较高,具有统计学意义;发生Pre S2缺失的准种频率,HIV/HBV合并感染较高;HIV/HBV合并感染HBV Pre S区功能区域准种缺失频率较HBV单一感染较高,其中S蛋白启动子区、热休克蛋白70结合位点比较具有统计学意义。4.HIV/HBV合并感染组（55例）较HBV单一感染组（32例）的HBV准种异质性较低,准种进化宽度较窄。研究结论HIV/HBV合并感染者更常发生高频率HBV Pre S1、Pre S2准种缺失,且Pre S1缺失为主;功能区域准种缺失频率普遍较高,S蛋白启动子区与热休克蛋白70结合位点准种缺失频率为着;HBV准种异质性较低,准种进化宽度较窄,提示合并HIV感染对HBV Pre S区准种变异存在明显影响。第三部分HIV/HBV合并感染者治疗前HBV Pre S准种缺失对治疗后HBV病毒学应答和炎性反应的影响研究目的根据第二部分研究结果,以HIV/HBV合并感染随访6年纵向治疗队列为基础,分析治疗前HBV Pre S准种缺失对HIV/HBV合并感染者长期抗病毒治疗过程中HBV病毒学应答、炎性反应的影响。从病毒学、免疫学角度,研究HIV/HBV合并感染中HBV Pre S缺失可能引发致病的机制。研究方法获取纵向队列治疗前血浆（0年）及治疗后随访2年、4年、6年共4个时间点血浆,ELISA方法定量检测s CD14、s CD163、IP-10、IL-18,电化学发光方法定量检测HBs Ag、PCR-荧光探针法定量检测HBV DNA、HBV Pg RNA。依据治疗前有无HBV Pre S、HBV Pre S1、HBV Pre S2准种缺失,将HIV/HBV合并感染队列分组,分析治疗前有HBV Pre S、HBV Pre S1、HBV Pre S2准种缺失组与相应无缺失组HBV病毒学应答指标（HBV DNA、HBs Ag、HBV Pg RNA）、炎性因子（s CD14、s CD163、IP-10、IL-18）纵向变化差异。统计学分析采用Office2010和SPSS19.0软件,绘图采用Graph Pad Prism 6.0软件。P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.HIV/HBV合并感染有Pre S准种缺失组（42例）与无Pre S准种缺失组（29例）比较发现:（1）所有时间点的血浆HBV DNA检测值比较均无统计学意义。（2）有Pre S缺失组血浆HBs Ag检测值在治疗前（0年）明显低于无Pre S缺失组,具有统计学意义,且治疗2年、4年、6年时间点持续趋低于无Pre S缺失组。（3）有Pre S缺失组血浆HBV Pg RNA检测值在治疗前（0年）、治疗2年与无Pre S缺失组明显偏高,具有统计学意义,在治疗4年、6年时间点,比较无统计学意义。2.HIV/HBV合并感染有Pre S1准种缺失组（34例）较无Pre S1准种缺失组（37例）比较发现:（1）所有时间点的血浆HBV DNA、HBs Ag检测值比较均无统计学意义。（2）有Pre S1缺失组血浆HBV Pg RNA检测值在治疗前（0年）、2年明显偏高,具有统计学意义,治疗4年、6年比较无统计学意义。3.HIV/HBV合并感染有Pre S2准种缺失组（22例）较无Pre S2准种缺失组（49例）比较发现:（1）所有时间点的血浆HBV DNA、HBV Pg RNA检测值比较均无统计学意义。（2）有Pre S2缺失组血浆HBs Ag检测值在治疗前（0年）明显低于无Pre S2缺失组,具有统计学意义,且治疗2年、4年、6年时间点持续趋低于无Pre S2缺失组。4.HIV/HBV合并感染队列中纵向检测系列血浆炎性因子（s CD14、s CD163、IP-10、IL-18）者共59例,（1）相对无Pre S准种缺失组（27例）,有Pre S准种缺失组（32例）比较发现:血浆s CD14、s CD163、IL-18检测值在治疗前（0年）明显偏高,具有统计学意义;治疗2年、4年、6年时间点比较无统计学意义;所有时间点的血浆IP-10检测值比较均无统计学意义。（2）相对无Pre S1准种缺失组（33例）,有Pre S1准种缺失组（26例）比较发现:血浆s CD14、s CD163、IL-18检测值在治疗前（0年）偏高,其中s CD14、s CD163比较具有统计学意义,且s CD163检测值在治疗2年、4年、6年有偏高趋势;治疗2年、4年、6年s CD14、IL-18检测值无统计学意义;所有时间点的血浆IP-10检测值比较均无统计学意义。（3）相对无Pre S2准种缺失组（41例）,有Pre S2准种缺失组（18例）比较发现:血浆s CD14、s CD163检测值在治疗前（0年）偏高,具有统计学意义;治疗2年、4年、6年比较无统计学意义;在所有时间节点IL-18检测值均偏高,治疗4年、6年比较具有统计学意义;所有时间点的血浆IP-10检测值比较均无统计学意义。研究结论HIV/HBV合并感染队列治疗前HBV Pre S准种缺失影响治疗过程中HBV病毒学应答和宿主炎性反应,尤其是Pre S2缺失,与长期HAART血浆中低水平HBs Ag及高水平IL-18相关,提示HBV Pre S缺失可能通过HBs Ag分泌异常导致炎性反应异常活化,从而加快HIV/HBV合并感染者疾病进展。
蔡林[2]（2019）在《藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究》文中提出研究背景:HBV在乙肝患者体内以准种的形式存在,早已经被学者证实。HBV病毒变异的多样性,既与病毒自身复制时多聚酶缺乏校正功能,容易产生随机突变有关,还与宿主免疫状态、抗病毒治疗的干预有关。不同的人群、不同的疾病阶段都会有不同的HBV准种变异特点。HBV准种变异与乙肝的诊断、治疗、疾病转归息息相关。目前研究较多的变异是HBV BCP区、preC/C区、preS/S区、RT区,例如BCP区的A1762T/G1764A双突变、preC区G1896A突变都会导致C基因转录的异常,会造成HBeAg合成障碍,且都与肝硬化、肝癌的发生有关。西藏地区地处高原地带,地理上、人文上都与外界相对隔离,在西藏藏族人群中,乙肝感染率高达12%以上,远高于国内平均感染率（6.1%）。目前对于藏族人乙肝病毒的研究发现,藏族人HBV流行株以C/D重组型为主,而汉族人以B、C型为主,目前对藏族C/D型HBV准种的研究较少,尚不清楚其是否具有独特的准种特点。HBV在人体内会受到宿主免疫压力的选择,病毒抗原经HLAⅠ类和Ⅱ类分子呈递表位肽,刺激CD8和CD4+T细胞应答,表位肽的变异会造成T细胞不能识别而出现免疫逃逸。因此不同HLA分子能驱动不同的HBV变异,对HBV变异存在限制性。目前研究较多的是HLAⅠ类分子限制的表位肽,例如HBV核心蛋白HBcAg 17-28aa是HLA-A2限制的抗原肽;对于藏族HBV感染者的HLA限制性目前则尚无相关研究。研究目的:本研究以西藏藏族乙肝感染者为研究对象,试图探讨藏族人HBV病毒准种特点,以及藏汉不同民族HLA遗传背景下对HBV的限制性,旨在加深HBV病毒准种变异及其HLA分子限制性的认识。方法:以1例C基因型HBV样本（pAAV-HBV质粒）为参考序列进行三代测序用于HBV全长准种分析的方法学探索,先对pAAV-HBV质粒进行HBV全长PCR扩增,在三个独立的测序单元（cell）中加入相同量的质粒扩增产物,通过BioEdit7.0、MEGA 7.0等生物信息工具对测序序列的分析,得出三代测序的错误率,以及用于准种分析的遗传距离、突变率的合理阈值。