一、HBV3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达（论文文献综述）
孙杨[1]（2021）在《基于比较转录组学分析代谢改造粘质沙雷氏菌JNB5-1高效合成灵菌红素》文中研究表明灵菌红素（Prodigiosin,PG）是主要由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）产生的一种次级代谢产物,由于其具有免疫抑制和抗癌活性,并且可以替代合成着色剂,有望成为食品着色剂的来源等特性,微生物法合成PG已引起越来越多的关注。S.marcescens JNB5-1可以在30℃时高效合成PG,但在37℃或更高的温度下其合成PG的能力会明显受到抑制,研究其受温度调控对于指导PG工业化生产具有重要意义。本研究通过比较转录组学分析初步解析了温度调控灵菌红素合成的机制,并以此为基础,对S.marcescens JNB5-1进行了系统代谢工程改造,显着提高了重组粘质沙雷氏菌合成PG的效率,主要研究结果如下:（1）对粘质沙雷氏菌灵菌红素合成型（30℃培养）和非合成型（37℃培养）分别在12 h、24 h、36 h取样,通过转录组测序探索PG合成的机制。首先,合成型分别在profile0、1、3中富集到871、422、1029个差异基因,非合成型分别在profile 4、7、6中富集到792、613、684个差异基因。其次,合成型和非合成型之间分别鉴定出751、1702、1941差异表达基因。具体而言,低温有利于PG合成基因簇基因的转录表达,而较高温度则导致翻译、二硫键等基因转录水平下降（暗示蛋白质的不稳定）。同时,群体感应（AI-2）,双组分调节系统（Pho BR和Kdp DE）和sRNA（Csr A和Hfq）等相关基因的转录水平在30℃时上调,以调节PG的生物合成,并参与菌株的毒力和PG的外排。此外,与PG合成相关的代谢途径,例如丙酮酸、不饱和脂肪酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸代谢途径,其编码基因响应温度调控,并且代谢流在30℃时指向PG的生物合成。然而,抑制因子Cpx AR、CRP、Glr KR和Ssr S的转录水平在37℃发生了上调,可能与粘质沙雷氏菌在37℃不能合成PG有关。（2）在37℃或更高温度下,PG合成途径中的氧甲基转移酶（PigF）的转录水平急剧下降。因此,我们尝试通过设计多聚核苷酸片段（polynucleotide fragment,PNF）并将其引入pig F基因和灵菌红素合成基因簇来改善PigF及基因簇的转录稳定性,并观察其对PG产生的影响。首先,利用gfp作为报告基因发现,在3’-UTR添加PNF可以显着提高其mRNA的半衰期。其次,对PNF工作原理进一步分析发现,PNF改变了基因转录水平而不是翻译速率,从而增加了蛋白质表达量。当PNF长度在9 nt和12 nt之间,腺嘌呤的占比约为73-84%时,PNF更有效的改善基因的表达。最后将效果最好的PNF“AAATTT”引入pig N基因,发现PNF可以有效地提高粘质沙雷氏菌合成PG的能力,重组菌在37℃液体LB培养基中能合成PG。（3）随后,通过理性设计二硫键来消除PigF中游离的半胱氨酸进而提高PigF的热稳定性。首先,通过定点突变获得PigF突变酶G176C/M245CPigF、S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF,并验证其二硫键的形成。其次对突变酶热稳定性研究发现,突变酶在热稳定性和半衰期方面具有较为明显的提高,G176C/M245CPigF（6.70 min）、S53CPigF（8.15 min）和G176C/M245C/S53CPigF（8.31 min）的半衰期分别是野生型PigF（4.42 min）半衰期的1.52、1.84和1.88倍。尤其是G176C/M245C/S53CPigF的催化效率和比酶活方面较原始酶分别提高了56.0%和50.1%。最后,分子动力学模拟结果表明二硫键的引入并没有显着改变突变酶的二级结构但提高了酶的刚性,从而提高了热稳定性。（4）CpxR蛋白是革兰氏阴性细菌中的OmpR家族转录调节因子。首先,通过q PCR对cpx系统动态转录水平分析发现,该系统响应温度变化,在37℃时cpx系统相关基因的转录水平上升,而在30℃时其转录水平降低。其次,S.marcescens JNB5-1中cpxR的插入失活增加了PG的合成量,发现在JNB5-1ΔcpxR中,涉及pig基因簇以及脯氨酸、丙酮酸、丝氨酸、蛋氨酸、S-腺苷蛋氨酸等代谢途径中的基因的转录水平均显着增加,从而促进了PG的合成。最后,EMSA结果表明,CpxR可以与pig基因簇的启动子结合,并抑制JNB5-1中PG生物合成相关基因的转录水平,从而调控灵菌红素合成。细菌双杂交、Pull-down和体外磷酸化实验确定第51位天冬氨酸为CpxR的关键磷酸化位点且CpxRD51A不能与pig基因簇的启动子结合,从而确认JNB5-1通过磷酸化激活转录CpxR行使调控功能。（5）通过组合优化粘质沙雷氏菌中灵菌红素合成基因簇基因转录稳定性、PigF蛋白稳定性、解除CpxR的抑制、重塑PG合成代谢流,获得一株高产PG重组菌株JNB5-1/S4。经1L摇瓶发酵实验,JNB5-1/S4在30℃合成PG最高产量可达10.03 g/L,比原始菌JNB5-1提高了86.8%;在37℃合成PG最高产量可达0.87 g/L,比JNB5-1高129.6%。
高知枭[2]（2020）在《SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究》文中指出核盘菌是一种典型的死体营养型植物病原真菌,在世界范围都有广泛分布,可侵染包括油菜、大豆、向日葵等重要经济作物在内的729种植物,造成严重的经济损失。真菌病毒是感染真菌的病毒,在核盘菌中广泛存在,其中一些真菌病毒会导致核盘菌致病力衰退,甚至丧失致病力,具有控制作物菌核病的潜力。实验室前期从弱毒菌株AH98中分离鉴定出与核盘菌致病力衰退相关的单股负链RNA病毒Sclerotinia sclerotiorum negative-stranded RNA virus 1（Ss NSRV-1）,研究表明该病毒基因组上线性分布有6个非重叠的ORF（ORF I-VI）,分别编码P1、P2（N蛋白）、P3、P4、P5（L蛋白）和P6蛋白,这些ORF的具体功能及其对核盘菌的影响并不清楚;同时,发现菌株AH98可能被多种病毒复合侵染,但并不明确这些病毒的分子特性。本研究以菌株AH98及前期获得的Ss NSRV-1基因ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF VI的核盘菌1980菌株超表达转化子为研究材料,通过高通量测序明确了菌株AH98携带的病毒种类及分子特性;基于生物信息学分析预测了Ss NSRV-1各个ORF的结构和功能;结合转录组和代谢组分析,揭示了Ss NSRV-1各个ORF对核盘菌的影响,初步探究了Ss NSRV-1导致核盘菌出现弱毒特性的分子机理,揭示了Ss NSRV-1与核盘菌互作的分子网络。取得的具体研究结果如下:通过高通量测序明确了菌株AH98中携带6种真菌病毒,包括2种-ss RNA病毒,即Ss NSRV-1与Ss NSRV-5X;4种+ss RNA病毒,分别命名为Bc HV1/AH98、Ss MV30/AH98、Ss MV7-A/AH98和Ss DFV2/AH98。Ss NSRV-5X全长为9993 nt,5’端没有帽子结构,3’端也没有poly A序列,5’-UTR为420 nt,3’-UTR为168 nt。预测编码4个不重叠的ORF（ORF I-ORF VI）,在基因组上线性排列。其中,ORF III最大（nt 2672-8553）,编码的L蛋白含有1952个氨基酸（AA）,含有Mononegaviruses中非常保守的Mononeg＿m RNA＿pol及Mononeg＿m RNAcap结构域。序列分析和系统发育分析表明Ss NSRV-5X属于Mymonaviridae科病毒,但序列特征又与该科现有的病毒有所差异,其L蛋白与Ss NSRV-1的相比,一致性只有17.96%,属于真菌单股负义链RNA病毒科中的一个新的成员,它与另外一种还未报道的病毒（Bc NSRV-7）可能代表一个新的属。Bc HV1/AH98长度为10223 bp,编码的Rd Rp与Bc HV1（Nc＿037659.1）的Rd Rp序列（QBA69887.1）Query Cover达到100%,一致性高达98.82%。系统发育分析表明Bc HV1/AH98应当归类为Hypoviridae科Betahypovirus属,与已报道的Bc HV1（NC＿037659.1）属于同一种病毒的不同株系。实验室前期研究中,发现ORF I、ORF II和ORF III超表达转化子转录的m RNA均发生了不同程度的剪切;而超表达ORF IV和ORF VI的转化子中,病毒基因正常表达,不被剪切。本研究采用宏转录组测序分析进一步确认了这种现象,并发现剪切的起始位点富含GT（GC）,终止位点富含AG,属于真核生物内含子剪切位点的特征序列。而且发现ORF III在禾谷镰孢菌和稻瘟菌中超表达,其转录产物也可以被被剪切;表明真菌可以特异性识别病毒的某些基因,而且这种识别和剪切在真菌中可能普遍存在,可能是一种抗病毒机制。另外,ORF II在AH98和超表达转化子中均具有两个符合正态分布的转录峰,但是与前期检测到N蛋白的两种形式（P41和P43）并不对应,表明ORF II可能还编码其他蛋白。利用生物信息学软件分析了Ss NSRV-1中5个ORF所编码蛋白的保守结构域、亚细胞定位、结构特征及其可能的互作位点;并利用转录组测序技术对病毒5个ORF超表达转化子的总RNA分别进行了宏转录组测序,初步分析了病毒各ORF对核盘菌的影响,并根据这些结果推测病毒基因在Ss NSRV-1与核盘菌互作过程中的功能,推定出Ss NSRV-1导致核盘菌出现弱毒特性的分子机理。发现病毒ORF I编码的蛋白P1具有负链病毒N蛋白的结构特征,与核蛋白同源的可能性高达82.52%,参与Ss NSRV-1病毒粒子的形成,起转录调控的作用。ORF I的超量表达影响了寄主部分与致病、转录、跨膜运输、蛋白质生物合成及修饰、代谢过程等相关基因的表达,导致转化子的生长速度和致病力降低。病毒ORF II编码Ss NSRV-1的N蛋白,主要影响了核糖体和细胞核相关基因的表达,调控了寄主与致病、转录、跨膜运输、代谢过程等相关基因的表达,可能使转化子的生长速度和致病力降低。病毒ORF III编码的P3蛋白在结构上与负链病毒糖蛋白具有一定的同源性,可能具有肽链内切酶的活性,主要影响了核盘菌核糖体、蛋白酶体及DNA复制和修复相关基因的表达,并调控了蛋白质的翻译和代谢过程。病毒ORF IV编码的P4蛋白在寄主体内起转录调控的作用,主要影响了核盘菌与转录调控、氧化还原、跨膜运输、代谢过程等相关基因的表达,通过调控线粒体、r RNA及核糖体相关基因严重影响了能量和代谢过程,可能通过这些方式使得ORF IV超表达转化子表现衰退特性。ORF VI编码的P6蛋白可能是核孔蛋白复合物,参与核质转运过程,同时还可能作为转录调控因子发挥重要的作用。ORF VI的超量表达主要影响了核盘菌与转录调控、跨膜运输、代谢过程等相关的基因的表达,可以部分调控核盘菌与r RNA相关及核糖体相关的基因,严重影响了碳水化合物和核苷酸代谢过程。本研究通过代谢组分析了Ss NSRV-1的ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF VI在核盘菌1980中超表达后核盘菌产生的差异代谢物,并初步鉴定了病毒各ORF导致核盘菌变化最显着的物质,分析了这些物质可能参与的途径。结果表明ORF I、ORF II和ORF III的表达（在核盘菌中超表达后被剪切）对核盘菌代谢影响较大,产生的差异代谢物有较大的相似性,超表达后核盘菌的标志代谢物为酮类物质（显着下调）和酰胺类物质（显着上调）;ORF IV和ORF VI对核盘菌代谢影响影响相对较少,ORF IV超表达后核盘菌的标志代谢物为酰胺类和磷脂类物质（显着下调）,ORF VI超表达后核盘菌的标志代谢物为磷脂类物质（显着上调）。