以2016-2017年在西藏藏南地区进行流行病学调查时采集到24例HBsAg阳性患者为研究对象,同时于2017年在西南医院感染科门诊匹配收集24例汉族乙肝感染者血液样本作为对照组。从100ul血清中提取HBV DNA,通过PCR扩增HBV全基因组,进而利用第三代DNA测序平台PacBio RS II对HBV进行全长测序;同时从血细胞样本中提取人gDNA,利用SBT（Sequence-Based Typing）分型方法对HLA-A、B、C、DRB1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1八个位点进行四位数字的高分辨率分型。利用PacBio SMRT Tools进行测序数据的拆分及CCS（Circular consensus sequences）序列的生成;序列编辑用BioEdit7.0完成;序列比对用Clustal W 2.1、Muscle 3.8、T-Coffee11.0来完成。核酸替换模型的测试用Modeltest3.7完成。系统进化分析采用MEGA 7.0进行,进化树的构建采用邻接法（Neighbor-Joining）,进化树可靠性分析采用自助抽样法（Bootstrip Method）,Bootstrip重复次数选择500次以上。进化树的分析处理采用FigTree v1.4.3完成。重组分析采用Stuart C.Ray开发的SimPlot 3.5进行。病毒准种特点用两种方法描述:香农熵（Shannon entropy,Sn）和平均遗传距离（mean genetic distance,d）,前者计算公式为:Sn=-Σi（piInpi）/InN,pi为第i个种群序列出现的频率,N为总的种群数量。遗传距离用MEGA 7.0计算,核酸替换模型选择TN+G（Tamura-Nei model+Gamma distribution）,同时用校正的Nei-Gojobori method（Jukes-Cantor）+G模型计算同义突变率（Synonymous mutation,dS）及非同义突变率（Nonsynonymous mutation,dN）。借助人工神经网络在线工具NetMHC 4.0 Server和NetMHCⅡ2.3 Server分别预测HLAⅠ、Ⅱ类分子与HBV肽段的亲合力（网址:https://www.cbs.dtu.dk/services/）。结果:1.第三代测序平台PacBio RS II用于HBV全长测序方法具有可行性,平均读长可达到3.4kb,其测序总错误率为2.13%,插入错误为主,其次为缺失和错配,分别为1.45%、0.62%、0.06%。测序读长越长,测序错误率就越低。运用生物信息学方法删除插入错误后总错误率降低到0.69%下。HBV准种分析中将遗传距离阈值设定为0.01,突变筛查阈值设定为3.5%。2.藏族人HBV以C/D重组型为主,且有两种重组类型:C2/D4型与C2/D3型,前者是D4型的1-750nt片段与C2型重组,后者是D3型的1-1500nt片段与C2型发生重组。C2/D4为主要的优势毒株（77.8%）。3.C/D重组型HBV比对照组在preC/C区有更高的复杂度（P=0.006）和非同义突变率（P=0.006）。C/D型HBV准种变异主要集中在EnhⅡ区（1636-1744nt）、BCP区（1742-1849nt）和preS区（2848-152nt）,包括C1653T突变（44.4%）、T1753V/A1762T/G1764A三联突变（44.4%）、preS的缺失突变（33.3%）等。汉族对照样本变异集中在preC、S基因、X基因,包括G1896A变异（35.0%）、sS143T变异（70.0%）,及xV5L变异（75.0%）等。4.藏族人HLAⅡ类分子基因型HLA-DRB1*12:01:01G（55.6%vs 5.6%,P=0.008）、DQA1*05-DQB1*03:01（77.8%vs 16.7%,P=0.004）要多于汉族人,而HLAⅠ类分子中HLA-B*40:01比汉族对照少（0%vs 50.0%,P=0.012）。提示藏族人HLA的遗传背景不同与汉族人。5.HBV X基因36aa（1479nt）位点变异在HLA-DRB1*12:01:01G样本中更多见（66.7%vs 14.3%,P=0.024）,P基因268aa（3108nt）位点变异在HLA-DQA1*05-DQB1*0301样本中更多见（50.0%vs 5.9%,P=0.015）,前者可能位于DRB1*12:01:01G限制的表位区,后者可能位于DQA1*0501-DQB1*0301限制的表位区。提示在藏族人与汉族人在自身不同的HLA遗传背景下,会驱动不同的HBV准种变异。总结:我们探索了第三代测序技术用于HBV全长准种分析的具体方法,确立了HBV准种遗传距离及突变的阈值。发现了C2/D4重组型HBV是藏族人中的优势毒株,同时在HBV全基因组水平探讨了藏族、汉族不同的乙肝病毒准种变异特点。结合HLAⅠ类、Ⅱ类分子的高分辨率分型,初步认识了藏族、汉族人HLA分子的差异,及其对HBV准种变异的限制性。
薛源[3]（2016）在《乙型肝炎病毒基因组CpG DNA片段的准种特点及免疫功能研究》文中研究指明背景与目的乙型肝炎病毒（HBV）基因组中存在富含CpG的DNA片段,包括CpG岛和寡聚脱氧核苷酸片段（CpG ODN）。CpG岛是甲基化介导基因沉默的重要靶区,与病毒复制有关。HBV准种基因组中CpG岛的特征未见报道。本研究第一部分对来源于不同临床感染阶段或结局的、不同基因型的HBV准种基因组中CpG岛的特征进行分析,探讨HBV准种中CpG岛与基因型及临床结局的关系。另外,CpG ODN是Toll样受体9的配体,具有免疫调节功能。第二部分从HBV基因组中筛选CpG ODN,探讨其免疫调控机制和潜在的抗病毒应用价值。研究对象与方法第一部分共纳入40例患者,其中10例急性乙型肝炎（AHB）,9例慢性HBV携带者（免疫耐受期,IT）,11例慢性乙型肝炎（CHB）,10例慢加急性肝衰竭（ACLF）。其中B基因型18例,C基因型22例。通过克隆测序方法得到599个HBV全长基因组序列,分析这些序列中CpG岛的分布、长度和准种异质性。第二部分纳入CHB患者16例,通过体外刺激外周血单个核细胞（PBMC）筛选具有免疫功能的CpG ODN（CpG2408）,分别用流式细胞技术和ELISA方法检测浆液样树突细胞（p DC）的活化和IFN-α的产生。此后,通过尾静脉高压注射p AAV/HBV1.2质粒建立携带HBV小鼠模型,隔天一次静脉注射筛选获得的CpG2408,在造模后第1、4、7、14、21天采血检测HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA和丙氨酸氨基转移酶（ALT）,以验证其可能的抗病毒作用。结果第一部分:HBV基因组中CpG岛的分布和长度在B基因型和C基因型之间有差异。268个B基因型的HBV克隆中,214个（79.85%）含有三个经典的CpG岛（CGI、CGII和CGIII）,169个（63.06%）克隆的CGII呈断裂型;331个C基因型的HBV克隆中,仅40个（12.08%）克隆含有3个CpG岛（CGI、CGII、CGIII）,16个（4.83%）克隆的CGII呈断裂型。