病毒的ORF I、ORF II和ORF III超表达后核盘菌中共有差异代谢物有253个,主要参与苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、核黄素代谢、磷酸戊糖途径、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、类固醇生物合成和色氨酸代谢等途径。病毒的ORF IV超表达后有76个差异代谢物,参与甾醇类物质生物合成,半胱氨酸生物合成/同型半胱氨酸降解（反式硫化）等途径。病毒ORF VI超表达后核盘菌有50个差异代谢物,参与多巴胺降解、生物素羧基载体蛋白组装、脂肪酸生物合成起始、尿嘧啶降解和棕榈酸生物合成等通路。本研究发现菌株AH98中除感染Ss NSRV-1之外,还感染了5种病毒,其中Ss NSRV-5X可能代表真菌单股负链RNA病毒科一个新的属;发现在转病毒基因转化子中核盘菌利用内含子剪切机制对病毒基因的m RNA进行剪切,预示真菌中存在一种未知的抗病毒机制。同时,利用生物信息学分析预测了Ss NSRV-1各个ORF的结构和功能,并结合转录组和代谢组分析从整体水平解析了Ss NSRV-1导致核盘菌弱毒的机制。上述结果为研究负链RNA病毒多样性,单股负义链RNA病毒与寄主互作及菌核病控制提供了新的思路和材料。
李清扬[3]（2020）在《CRISPR系统对大肠杆菌Ⅰ类整合子的敲除、抑制及基因重组工具的开发》文中认为Ⅰ类整合子作为与食源微生物耐药性进化紧密相关的DNA元件,能通过位点特异性重组来捕获外源耐药基因盒并使之表达,使宿主获得新的耐药性;同时Ⅰ类整合子可借助接合性质粒、转座子等可移动基因元件实现耐药基因的水平转移,造成耐药性的快速传播和扩散,甚至由此进化出了多重耐药菌,对人类健康构成了巨大威胁。迄今为止,尚未开发出有效的策略来应对由Ⅰ类整合子引发的上述问题。基于此,本研究以广宿主接合性质粒R388上的Ⅰ类整合子为研究对象,利用CRISPR系统对其进行敲除和抑制,致力于缓解由Ⅰ类整合子造成的细菌多重耐药性;同时依据整合子具有捕获和表达基因盒的功能特点,通过CRISPR和λRed系统将Ⅰ类整合子改造为一种基因重组工具;随后使用该重组工具构建可利用柠檬酸为碳源生长的大肠杆菌（Escherichia coli）平台菌株,并联合CRISPRi系统来调控葡萄糖代谢网络中的流量分布以期大幅提高宿主菌生产乌头酸的能力。主要研究内容包括:1.在E.coli中构建了可特异性敲除R388质粒Ⅰ类整合子的CRISPR/Cas9系统,并通过对CRISPR质粒转化效率的计算、相应药物最小抑菌浓度（MIC）的测定、Ⅰ类整合子拷贝数的测定和靶位点的DNA测序等方面来评估敲除效果。结果表明,CRISPR质粒的转化造成E.coli丢失了Ⅰ类整合子携带的耐药性,转化子对甲氧苄胺嘧啶（TMP）和磺胺甲基异恶唑（SUL）的复敏率均高达99%,且CRISPR质粒的转化质量与TMP、SUL的复敏率呈负相关;在转化子中TMP和SUL的MIC变化呈多样性,这是由于CRISPR/Cas9造成的靶位点DNA断裂导致Ⅰ类整合子拷贝数出现了不同程度的减少;此外还发现有6株转化子中的CRISPR/Cas9系统发生了部分脱靶——这些菌株中有45%的整合子靶序列缺失了17 bp,推测此突变的产生是为了逃避CRISPR/Cas9系统的识别。2.在E.coli中构建了可敲低Ⅰ类整合子介导的耐药基因表达的CRISPRi系统,并通过反转录实时荧光PCR（RT-q PCR）测定耐药基因的表达、阿尔玛蓝-微量肉汤稀释（MABA）法检测相应药物的半抑制浓度（IC50）以及CRISPRi菌株的生长曲线监测来评估敲低效果。结果显示,CRISPRi系统将dfr B2（整合子可变区中耐药基因盒,编码TMP抗性）和sul1（整合子3’-保守端耐药基因,编码SUL抗性）的转录水平分别下调了36.797.4%和20.883.8%;而CRISPRi对dfr B2和sul1的转录抑制则导致了菌株对TMP和SUL的敏感性增加——TMP和SUL的IC50分别降低了87.5%和5096.875%;以上两种药物敏感性的增加使得CRISPRi菌株在含有TMP或SUL的环境中生长受限。对含有不同g RNA的CRISPRi系统进行评估,我们发现含有g RNA R3、R6的CRISPRi系统对dfr B2和sul1基因表达的敲低效果较好,且其敲低程度与诱导剂脱水四环素（a Tc）之间具有明显的剂量—效应关系。通过g RNA R3和R6的靶标位置可得出:位于int I1模板链中Pc启动子的-35区和位于int I1非模板链中Pc启动子下游31 bp处都是CRISPRi系统的理想靶标,可显着敲低Ⅰ类整合子介导的耐药基因表达。3.进一步利用构建的CRISPRi系统抑制了Ⅰ类整合子介导的耐药基因整合。通过接合转移将捕获了aad A1、aad B基因盒的整合子借助R388质粒从供体菌E.coli C600转移至受体菌E.coli J53中,根据aad A1、aad B基因的水平转移率即可反映出aad A1、aad B基因盒的整合效率。同时结合RT-q PCR对整合酶基因int I1的转录测定结果来评估CRISPRi系统对耐药基因整合的抑制效果。结果显示,CRISPRi系统将int I1的转录水平下调了7096%;而CRISPRi对int I1的转录抑制则导致了Ⅰ类整合子介导的耐药基因整合受阻——aad A1和aad B基因盒的整合效率均由10-2降低至10-310-5。对含有不同g RNA的CRISPRi系统进行评估,发现含有g RNA R3的CRISPRi对aad A1和aad B基因盒的整合抑制效果最好,且抑制作用的强弱可通过a Tc浓度改变进行控制,同时该系统具有较强的遗传稳定性。通过g RNA R3的靶标位置可得出:位于int I1非模板链中Pc启动子下游31 bp处是CRISPRi系统抑制Ⅰ类整合子捕获耐药基因的理想靶标。4.利用CRISPR/Cas9和λRed系统将R388质粒Ⅰ类整合子插入到E.coli BL21（DE3）基因组,构建了Ⅰ类整合子敲入株E.coli BINT;同时又构建了基因盒工程载体p Li-int I1-cassette,该载体在IPTG的诱导下能够产生被整合子捕获的目的基因盒。我们先以egfp作为报告基因证实了整合子重组工具在E.coli中应用的可行性,随后利用该重组工具将柠檬酸转运蛋白基因cit S整合至E.coli BINT基因组中,成功构建了可利用柠檬酸为碳源生长的平台菌株E.coli BINT-cit S,用于后续代谢工程改造来生产乌头酸。5.最后构建了靶向E.coli异柠檬酸脱氢酶（IDH,由icd A基因编码）和丙酮酸激酶（PK,由pyk A、pyk F基因编码）的CRISPRi系统,通过对IDH和PK的单独抑制及组合抑制,在细胞生长、葡萄糖消耗、靶基因表达、体外酶活和代谢水平等方面进行评估,最终筛选出了同时靶标icd A和pyk F的CRISPRi菌株可有效平衡三羧酸循环和糖酵解的速率来显着提高乌头酸产量。在摇瓶发酵和上罐发酵中,此CRISPRi菌株的乌头酸产量分别达到了对照菌株的60倍（362.80±22.05 mg/L）和15倍（623.80±20.05 mg/L）。同时该菌株的乙酸和乳酸产量也出现了大幅下降,但作为副产物之一的柠檬酸却在上罐发酵后期大量积累。为提高菌株对柠檬酸的利用率,我们将可同时抑制IDH和PK的CRISPRi系统在柠檬酸利用菌株E.coli BINT-cit S中诱导表达以进一步提高乌头酸产量。最终,在5 L体系的上罐发酵中重组菌的乌头酸产量达到了730.85±29.75 mg/L。总之,本研究利用CRISPR系统成功敲除、抑制了Ⅰ类整合子,这对靶向Ⅰ类整合子药物的研发提供了理论依据,同时也为防治食源微生物的多重耐药性开辟了新的道路;还借助CRISPR和λRed系统将整合子改造为大肠杆菌基因重组工具,并用其构建了平台工程菌株E.coli BINT-cit S,拓宽了整合子在原核生物中的开发应用;最后在E.coli BINT-cit S中利用CRISPRi系统调控了葡萄糖代谢网络中的流量分布,使乌头酸合成得到大幅提升,这为高水平生产中心代谢途经的中间产物提供了宝贵见解。
于佳琦[4]（2020）在《猪流行性腹泻病毒E蛋白参与病毒复制的研究》文中提出猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是一种猪的高度传染性病毒疾病,其主要特征为呕吐、厌食、水样腹泻、脱水和体重减轻。各个年龄段的猪对该病均易感,其中新生仔猪的病死率最高可达100%,严重危害我国的养猪业。猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的基因组全长约28 kb,从5’-3’依次为:5’非编码区、ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M、N、3’非编码区。其中,ORF1a和ORF1b在翻译后经过自剪切会生成16个非结构蛋白Nsp1～Nsp16。目前,对于PEDV的E蛋白和非结构蛋白的研究较少,其功能尚不是很清楚。本研究将针对E蛋白在PEDV复制中的必要性展开研究,同时鉴定几种非结构蛋白在受PEDV感染细胞中的表达时间和细胞内定位。具体研究如下:1.在PEDV感染Vero细胞后的3h、6h、9h、12h和24h,分别以抗Nsp2、Nsp3-Ac、Nsp5多抗为一抗进行IFA,分析几种非结构蛋白在感染细胞中的表达时间和细胞内定位。结果表明这几种非结构蛋白均在PEDV感染的早期表达,尤其是Nsp2在3 hp.i.即可用抗体检测到;而它们的特异性荧光则均以荧光焦点的形式聚集在核周或分散在细胞质中,呈现出与内质网或小囊泡相似的离散小结构。2.通过原核表达系统和真核表达系统分别表达了带有不同标签的E蛋白,但利用昆虫细胞真核表达的E蛋白无法从Ni-NTA Resin上洗脱下来,只成功纯化出了通过原核表达系统表达的E蛋白。同时,根据E蛋白的结构和免疫原性设计并合成了E的多肽。将纯化的E蛋白和E多肽分别免疫新西兰大白兔,获得两种多克隆抗体。但间接免疫荧光（IFA）和Western Blot实验结果表明,两种抗体均只能识别其免疫抗原,无法识别PEDV的天然E蛋白和细胞过表达的E蛋白。3.构建包含全长E基因的重组表达质粒pWPI-E,将其与慢病毒囊膜质粒pMD2.G、慢病毒包装质粒psPAX2共转染293T细胞包装重组慢病毒。通过将重组慢病毒感染靶细胞及药物筛选,成功制备了稳定表达E蛋白的BHK-E和Vero-E细胞系,并通过Real-time PCR对细胞系E蛋白的表达量进行了相对定量。4.通过体外同源重组方法构建了包含点突变（位于转录调控序列和起始密码子）并缺失大部分E基因序列的PEDV全长感染性克隆pSB2μ-PEDV-△E,以及缺失全部nsp2基因的PEDV全长克隆pSB2μ-PEDV-△nsp2。使用感染性克隆pSB2μ-PEDV-△E拯救重组病毒rPEDV-ΔE,结果表明只有在稳定表达E蛋白的BHK-E和Vero-E细胞中才能拯救rPEDV-ΔE并传代,证明E蛋白在PEDV的复制中是不可或缺的。综上所述,本研究表明E蛋白对于PEDV的复制是必需的。同时证明了 Nsp2、Nsp3-Ac、Nsp5蛋白均在PEDV感染的早期表达,并具有相似细胞内定位。本研究为进一步探索E蛋白和Nsp蛋白的功能奠定了基础。同时,本研究中的缺失E蛋白的重组病毒可发展为安全的新型疫苗,抗Nsp2的抗体可用作PEDV感染早期的诊断工具,对流行的G2亚型PEDV的诊断与预防有重要意义。