B基因型HBV准种中CGI和断裂的CGII较C基因型更常见;B基因型HBV准种中的CGII和CGIII短于C基因型,而两种基因型之间CGII和CGIII的准种异质性无显着差异。对于同一患者的HBV准种中CpG岛分布的一致性,B基因型为18.75%～100%,其中94.44%的患者其一致性>75%;C基因型为0%～100%,其中86.40%的患者其一致性>75%。另外,不同感染结局或阶段的患者外周血HBV基因组中CpG岛的准种特点也不同。AHB组的CGII短于慢性感染组,且其准种异质性低于慢性感染组;在慢性感染的亚组中,IT组的CGII和CGIII均最长,且异质性最低。CHB组和ACLF组之间CGII和CGIII的准种特征均无显着差异。第二部分:体外细胞实验发现来源于HBV基因组的寡聚脱氧核苷酸片段CpG2408可以使p DC细胞内TLR9表达增加,p DC活化并产生大量IFN-α;还可以活化NK细胞,产生少量IFN-γ;动物实验显示CpG2408显着降低HBV携带小鼠的血清HBs Ag和HBV DNA,且呈剂量依赖性;联合重组乙型肝炎疫苗（r HBs Ag）时降低HBs Ag的作用更加明显;联合恩替卡韦时可显着降低小鼠血清HBs Ag和HBe Ag水平。C57BL/6小鼠对CpG2408单用、联合r HBs Ag或恩替卡韦均显示出很好的耐受性。结论HBV全长基因组中CpG岛的准种特点因基因型和感染临床阶段或结局不同而异,具体机制还有待于进一步研究;另外,本研究从HBV基因组中筛选出免疫调节功能较强的寡聚脱氧核苷酸片段CpG2408,可以显着降低HBV携带小鼠的血清HBs Ag及HBV DNA,能否用作抗病毒药物或免疫佐剂,值得进一步研究。
刘妍[4]（2012）在《乙型肝炎病毒基本核心启动子/前核心区和逆转录酶区变异的临床特点与意义研究》文中进行了进一步梳理研究背景：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染可引起多种临床表现，包括无症状HBV携带状态、急性乙型肝炎、轻中度或重度慢性乙型肝炎，并可进一步发展为肝硬化、肝细胞癌和慢加急性肝衰竭。我国有9300万慢性HBV感染者，其中慢性乙型肝炎患者约2000万人，乙肝肝硬化患者约400万人，每年约28万人死于肝细胞癌。而慢加急性肝衰竭患者每年可造成2万多人死亡，其发生与机体对感染病毒产生过强的免疫应答相关，而病毒基因变异可能是引起机体免疫应答异常的一个重要因素。HBV具有高变异特性，虽是DNA病毒，其复制却与逆转录病毒类似存在一个RNA中间体的逆转录过程，而参与此过程的HBV DNA多聚酶/逆转录酶（reverse transcriptase,RT）缺乏严格的校对功能，使病毒复制过程中的碱基错配率明显高于其他DNA病毒。HBV也是高复制率病毒，每天病毒基因组中每个碱基都有发生所有碱基替换的可能。此外，HBV的复制模板共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）半衰期长，稳定存在于感染的肝细胞核中，是HBV持续感染的根本原因。在自然感染状态下HBV是以野生株为优势株的准种群形式存在，根据HBV基因组序列差异分为8种不同的基因型（≥8%）和若干基因亚型（≥4%）。各种基因型HBV的病毒学特点不同，也可影响肝病的临床转归。HBV基因组最常见的热点变异是基本核心启动子（basal core promoter, BCP）区和前核心（precore, PC）区变异。HBV PC区编码的e抗原（hepatitis B e antigen, HBeAg）是一种免疫耐受抗原，而BCP区转录调节HBeAg表达，发生在这两个区的变异可终止或减低HBeAg表达，增强病毒复制力或逃避宿主免疫应答。另一方面，由于HBeAg与HBV核心抗原（HBcAg）共有相同的免疫表位，该区变异也增加了免疫系统对HBcAg的攻击，可能与乙肝进展及重症化相关。研究表明HBV BCP/PC区变异可能与急性重型肝炎的发生相关，但也有不同的研究结果。基因型又可以影响BCP/PC区变异的发生率，增加结果分析的复杂性。关于HBV BCP/PC变异和基因型与慢加急性肝衰竭发生的相关性分析少见报道。本研究的第一部分系统分析了我国临床大样本急性乙肝、轻中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者的BCP/PC区变异和基因型特点以及临床意义，结果有助于理解HBV病毒学特点在乙型肝炎慢性化、重症化机制中的作用。当前，核苷（酸）类似物是临床最常用的抗HBV感染治疗药物，包括三种核苷类，即拉米夫定（lamivudine, LAM）、恩替卡韦（entecavir, ETV）和替比夫定（tebivudine, LdT），两种核苷酸类，即阿德福韦酯（adefovir dipivoxil, ADV）和富马酸替诺福韦酯（tenofovirdisoproxil fumarate, TDF），前四种已在我国临床批准使用。这些药物通过直接靶向HBV RT区而发挥抗病毒作用，但均不能从根本上清除感染肝细胞核中持续存在的HBV cccDNA，一旦停药反跳率高，因此需要长期抗病毒治疗。然而长期抗病毒治疗会使病毒在药物压力下获得适应性变异或使预存于准种群中的极少量变异株获得选择性扩增，产生耐药病毒导致治疗失败，成为临床面临的棘手问题。发生在HBV逆转录酶区的耐药变异分为直接降低药物敏感性的原发耐药变异和增强病毒复制力的补偿变异，还有一些与ADV耐药相关的有争议的变异。随着临床上可选择的药物增多，耐药及交叉耐药的风险增加，变异形式也更加多样化。此外，不适当的核苷（酸）类药物序贯使用促进了多重耐药病毒株的产生。已有的关于耐药变异病毒的研究大多来源于一些临床试验研究，用药方式相对固定，研究的样本量有限，但实际上临床用药方式复杂，引起的HBV耐药变异谱有其特有规律，以往尚缺少大样本分析数据。本研究的第二部分系统分析了我国大样本经核苷（酸）类药物治疗的慢性HBV感染者HBV基因耐药谱，并对1例我们新鉴定的针对LAM、ADV和ETV的新型多重耐药HBV变异株的临床演变特点和感染的临床治疗进行动态分析。结果为全面了解我国临床实际治疗中的HBV耐药谱提供新的信息，对于帮助我国HBV耐药管理的规范化具有重要意义。目的：（1）分析临床较大样本急性乙肝、轻中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者HBV基因型和BCP/PC区变异特点，揭示HBV基因型和BCP/PC区变异在不同病程HBV感染患者的表现特点和与疾病进展的相关性。（2）分析临床较大样本慢性HBV感染者RT区多位点核苷（酸）类似物耐药相关变异及其临床意义，揭示我国临床HBV耐药发生频率、四种核苷（酸）类似物基因型耐药变异特点及多重耐药HBV变异株的演变特点和感染的临床治疗策略。方法：（1）收集182例急性乙肝、325例轻中度慢乙肝、170例重度慢乙肝和298例慢加急性肝衰竭患者血清。提取HBV DNA，应用单管巢式聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR），扩增HBV RT（含S）基因和BCP/PC区基因，对PCR产物进行双向测序。