胡波[5]（2019）在《甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制》文中提出细胞色素P450和谷胱甘肽-S转移酶具有代谢不同结构杀虫剂的能力,由P450和GST介导的代谢抗性在昆虫对各类杀虫剂抗性中普遍存在。前期的解毒酶活性测定和增效剂生物测定表明甜菜夜蛾对多种杀虫剂的抗性与P450以及GST解毒能力增强有关。但抗性品系中代谢抗性的分子机理仍不清楚,是哪些解毒基因介导了杀虫剂抗性及这些基因上调表达的调控机制也是未解之谜。本研究试图挖掘出甜菜夜蛾涉及抗药性的P450基因与GST基因,并进一步解析抗药性相关基因组成型高表达与诱导表达的调控机理。研究结果将增进人们对害虫抗药性机制的理解,为研究开发抗药性治理新技术提供新的理论指导。在本研究中,我们通过基因信息分析与克隆确定了甜菜夜蛾P450和GST的基因家族,分析了这些基因在杀虫剂胁迫下的诱导表达规律,并进一步揭示了解毒酶共诱导表达上调的调控机制;通过比较抗性种群与敏感种群间解毒基因的表达差异,找出在抗性种群中组成型高表达的P450基因,对其中表达水平最高的4种P450基因通过构建转基因果蝇进行了抗药性功能验证,并进一步通过真核表达分析其对杀虫剂的代谢活性,对其中2个P450基因的组成型上调表达机制开展了深入的研究,揭示了 P450基因在转录水平上多因素调控机理,具体结果如下:1、多数甜菜夜蛾P450基因能被杀虫剂所诱导通过克隆得到了甜菜夜蛾的68个P450基因,这些基因分属于25个家族、40个亚家族。系统进化分析显示甜菜夜蛾P450家族中属CYP2 clan和线粒体clan的成员较少,而属CYP3 clan和CYP4 clan的基因成员数量较多。同时,分析了杀虫剂处理后的基因表达响应,茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯和阿维菌素分别处理甜菜夜蛾脂肪体细胞后,有50个P450基因至少对其中某一种杀虫剂的胁迫会产生表达变化的响应,其中有4个基因（CYP6AE47、CYP6AB31、CYP9A9和CYP9A10）对5种杀虫剂胁迫均有表达水平的显着上调。CYP321A8在茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯诱导中显着性上调,而在阿维菌素处理后显着性下调。CYP321A9、CYP6AE10和CYP321A16对茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯诱导有显着性上调变化,对阿维菌素胁迫下没有显着性变化。在本研究使用的5种杀虫剂中,甜菜夜蛾P450基因表达对阿维菌素胁迫的响应明显不同于对其他4种杀虫剂的响应,而对茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺和高效氯氟氰菊酯胁迫响应的模式基本类似。2、多个甜菜夜蛾P450基因参与杀虫剂抗药性由P450介导的代谢抗性机制在昆虫对各类杀虫剂抗性中普遍存在,先前的研究表明甜菜夜蛾对多种杀虫剂的抗性与P450解毒能力增强有关。在本研究中抗性种群P450酶活性是敏感种群的2.9倍。P450抑制剂PBO显着增加了抗性种群对毒死蜱的敏感性,增效8.1倍,同时增加了拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感。定量PCR分析表明该抗性种群有21个P450基因的表达水平较敏感种群上调2倍以上（p<0.05）,这些过表达的P450主要来源于CYP6、CYP9和CYP321家族。对其中表达水平提高最多的几个P450基因与抗药性的关系,采用2种技术进行了功能验证。首先是采用UAS/GALA二元表达系统构建表达甜菜夜蛾P450基因的转基因果蝇系,对转基因果蝇的生物测定表明,分别过表达CYP321A8、CYP321A16、CYP6AE70和CYP332A1的转基因果蝇系表现出对毒死蜱、氯氰菊酯和溴氰菊酯耐受性的显着提高,说明这4个基因的过表达提高了果蝇对这3种杀虫剂的解毒能力,可导致对这些药剂的代谢抗性。其二是利用杆状病毒表达系统对CYP321A8、CYP321A16、CYP6AE70、CYP332A1和CYP321B1进行了真核表达,体外重组蛋白具有对毒死蜱、氯氰菊酯以及溴氰菊酯的代谢能力,并进一步比较分析了这5个重组蛋白对毒死蜱的代谢动力学特性,结果显示它们均对毒死蜱都有一定的代谢活性,其中以CYP321A8和CYP321B1对毒死蜱的代谢活性最强,而CYP6AE70对毒死蜱的代谢活性相对较低。综合这些研究结果,CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1、CYP6AE70 和 CYP321B1的组成型高表达是甜菜夜蛾对毒死蜱以及氯氰菊酯和溴氰菊酯代谢抗性的重要机制。3、顺式作用元件和反式作用因子协同调控CYP321A8和CYP321B1的组成型高表达前期的研究中发现在抗性种群中过量表达的CYP321A8和CYP321B1可以使甜菜夜蛾对毒死蜱、氯氰菊酯以及溴氰菊酯产生抗药性,然而其过量表达的调控机制尚不清楚。我们克隆了 CYP321A8和CYP321B1的上游启动子序列,并发现在这两个上游序列上存在多个转录因子结合位点。进一步分析相关转录因子在抗敏种群中的相对表达水平,结果显示抗性种群中的CncC和Maf mRNA水平分别上调5.2倍和2.8倍。荧光报告试验证实过表达的CncC和Maf可以调控CYP321A8和CYP321B1在抗性种群中的组成型高表达,同时也发现CYP321A8上游序列存在近端和远端两个有效的CncC/Maf结合位点,CYP321B1仅近端结合位点起作用。同时我们比较了抗性和敏感种群间CYP321A8和CYP321B1基因上游调控序列的差异,发现CYP321A8和CYP321B1的上游启动子区均存在多处碱基差异。荧光报告活性分析显示来自抗性种群的CYP321A8与CYP321B1上游序列启动子活性分别是敏感种群的10.4倍与1.95倍,说明抗性种群中启动子高活性也是CYP321A8和CYP321B1高表达的原因。我们还对造成抗性/敏感启动子活性差异的序列区段进行了定位,CYP321A8的启动子活性差异序列定位在-385～-142之间,CYP321B1在-258～-210之间。对该区间的碱基序列突变后再进行荧光报告活性分析,结果显示-385～-142之间M5处点突变是导致抗性CYP321A8启动子具有高活性的原因,进一步的预测发现M5处的突变位于转录因子Knirps顺式元件中,将Knirps与报告质粒共转染证明Knirps可显着上调抗性质粒P（-385/-1）-R的荧光活性,而对敏感质粒P（-385/-1）-S荧光活性没有显着性影响。