根据RT/S区序列用MEGA4软件进行分子进化树分析确定HBV基因型，用Vector NTI软件比对分析文献报道的具有（潜在）临床意义的10个位点的核苷酸变异，包括BCP区1753、1754、1758、1762、1764、1766和1768位点变异和PC区的1862、1896和1899位点变异。（2）收集1803例经核苷（酸）类似物长期治疗的慢性HBV感染患者血清，扩增HBVRT区全长基因，对PCR产物进行双向测序，分析rt80、rt84、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt214、rt215、rt217、rt233、rt236和rt250共15个位点的耐药相关变异特点。并进一步对1例新型多重耐药HBV感染患者系列血清样本的耐药变异及HBVDNA载量、转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）等指标进行检测，结合克隆测序（>20个克隆/样本/时间点）结果，分析多重耐药HBV株的动态演变规律、表型耐药特点和感染的临床治疗策略。结果：（1）急性乙肝患者HBV B基因型与C基因型比例和BCP/PC区野生株比例显着高于慢性乙肝患者。急性乙肝患者HBV BCP区A1762T、G1764A和前C区G1896A、G1899A的检出率显着低于慢性乙肝患者，但BCP区T1758C的检出率却显着高于慢性乙肝患者，且T1758C变异与A1762T/G1764A变异有相互排斥倾向。与C基因型HBV相比，B基因型HBV BCP区变异频率更低，PC区变异频率相似。在含四种基本BCP/PC变异模式的急性乙肝患者间ALT水平相似，而含PC区变异的慢性乙肝患者ALT水平更高；含有BCP/PC区双变异的急性乙肝患者HBV DNA载量更高，而相应的慢性乙肝患者HBV DNA载量更低；急性乙肝患者的HBeAg阴性率高于慢性乙肝患者，且BCP/PC区双变异的急性乙肝患者HBeAg阴性率更高，而慢性乙肝患者随着BCP/PC区变异的累积HBeAg阴性率呈逐级增高趋势。（2）与慢性乙肝患者相比，慢加急性肝衰竭患者HBV BCP区T1753C/A/G、A1762T、G1764A、C1766T变异频率和前C区G1862T、G1896A、G1899A变异频率显着增高。而且，A1762T/G1764A双联变异和G1896A热点变异频率以及10个分析位点的平均碱基替代数目随着疾病进展（轻中度慢乙肝＜重度慢乙肝＜慢加急性肝衰竭）逐级增高。与C基因型HBV相比，B基因型HBV的BCP区变异频率明显降低，而PC区变异频率明显增高。与HBV BCP区变异不同的是，在上述三种疾病类型中HBV PC区变异均显着影响HBeAg向抗HBe的血清学转换。此外，感染了PC变异株的慢加急性肝衰竭患者比感染了PC野生株的患者病死率明显增高。（3）1803例患者中有560例检出耐药相关变异，其中214例来自490例接受LAM单一治疗的患者，35例来自428例接受ADV单一治疗的患者，5例来自18例接受LdT单一治疗的患者以及306例来自794例接受序贯或联合抗病毒治疗的患者，而在73例接受ETV单一治疗的患者中未检出耐药变异。381例接受LAM耐药后换成ADV继续治疗患者中有36例（9.4%）检出ADV耐药变异，而LAM耐药后加用ADV继续治疗的82例患者中仅1例（1.2%）检出ADV耐药变异。ETV耐药变异不仅在LAM和ETV经治的患者中检出，而且在LAM单一治疗的患者中也检出。tL180M+rtM204I双变异株检出频率在C基因型HBV较B基因型HBV更常见，并且感染了此种双变异株的患者ALT水平明显高于感染了rtM204I单一变异HBV株的患者。值得注意的是，在8例患者中检出多重耐药HBV变异株。（4）我们对1例新型多重耐药HBV变异株感染的慢乙肝患者进行随访，该患者自2002年6月起先后序贯接受了长达116个月的抗病毒治疗，即10个月的LAM与干扰素-α2b联合治疗、23个月的LAM单一治疗、13个月的ADV单一治疗、12个月的ETV单一治疗、12个月的ADV与干扰素-α2b联合治疗、6个月的ADV单一治疗、40个月的ADV加用LAM联合治疗。目前HBV DNA维持检测不到水平，ALT水平正常。克隆测序显示病毒准种池中多重耐药HBV株的动态演变过程，即由最初的野生株，LAM耐药株rtM204I，ADV耐药株rtA181V和rtA181T， LAM耐药株rtL180M+rtM204V， ETV耐药株rtL180M+rtS202G+rtM204V， ADV耐药株rtN236T±rtA181T，多重耐药株rtL180M+rtA181V+rtS202G+rtM204V+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V+rtN236T，到ETV耐药株rtL180M+rtS202G+rtM204V。结论:（1）感染了B基因型HBV、BCP/PC区野生型HBV、BCP区T1758C变异型HBV更易发展为急性乙肝，而慢性乙肝的发生与BCP/PC区变异的累积密切相关。（2） HBV BCP/PC区变异与慢性乙肝的疾病进展呈正相关，BCP/PC区变异HBV感染的慢乙肝患者更易发生重症肝炎以及慢加急性肝衰竭，具有PC变异株的慢加急性肝衰竭患者具有更高死亡风险。（3）虽然仅四种核苷（酸）类药物在我国临床使用，临床上实际抗病毒治疗组合方案多达40余种，HBV耐药变异形式也复杂多样，长期不规范用药促进了耐药及多重耐药HBV变异株的产生，为治疗带来更大的挑战。HBV基因型耐药谱的数据分析对于我国乙肝耐药管理具有重要临床意义。（4）多重耐药病毒是在病毒准种池中复杂的单药和双药耐药病毒基础上产生的。该病例中鉴定的三种新型多重耐药HBV株为国际上首次报道，并且在我国目前TDF未上市的情况下应用LAM与ADV联合治疗可抑制多重耐药HBV株的复制。结果为我国治疗多重耐药HBV感染提供了借鉴。
丁花花[5]（2012）在《乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA逆转录酶区准种特性分析及耐药相关位点变异观察》文中指出研究病毒准种及其耐药种群的动态分布，是阐明病毒耐药和病毒学突破发生、发展的关键所在。本文主要从两部分进行研究：一、未抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者肝内HBVcccDNA和血清HBV DNA逆转录酶（reverse transcriptase，RT）区准种特性的比较分析；二、慢性乙型肝炎患者治疗前后肝内HBV cccDNA耐药相关位点变异的观察。一、未抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者肝内HBV cccDNA和血清HBV DNA RT区准种特性的比较分析目的了解未经核苷类似物抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者肝内HBV cccDNA和血清HBV DNART区准种的组成情况以及两者之间的关系。方法纳入26例未经核苷类似物抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者，留取其肝穿组织和血清，并分别抽提肝组织HBV tDNA和血清HBV DNA；先以不降解质粒的ATP依赖DNA酶（PSAD）酶切纯化肝组织HBV tDNA，利用实时荧光定量PCR法定量肝内HBV cccDNA和血清HBVDNA，根据定量结果，以跨双缺口引物行巢式聚合酶链反应（PCR）扩增HBV cccDNA的RT区，以非跨双缺口引物行巢式PCR扩增血清HBV DNA的RT区；应用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，然后对目的片段进行克隆，主要包括重组质粒的构建、小量制备、酶切鉴定，最后对目的片段进行直接测序；根据测序结果，分析肝内HBV cccDNA和血清HBV DNART区准种的组成并比较分析两者间的关系。结果肝内HBV cccDNART区准种数为4～22，血清HBV DNA RT区准种数为3～20，肝内HBV cccDNA RT区和血清HBV RT区两者的准种数差异尚无统计学意义（p>0.05）；肝内HBV cccDNA和血清HBV DNART区优势准种核苷酸序列部分（5/26例）一致，部分（21/26例）不一致；肝内HBV cccDNA和血清HBV DNART区准种复杂度在核苷酸水平和氨基酸水平的差异均无统计学意义（p>0.05）；肝内HBV cccDNA和血清HBV DNART区准种多样性在核苷酸水平和氨基酸水平的差异均无统计学差异（p>0.05）。结论1、证实了肝内HBV cccDNA准种的存在。2.在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者肝内HBV cccDNA和血清HBV DNA RT区准种数量差异无统计学意义；肝内HBV cccDNA和血清HBV DNART区优势准种不完全一致；两者准种复杂度和多样性之间差异无统计学意义。二、慢性乙型肝炎患者治疗前后肝内HBV cccDNA耐药相关位点变异的观察目的了解慢性乙型肝炎患者肝内HBV cccDNA耐药相关位点自然变异的发生情况及抗病毒治疗前后，肝内HBV cccDNA耐药相关变异位点野生型与变异型所占比例变化情况方法纳入了13例间隔约12月先后两次肝穿的慢性乙型肝炎患者，抽提冰冻肝组织获得HBV DNA抽提液，通过酶切纯化、荧光定量PCR法定量肝内HBVcccDNA和血清HBV DNA；应用PCR、巢式PCR和直接测序法检测治疗前后肝内HBVcccDNA耐药相关位点变异；对肝内HBV cccDNA的RT区克隆测序分析。结果发现3例（3/13）存在肝内HBV cccDNA耐药相关位点自然变异；发现1例（1/13）抗病毒治疗后发生肝内HBV cccDNA耐药相关位点变异；上述4例（4/13）患者在核苷类似物抗病毒治疗后肝内HBV cccDNA耐药相关变异位点野生型与变异型所占比例发生了变化。结论1.证实了肝内HBV cccDNA存在耐药相关位点自然变异；2.在核苷类似物抗病毒治疗后肝内HBV cccDNA耐药相关变异位点野生型与变异型所占比例可能发生变化。
许俊钢,张跃新[6]（2009）在《乙型肝炎病毒准种的研究现状》文中研究说明随着乙型肝炎病毒（HBV）研究的深入,准种的理论得到广泛的认可。准种的引入有助于从整体和动态的角度认识HBV的生物学特征。本文就准种的概念和研究方法,以及准种与临床的关系作一综述。
许鸿志,任建林,毛乾国,陈美娅,周飞,张志平,卢雅丕,潘金水,蔡稼燕,董菁[7]（2009）在《一种新的HBeAg阴性慢性乙型肝炎病毒变异机制》文中研究说明目的检测HBV核心启动子区（CP）基因变异方式。方法自HBV慢性感染患者血清中提取HBV DNA,扩增CP区域序列,克隆入pMD19 T载体,选择阳性克隆进行DNA测序,与已知HBV基因相应序列比较患者体内HBV基因变异位点以及变异形式。结果自21例患者中共挑选74个克隆测序,54个克隆中病毒基因序列CP区发生大段缺失突变,长度达234个核苷酸,另有1个克隆发生245个核苷酸缺失突变。缺失突变区域包括CP区、HBeAg起始密码子和直接重复序列（DR）Ⅰ区,命名为CP缺失突变,发生CP缺失突变的病毒株同时存在A1585T替换突变,这两个部位的突变具有联动特征。结论观察到一种导致HBeAg阴性慢性乙型肝炎的新方式,即CP、HBeAg起始密码子缺失突变,并提出一种简明的CP缺失检测方式。
张华[8]（2009）在《江西省HBV基因变异情况及其与慢性乙肝临床表现和抗病毒疗效关系的研究》文中研究表明第一部分采用多对型特异型引物巢式PCR法检测江西省HBV基因型分布及其与乙型病毒性肝炎临床关系的研究目的:了解江西省慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒（HBV）基因型的分布情况,HBV基因型与临床的关系。方法:选择HBV-DNA阳性的江西籍慢性乙型肝炎患者血清150份,患者分别诊断为慢性HBV携带者、慢性肝炎轻度、中度、重度和慢性重型肝炎,每组30例,采用多对型特异性引物巢式PCR法检测HBV基因型。结果:本组慢性乙型肝炎患者HBV基因分型结果为B型118例（78.7%）,C型31例（20.7%）, D型1例（0.6%）;在上述5组患者中C型比例分别为0%,16.7%,26.7%,30.0%和30.0%,其中慢性HBV携带者与其他组比,差异有统计学意义（P<0.05）;B、C两基因型患者HBeAg阳性率分别为83.9%（99/118）和90.3%（28/31）,HBeAb阳性率分别为16.1%（19/118）和9.7%（3/31）,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:江西地区HBV优势基因型以B型为主,C型次之,有少量的D型感染者。C基因型HBV引起疾病的临床病情较B型严重。第二部分巢式PCR-RFLP法对江西省乙型肝炎病毒Bj和Ba基因亚型的初步鉴定目的:通过检测江西省乙型肝炎病毒（HBV）基因亚型（Ba和Bj）的分布情况,了解HBV基因亚型与HBV致病性的关系,希望能藉此阐述相同基因型HBV可导致不同病情的机制。方法:随机选取经多对型特异性引物巢式PCR法鉴定为B基因型HBV的血清标本60例,包括慢性HBV携带者30例,慢性乙型肝炎患者各30例,采用巢式PCR-RFLP法鉴定其基因亚型（Ba和Bj）。结果:60例B型HBV经鉴定均为Ba型,没有发现Bj型。结论:江西省B基因型HBV可能主要为Ba亚型。相同基因型导致不同病情的机制可能还与其他因素如准种有关。第三部分熔点曲线法研究拉米夫定临床耐药与HBV准种相关性目的:研究HBV准种与拉米夫定耐药的关系,指导临床用药。方法:随机选取经拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者,治疗前30例,治疗后发生HBV变异30例,病毒反弹但经检测未发生变异30例,HBV P区经聚合酶链反应扩增后再采用熔点曲线法分析HBV准种数量。同时也对HBV C区、S区准种进行对比。结果:拉米夫定治疗前患者体内HBV P区准种数量为8.37±0.93个,病毒反弹组准种数量为5.30±0.95个,病毒变异组准种数量2.50±0.86个。三组间两两比较,P均小于0.05。HBV C区治疗前组准种数量为6.33±1.64个,病毒反弹组准种数量为6.37±1.81个,病毒变异组准种数量6.10±1.86个。三组间两两比较,P均大于0.05。HBV S区治疗前组准种数量为5.77±2.11个,病毒反弹组准种数量为6.17±1.93个,病毒变异组准种数量5.23±1.85个。三组间两两比较,P均大于0.05。结论:在拉米夫定的作用下HBV P区准种数量逐渐减少,发生变异后劣势耐药病毒株变为优势病毒株易检测到。拉米夫定对HBV C区、S区作用不明显。