这些结果表明抗性种群中CYP321A8的启动子区产生了招募转录因子Knirps的突变（M5处）,增强了 CYP321A8在抗性品系中的过表达,而敏感种群不能招募该因子,所以表达水平低。同样对CYP321B1启动子的-258～-210区间转录活性进行了比较分析,证明M2处的突变是导致抗性种群CYP321B1启动子高活性的原因。最后通过报告质粒与转录因子的共转染揭示顺式元件和反式作用因子的协同调控才是CYP321A8与CYP321B1基因在抗性种群中高表达的内在原因。4、杀虫剂通过ROS激活的CncC/Maf途径诱导GST基因的共上调表达GSTs是一类广泛分布于生物体的多功能解毒酶系,参与亲电性有毒化合物的解毒。尽管不同类型的杀虫剂诱导多个GST基因共上调表达的报道很多,但是其潜在的调控机制尚不清楚。本研究中克隆鉴定了甜菜夜蛾的31个GST基因,通过定量PCR分析了这些GST基因在甜菜夜蛾幼虫中的组织表达模式以及在杀虫剂诱导下的基因表达模式。在高效氯氟氰菊酯、毒死蜱和氯虫苯甲酰胺的胁迫下有7个GST 基因（SeGSTe9、SeGSTs6、SeGSTe1、SeGSTe6、SeGSTe8、SeGSTe14 和 SeGSTd1）均显着上调表达,暗示不同杀虫剂可能会通过类似机理介导同一 GST基因的上调表达,以及不同GST基因可通过类似机理被同一药剂所诱导。通过基因组步移的方法克隆到这7个GST基因上游约1500 bp长的启动子序列,对这些上游序列进行转录因子结合位点的预测分析发现这7个GST基因上游序列均含有CncC/Maf结合位点。进一步通过荧光报告质粒分析该位点介导的转录是否受杀虫剂胁迫的影响,将pGL3-SeGST启动子质粒转染到Sf9细胞后,杀虫剂处理能使荧光活性显着增加,将该启动子区的CncC/Maf结合位点突变后,杀虫剂处理的诱导效果显着下降。这些结果表明甜菜夜蛾利用CncC/Maf途径来响应不同杀虫剂胁迫,并诱导GST基因的表达。杀虫剂处理后细胞内活性氧显着升高,活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可以降低杀虫剂对报告质粒pGL3-SeGST的荧光诱导活性,但不能降低杀虫剂对CncC/Maf结合位点突变体的诱导效应,说明活性氧通过CncC/Maf介导杀虫剂胁迫,从而影响GST基因的表达。以上结果表明不同类型杀虫剂可以通过ROS激活的CncC/Maf途径诱导GST基因的共上调表达。
孔江南[6]（2019）在《核酸G四链体结构在伪狂犬病毒EPO基因的表达和病毒增殖中的作用》文中研究说明富含鸟嘌呤碱基的DNA或者RNA能够形成一种特殊的核酸二级结构:G四链体结构。该结构广泛存在于真核生物、原核生物以及病毒的基因组中,具有重要的生物学功能,如影响DNA的复制、转录和翻译,参与了众多的生理病理过程。伪狂犬病（pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）引起的一种仔猪致死率高,怀孕母猪流产,并伴有神经紊乱症状的急性传染病。PRV基因组的GC含量高达70～80%,我们推测该病毒的基因组中存在形成G四链体结构的序列。EPO作为PRV的一个早期蛋白,对病毒其他基因的表达具有非常重要的调控作用,然而目前关于EPO基因的表达调控还知之甚少。通过生物信息学分析,我们发现EPO基因的启动子区域存在富含鸟嘌呤碱基的序列,该序列包含三个重叠的Sp1结合位点。圆二色光谱和凝胶电泳分析,发现该序列可以形成G四链体结构。硫酸二甲酯足迹保护试验和Taq聚合酶延伸阻滞试验表明,该序列的G四链体结构具有多态性。进一步利用FRET melting、凝胶电泳、以及Taq聚合酶延伸阻滞试验的方法,验证了小分子配体PDS可以诱导形成并且稳定G四链体结构。荧光素酶报告基因试验发现,G四链体结构对EPO启动子活性具有负调控作用。EPO启动子区域中的Sp1结合位点的突变导致了其启动子活性的降低。为了探索该机制,接下来我们检测细胞转录因子Sp1对含有G四链体结构和不含G 四链体结构DNA的识别和结合能力的差异。我们将Sp1基因与六种增加蛋白质可溶性的标签连接构建原核表达载体,并通过原核表达系统纯化目的蛋白,得到了纯度较高的融合蛋白 MBP-Sp1。通过凝胶迁移率试验（EMSA）发现:与不含G四链体结构的双链DNA和单链DNA相比,Sp1蛋白倾向结合含有G四链体结构的双链DNA和单链DNA。过表达或者敲减细胞内的细胞转录因子 Sp1基因,荧光素酶报告基因试验发现,细胞转录因子Sp1对EPO基因的表达具有重要的调节作用。最后我们检测小分子配体对PRV增值的影响。流式细胞仪分析发现小分子配体PDS和BRACO19主要抑制PRV生活周期中的复制阶段。在PRV HN-1201感染的细胞中加入PDS,发现PDS抑制立即早期基因IE180、早期基因EPO、TK以及毒力基因gB 的表达,并且降低病毒滴度,具有抗病毒作用。综上所述,EPO基因启动子的富含鸟嘌呤序列能够形成G四链体结构,该结构不仅对EPO启动子的活性具有负调控作用,而且影响细胞转录因子Sp1对其的识别和结合,小分子配体PDS能够稳定EPO启动子形成的G-四链体结构,并且抑制PRV在细胞内的复制。该研究首次从核酸结构的角度阐述调控EPO基因表达的分子机制,也为研究新型的抗PRV靶点提供理论基础。