陈立,张欣欣[9]（2009）在《丙型和乙型肝炎病毒准种异质性的临床意义》文中研究指明 所谓准种是指一群复杂的、不相同的但又密切相关的、呈动态分布的复制体。由于病毒RNA（DNA）聚合酶缺乏校正活性,在复制过程中可发生错配,在体内出现大量基因序列差异而在遗传学上又密切相关的病毒变异体,表现为高度的异质性。准种异质性包括2个层面的含义:一是准种复杂度,指在同一个病毒群体里不同的病毒准种数所占的比例;二是准种多样性,指在同一个病毒群体里不同病毒准种之间的遗传距离。近年研究表明,准种异质性与肝炎病毒感染后的临床转归、病情进展和抗病毒疗效有关。本文就HCV和HBV的准种异质性与疾病进展转归以及抗病毒疗效的关系作一综述。
鲁晓擘[10]（2007）在《新疆维吾尔族乙型肝炎病毒基因型分布、准种特性及其生物学意义研究》文中研究表明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是严重威胁人类健康的传染性疾病,同时也是严重的公共卫生问题之一。HBV感染可导致多种形式的急慢性肝病,目前已明确,HBV是引起慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌的重要病因之一。HBV基因组具有异质性特点是生存进化的必然结果,是适应生存环境的必然需求。HBV基因型和准种是其异质性的具体体现。HBV基因型是HBV重要的生物学特性。到目前为止,根据HBV全基因组序列异质性≥8%的原则,HBV可分为A、B、C、D、E、F、G、H8种基因型。研究提示,HBV在全球的分布具有显着的地域分布特点和种族分布特异性。A型主要分布于欧洲、非洲、美国和亚洲国家;B型主要分布于中国大陆、中国香港、印度尼西亚和日本等亚洲国家和地区;C型主要分布于东南亚国家、日本、韩国、孟加拉国和中国等远东亚洲国家;D型主要分布于中东地区;E型仅见于西部非洲;F、G型主要分布于中美洲、南美洲地区;H型是新发现基因型,主要在中美洲和南美洲,分布仍需进一步调查。我国的研究显示中国HBV主要以B、C型为主。准种是体内HBV的存在形式。基因变异是物种进化中经常发生的遗传事件。对HBV而言,核酸的突变则造成体内同时存有基因序列有微小差别的种群,种群的各个成员之间,其差别程度一般不会超过核苷酸总长度的2%～5%（通常以4%界定）,这种差别不足以构成病原体不同的基因型或血清型,但又的确存在着基因序列的差别,这种现象就称为准种（quasispecies）。研究准种具有重要的临床意义,主要表现在:对抗HBV治疗药物的影响;机体的免疫压力以及抗病毒药物的选择压力在HBV准种形成过程中的地位和作用;HBV准种的形成与急性HBV感染的慢性化;慢性HBV感染的临床转归等方面。HBV基因型和准种特性的研究将有助于对HBV的临床转归、HBV抗病毒疗效、HBV基因突变特点等问题的再认识和研究的深入,对研究HBV的生物学特性具有重要意义。我国为多民族国家,特别是新疆地处祖国西北,多民族聚居,各民族HBV感染者HBV的生物学特性（HBV基因型、准种）有无差异,此种差异如何及与临床的关系值得研究。目的:本研究初步探讨新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布特点及其与临床的关系。通过研究可完善我国不同民族HBV基因型分布资料库,丰富HBV分子流行病学的内容,可以更好地指导临床上抗病毒药物的选择和使用。其次,更深入和全面地了解HBV的生物学特性,探讨HBV-RT区准种特性以及抗病毒治疗（拉米夫定）对准种的影响,深刻揭示准种特性及其生物学意义,这具有重要的理论意义和实践意义。课题主要进行了三方面研究:1)新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布特点及其与临床的关系;2)新疆维吾尔族慢性乙肝患者基因D型HBV株的全基因克隆化研究;3)新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV-RT区准种特性及其生物学意义研究。方法:1)选择127例维吾尔族慢性乙肝患者为主要研究对象,诊断符合我国2005年“病毒性肝炎防治方案”标准。共采集127份血清,-20℃冻存备用。采用基因型特异性引物巢式PCR法进行基因分型,并对部分标本测序验证。采用生物信息学软件进行分析。统计学处理应用SPSS12.0版本统计分析软件进行率的比较（x2检验）;2)应用分子克隆技术和生物信息学技术对1例维吾尔族HBV基因D型病毒株进行全基因克隆化研究;3)选择5例维吾尔族慢性HBV感染者为主要研究对象,选择HBV RT区为研究靶区。其中慢性乙肝患者4例,另1例为肝炎肝硬化（代偿期）患者;2例为接受拉米夫定治疗停药后复发的病例,3例为未接受抗病毒治疗的患者;基因D型3例,基因B型2例。均来自新疆医科大学第一附属医院感染科。诊断符合我国2005年“病毒性肝炎防治方案”标准。采集血清,-20℃冻存。采用克隆-测序和构象敏感凝胶电泳（CSGE）方法进行准种研究。并进行生物信息学分析和临床分析。结果:1)初步探讨新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布及其特点。结果显示,基因D型占39.4%（50/127）,基因B型占22.0%（28/127）,基因C型占16.5%（21/127）,基因B+D混合型占9.5%（12/127）,基因C+D混合型占8.7%（11/127）,基因B+C+D混合型占3.9%（5/127）;HBeAg阳性与HBeAg阴性的维吾尔族慢性乙肝患者基因型分布比较无统计学的差异（x2=6.033,P=0.303）;不同年龄维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布并无统计学的差异（x2=3.137,P=0.679）;不同性别维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布亦无统计学的差异（x2=8.058,P=0.623）。初步研究提示,新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型以D型占优势,其次可见B、C型及B+D、C+D、B+C+D混合型。同一疾病谱的慢性HBV感染者基因型分布可能与宿主HBeAg状态、年龄、性别无明显相关;2)应用分子克隆技术和生物信息学技术对1例维吾尔族HBV基因D型病毒株进行全基因克隆化研究。获得了我国首例维吾尔族慢性HBV感染者D型HBV病毒株的全基因序列（已在GenBank上注册）。结果显示,其基因组全长为3174bp,与目前D基因型参照序列比较同源性约为92%～98%,与一株来自中国的DC重组基因型（AY862865）比较同源性约为91%。进一步分析发现,该新疆病毒株与目前D基因型参照序列比较有9个碱基的缺失（位于核苷酸1760-1768位,ATT AAA GGT）,即发生了缺失突变。