郑羽飘[7]（2019）在《乙肝病毒PreS区突变的人肝癌细胞系HepG2稳定株的构建及其生物学行为》文中研究说明目的:肝癌是一种常见的、病死率高的消化系统疾病。全球范围内已发生肝癌的患者中有近一半感染乙肝病毒,乙肝病毒的慢性感染与肝细胞肝癌的发生密切相关。研究表明抑制HBV复制对于预防肝癌的发生有十分重要的意义,多数慢性乙型肝炎患者经过抗病毒治疗可以实现HBV-DNA的阴转,却无法实现HBSAg的血清学转换,仍可以发生肝癌。研究表明编码HBsAg的序列片段PreS区可以发生突变,突变的肝细胞更容易发生癌变。而HBSAg消失或血清学转换既可以达到慢乙肝临床治愈,亦可显着降低肝癌的发生。因此,深入研究PreS区缺失突变对于肝癌细胞生物学行为的影响,构建稳定过表达乙肝病毒PreS/S蛋白野生型及突变型（PreS1缺失突变、PreS2缺失突变）的HepG2细胞株,探讨HBV PreS区突变对HepG2细胞生物学功能的影响意义深远。方法:本课题首先构建稳定过表达PreS区野生型及突变型（PreS1缺失突变、PreS2缺失突变）的HepG2细胞株,以NCBI中HBV病毒JX661479.1的PreS/S片段序列信息为模板,设计并确定PreS1突变、PreS2突变的核苷酸序列,采用全基因合成法获得目的片段并定向导入带有FLAG标签的pLVX慢病毒质粒载体（pLenti-CMV-3FLAG-PGK-Puro）,PCR、双酶切、Sanger测序技术检测重组质粒中目的片段的准确性。其次,进行乙肝病毒preS区突变对肝癌细胞HepG2生物学行为的影响的研究,将HepG2细胞随机分为5组:空白对照组不做处理,阴性对照组、野生型组、PreS1突变组、PreS2突变组分别转染pLVX-vector、pLVX-PreS/S、pLVX-PreS1 mut/S、pLVX-PreS2 mut/S的慢病毒液,利用嘌呤霉素筛选HepG2稳定株,利用Western blotting技术对目的蛋白在HepG2中的表达情况进行鉴定。克隆形成、细胞划痕实验检测乙肝病毒preS区突变对肝癌细胞HepG2增殖活力、迁移能力的影响。结果:重组质粒进行单酶切鉴定证实没有发生载体自体连接的现象,双酶切鉴定在预期的目的片段大小位置可见条带显现。Sanger测序证实重组质粒目的片段核苷酸序列信息与设计乙肝病毒PreS区模板核苷酸序列信息相一致。经过嘌呤霉素浓度压力筛选,空白对照组HepG2细胞全部死亡,转染pLVX-vector,PreS/S野生型、PreS1突变型,PreS2突变型的HepG2细胞部分存活,继续浓度压力培养2天克隆传代,得到转染成功稳定过表达的HepG2细胞株。PreS2突变型的HepG2的14天克隆形成数及细胞相对迁移距离与其它组比较,p<0.05。结论:1.乙肝病毒PreS区野生型和突变型（PreS1缺失突变、PreS2缺失突变）的HepG2细胞株构建成功。2.乙肝病毒PreS区缺失突变相较于野生型肝癌HepG2细胞系增殖及迁移能力增强。3.乙肝病毒PreS2缺失突变较PreS1缺失突变具有更强的肝癌HepG2细胞系增殖和迁移能力。
汪静雯[8]（2019）在《乙型肝炎病毒通过miR-192-3p-XIAP轴调控NF-κB信号通路诱导自噬以促进病毒自身复制》文中指出乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）慢性感染是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）发生和发展的主要诱导因素之一。虽然乙肝疫苗的普及大大减少了新感染的数量,而核苷类似物和干扰素等抗病毒药物的治疗也极大地降低了感染患者的死亡率。但由于现有的药物不能完全清除HBV感染过程中产生的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,导致目前全世界仍有超过3.5亿慢性乙肝病毒感染者,每年约88.7万人死于HBV引起的肝硬化、肝癌及其并发症。故为探索乙型肝炎和肝癌的新的治疗靶点和开发新的治疗药物提供理论依据,需要进一步研究HBV的持续性复制和致病机制。越来越多的证据表明微小RNA（microRNAs,miRNAs）参与HBV复制和HBV相关肝癌的发生。miRNA是一类短的、内源性的非编码RNA,可通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区（3’-Untranslated regions,3’-UTR）上的种子序列互补配对结合,调控靶基因的转录后水平。有研究表明,HBV可上调或下调胞内多种miRNAs的表达,而多种miRNAs在HBV感染过程中也发挥了重要的作用,如miRNA可通过影响病毒复制等过程来清除宿主细胞中的病毒感染。自噬是被真核细胞用来降解和回收未折叠或错误折叠的蛋白、受损的细胞器,以及入侵的病原体等,以维持细胞内环境稳态的一种分解代谢过程。HBV感染可诱导宿主细胞的自噬,其中HBV的S和X蛋白是其诱导自噬的关键调控因子,而自噬反应对细胞中HBV的复制也至关重要。已有许多自噬相关基因,如Atg5、Beclin-1和LC3等被证明是miRNAs的靶基因,能够被miRNAs所调控。近年来,miRNA所介导的自噬反应在病毒学研究领域中得到广泛关注。然而,miRNA如何调控HBV诱导的自噬与HBV复制,仍然知之甚少。前期工作中,我们从文献报道的正常和HBV感染病人样本的miRNA表达谱中挑选了差异表达的11个miRNA,即miR-340-5p、miR-192-3p等进行验证,根据我们的实验结果及在已有的相关文献研究的基础上,确定miR-192-3p作为我们的研究对象。在本研究中,我们发现miR-192-3p表达水平随HBV患者血清中HBV DNA水平的升高逐渐降低。随后,分子机制研究结果显示:HBV感染是通过HBx蛋白与c-Myc相互作用抑制miR-192-3p的表达。为了探索HBV抑制miR-192-3p的功能,我们鉴定出了miR-192-3p的一个新的靶基因,X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）,同时证明miR-192-3p是一个自噬抑制因子,其在体外和小鼠模型中受到HBV感染的抑制,导致细胞自噬。重要的是,我们发现HBV通过miR-192-3p-XIAP轴促进自噬,这一过程在体内和体外对HBV复制是重要的。我们紧接着证明miR-192-3p通过核因子κB信号通路抑制自噬,从而减少HBV复制。最后我们揭示HBV通过miR-192-3p靶向XIAP来激活核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路,上调Beclin-1的表达,促进自噬,增加HBV复制。综上所述,我们的研究发现了HBV通过HBx调控miR-192-3p-XIAP-NF-κB轴诱导自噬而促进HBV复制这一信号通路,该信号通路的关键点将可能成为未来HBV相关疾病药物研制的新靶点。此外,我们的研究结果也表明miR-192-3p是一种新的HBV感染调节因子,暗示它可能在肝癌的发生发展中发挥重要的作用,它将可能作为HBV患者的新的生物标志物或治疗靶标。