该新疆株HBV血清型为ayw2,与中国首例D基因型病毒株（GenBank Accession Number:AF280817）的ayw3血清型不同,说明新疆维吾尔族D基因型HBV病毒株依然有其自身特点。重组位点分析,该新疆病毒株未发生与其他基因型的重组。系统进化树分析,该新疆株与两株来自土耳其的HBV株（AY796032和AY721605）遗传距离最近;3)对准种的研究显示,治疗的患者（拉米夫定）HBV准种复杂性似要高于未治疗者,未经药物选择下HBV准种组成相对较单一。治疗和未治疗患者HBV的优势克隆均发生了rtA222T（A,丙氨酸;T,苏氨酸）突变,rtA222T突变是一较少见的突变形式。HBV准种群会发生漂变,即病情重时其准种复杂性低,病情好转时复杂性上升。结论:1)初步研究提示,新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型以D型占优势,D型为优势基因型;其次可见B、C型及B+D、C+D、B+C+D混合型。与我国主要流行的HBV基因B型和C型的分布有显着地域和种族差别。同一疾病谱的慢性HBV感染者基因型分布可能与宿主HBeAg状态、年龄、性别无明显相关;2)通过HBV全基因克隆化研究,获得我国首例维吾尔族慢性HBV感染者D型HBV病毒株的全基因序列（在GenBank上注册）。其基因组全长为3174bp,该新疆病毒株与目前D基因型参照序列比较有9个碱基的缺失（位于核苷酸1760-1768位,ATT AAA GGT）。其血清型为ayw2。重组位点分析,该新疆病毒株未发生与其他基因型的重组。进化树分析发现,该新疆株与两株来自土耳其的HBV株（AY796032和AY721605）遗传距离最近。新疆维吾尔族D基因型HBV病毒株依然有其自身特点;3)新疆维吾尔族慢性HBV感染者的HBV RT区基因序列准种研究显示,治疗患者（拉米夫定）HBV准种复杂性似要高于未治疗者,未经药物选择下HBV准种组成相对较单一。准种组成与是否抗病毒治疗可能相关,且相互影响。治疗和未治疗患者HBV的优势克隆均发生了rtA222T（A,丙氨酸:T,苏氨酸）突变,rtA222T突变是一较少见的突变形式。HBV准种群会发生漂变,即病情重时其准种复杂性低,病情好转时复杂性上升。准种群漂变与疾病转归可能相关。
二、乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异特点的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异特点的研究（论文提纲范文）
（1）HIV/HBV合并感染治疗队列HBV变异特征及其对长期HBV病毒学应答和炎性反应的影响（论文提纲范文）
| 中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 HIV/HBV合并感染者治疗前HBV全基因组变异特征 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HIV/HBV合并感染者治疗前HBV PRES准种变异特征 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HIV/HBV合并感染队列HBV PRES准种缺失对长期HBV病毒学应答和炎性反应的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间的成果 |
| 致谢 |
（2）藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 第三代测序用于HBV准种分析的方法学研究 |
| 2.1 研究对象及材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 藏族人群HBV准种变异特征研究 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 藏族人群HBV准种HLA限制性研究 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV准种变异及其HLA限制性研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）乙型肝炎病毒基因组CpG DNA片段的准种特点及免疫功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 不同感结局患者的外周血HBV基因组中CpG岛的准种特染阶段或征分析 |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒基因组中CpG寡聚脱氧核苷酸片段的免疫功能研究 |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的主要成绩 |
（4）乙型肝炎病毒基本核心启动子/前核心区和逆转录酶区变异的临床特点与意义研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 HBV BCP/PC 区基因变异特点和基因型特点与疾病进展的相关性分析 |
| 第一节 急性乙肝和慢性乙肝患者 HBV BCP/PC 区基因变异和基因型特点及临床意义分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 慢性乙肝轻中度、重度和慢加急性肝衰竭患者 HBV BCP/PC 区基因变异和基因型特点及临床意义分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 HBV 逆转录酶区耐药基因变异特点及临床意义分析 |
| 第一节 1803 例经核苷（酸）类药物治疗的慢性 HBV 感染患者 RT 区耐药相关变异特点及临床意义分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 新型多重耐药 HBV 变异株的演变特点及其感染的临床治疗分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的代表性论文全文 1 篇 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA逆转录酶区准种特性分析及耐药相关位点变异观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写及符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分未抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者肝内 HBV cccDNA 与血清 HBV DNA RT 区准种特性的比较分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本部分研究小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 慢性乙型肝炎患者治疗前后肝内 HBV cccDNA 耐药相关位点变异的观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本部分研究小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要参与课题与研究 |
| 致谢 |
（6）乙型肝炎病毒准种的研究现状（论文提纲范文）
| 一、准种的概念 |
| 二、HBV准种的研究方法 |
| (一) 直接测序法 |
| (二) 单链构象多态性分析法 (SSCP) |
| (三) 异源双链泳动分析法 (HMA或HDA) |
| (四) 构象敏感凝胶电泳 (CSGE) 法 |
| (五) 毛细管电泳法 |
| 三、准种与临床的关系 |
| (一) 准种与抗病毒药物 |
| 1. 准种与核苷类抗病毒药物 |
| 2. 准种与干扰素 |
| (二) HBV准种与临床表现 |
| (三) HBV准种与免疫 |
| 1. 准种与免疫逃逸 |
| 2. 准种与免疫激活 |
| 四、HBV准种研究的展望 |
（8）江西省HBV基因变异情况及其与慢性乙肝临床表现和抗病毒疗效关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 HBV 基因型与乙型病毒性肝炎临床关系的研究 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 统计学处理 |
| 1.5 结果与分析 |
| 第二部分 巢式PCR-RFLP法对乙型肝炎病毒Bj和Ba基因亚型的初步鉴定 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 第三部分 采用熔点曲线监测拉米夫定治疗的乙肝患者体内HBV 准种变化的研究 |
| 3.1 熔点曲线法中 2%SYBR Green I 荧光染料最佳浓度的确定 |
| 3.2 熔点曲线法研究拉米夫定临床耐药与 HBV P 区准种相关性 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 材料 |
| 3.2.3 主要方法 |
| 3.2.4 统计学处理 |
| 3.2.5 结果 |
| 3.3 熔点曲线法研究拉米夫定临床耐药与HBV C 区准种相关性 |
| 3.3.1 研究对象 |
| 3.3.2 材料 |
| 3.3.3 引物 |
| 3.3.4 主要方法 |
| 3.3.5 统计学处理 |
| 3.3.6 结果 |
| 3.4 熔点曲线法研究拉米夫定临床耐药与HBV S 区准种相关性 |
| 3.4.1 研究对象 |
| 3.4.2 材料 |
| 3.4.3 引物 |
| 3.4.4 主要方法 |
| 3.4.5 统计学处理 |
| 3.4.6 结果 |
| 讨论 |
| 一、采用多对型特异型引物巢式 PCR 法检测江西省 HBV 基因型与乙型病毒性肝炎临床关系的研究 |
| 二、巢式 PCR-RFLP 法对江西省乙型肝炎病毒 Bj 和 Ba 基因亚型的初步鉴定 |
| 三、采用熔点曲线监测拉米夫定治疗的乙肝患者体内 HBV 准种变化的研究 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读硕士学位期间的成果 |
（10）新疆维吾尔族乙型肝炎病毒基因型分布、准种特性及其生物学意义研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.研究背景 |
| 2.本研究的主要目的 |
| 3.研究内容 |
| 第一部分 新疆维吾尔族HBV基因型分布及其特点 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 HBV血清学标志检测 |
| 1.6 血清HBV DNA提取 |
| 1.7 HBV基因分型 |
| 1.8 PCR产物测序 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 维吾尔族HBV基因D型病毒株的全基因克隆化研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要试剂盒 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 血清HBV DNA提取 |
| 1.7 HBV全基因扩增 |
| 1.8 PCR产物的纯化回收 |
| 1.9 HBV全基因克隆 |
| 1.10 HBV全基因测序及序列分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 维吾尔族HBV RT区基因序列准种特性研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要试剂盒 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 血清HBV DNA提取 |
| 1.7 巢式PCR扩增HBV RT区基因 |
| 1.8 PCR产物的纯化回收 |
| 1.9 目的DNA克隆 |
| 1.10 阳性克隆的筛选 |
| 1.11 CSGE检测HBV RT区变异 |
| 1.12 HBV准种特性分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 攻读博士学位期间参编着作 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异特点的研究（论文参考文献）
- [1]HIV/HBV合并感染治疗队列HBV变异特征及其对长期HBV病毒学应答和炎性反应的影响[D]. 聂源. 广州医科大学, 2019
- [2]藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究[D]. 蔡林. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [3]乙型肝炎病毒基因组CpG DNA片段的准种特点及免疫功能研究[D]. 薛源. 上海交通大学, 2016(05)
- [4]乙型肝炎病毒基本核心启动子/前核心区和逆转录酶区变异的临床特点与意义研究[D]. 刘妍. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(10)
- [5]乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA逆转录酶区准种特性分析及耐药相关位点变异观察[D]. 丁花花. 第二军医大学, 2012(10)
- [6]乙型肝炎病毒准种的研究现状[J]. 许俊钢,张跃新. 实用肝脏病杂志, 2009(05)
- [7]一种新的HBeAg阴性慢性乙型肝炎病毒变异机制[J]. 许鸿志,任建林,毛乾国,陈美娅,周飞,张志平,卢雅丕,潘金水,蔡稼燕,董菁. 中华传染病杂志, 2009(06)
- [8]江西省HBV基因变异情况及其与慢性乙肝临床表现和抗病毒疗效关系的研究[D]. 张华. 南昌大学, 2009(03)
- [9]丙型和乙型肝炎病毒准种异质性的临床意义[J]. 陈立,张欣欣. 中华传染病杂志, 2009(05)
- [10]新疆维吾尔族乙型肝炎病毒基因型分布、准种特性及其生物学意义研究[D]. 鲁晓擘. 新疆医科大学, 2007(09)