李训良[9]（2018）在《猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究》文中指出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）能够引发猪急性高度接触性的消化道传染病,即猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）。感染动物以呕吐、严重的腹泻、脱水为主要症状,而且经常同其他疾病混合发生,所有品种和年龄的猪对此病毒都易感,新生仔猪尤为严重,随着日龄的增大死亡率逐渐下降。猪传染性胃肠炎病毒包膜突起形状的S蛋白在病毒表面,介导粘合到宿主受体和膜融合,其可以分为S1和S2区域,S蛋白是病毒中和抗体产生的一个主要的靶点。自上世纪90年代以来,TGEV导致了全球性的严重的经济损失,一些疫苗制备技术被发展和商业化,目前国内主要为猪传染性胃肠炎病毒-猪轮状病毒-猪流行性腹泻病毒三价弱毒疫苗,但存在免疫效果不确实和返祖等缺陷,故TGEV新型高效疫苗研究尤为迫切,其中以新型基因工程疫苗的研究和开发为热点。猪白细胞介素12（Porcine interleukin 12,pIL-12）是一种重要的多功能免疫调节细胞因子,IL-12能诱导干扰素γ（Interferonγ,IFN-γ）产生并且引发CD4+T细胞分化为Th1（T辅助细胞）型细胞,IL-12有多种重要的生物学功能,它关系到早期非特异性的先天免疫和之后的特异性抗原获得性免疫,可作为免疫佐剂提高疫苗的免疫保护效果。本研究对辽宁省抚顺市60个规模猪场进行了TGEV感染分布情况的调查,对有腹泻症状的仔猪共采集了300份样品,通过RT-PCR方法对TGEV的感染情况进行了调查,并对TGEV关键基因S基因进行了生物信息学分析。通过分子生物学技术利用pVAX1载体,分别构建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和猪IL-12基因的真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-（p40）-（p35）。利用脂质体转染技术将两种质粒转入BHK细胞中,通过免疫荧光试验检测其蛋白表达。选取20头7日龄无TGEV病原感染和抗体的仔猪随机分成5组,分别是pIL-12+TGEV-S1组、TGEV-S1组、pIL-12组、pVAX1组、空白组,从7日龄开始,用重组真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-（p40）-（p35）免疫,每次免疫间隔14天,共免疫3次,每间隔7天采集血液样品,并于第三次免疫后7天进行攻毒,攻毒后5天捕杀猪只并采集血液及组织学样品。采集样品通过淋巴细胞增殖试验、流式细胞检测技术、酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、组织冰冻切片荧光检测和HE染色等方法,分别对不同组别及不同日龄仔猪样品进行了细胞免疫和体液免疫及免疫保护相关指标的检测。试验结果表明,辽宁省抚顺市60个规模猪场的300份样品,共检测出阳性样品3份,通过对S基因的克隆测序、结构分析、序列同源性分析、系统进化树分析和蛋白结构分析,与其他17个参考毒株的S基因相比较,有5处核苷酸的变异,造成了4处氨基酸的变化,有1处氨基酸的变化导致了蛋白质二级结构的改变,与WH1、Almazan毒株S基因的同源性和亲源性最高,属于Purdue毒株分支,与目前普遍流行的毒株相近。试验构建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和猪IL-12基因的真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-（p40）-（p35）,将两种质粒转染BHK细胞后,所表达的蛋白通过免疫荧光试验都能够被其特异性多克隆抗体检测到明显的荧光信号。动物免疫保护试验,TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1两种重组表达质粒的免疫组,在不同的免疫指标检测中,有不同程度的升高,相比较于空白组和pVAX1组有明显的差异,其中pIL-12+TGEV-S1组的结果尤为显着。在淋巴细胞增殖试验、TGEV S1特异性IgG抗体检测、TGEV中和抗体检测中,TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1组有明显升高,其中pIL-12+TGEV-S1组尤为明显,与TGEV-S1组相比较差异显着（p<0.05）,与空白组、pVAX1组、pIL-12组相比较差异极显着（p<0.01）。在CD4+T淋巴细胞检测、CD8+T淋巴细胞检测、IFN-γ细胞因子检测、细胞毒性T淋巴细胞检测中,pIL-12组、TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1组都有明显升高,其中pIL-12+TGEV-S1组尤为明显,与空白组、pVAX1组相比较差异极显着（p<0.01）。肠道组织病毒分布的免疫荧光检测和病理组织学检查表明,TGEV-S1组和对照组之间差异明显,其中pIL-12+TGEV-S1联合免疫组病毒含量更少,组织损伤更轻。说明pIL-12作为免疫佐剂在仔猪机体免疫应答方面有辅助增强的作用,能够提高pVAX1-TGEV-S1真核表达质粒的免疫保护效果。本研究首次将TGEV S1基因与pIL-12基因的重组真核表达质粒共同免疫仔猪,观察仔猪免疫应答水平及免疫保护效果,结果显示佐剂pIL-12与TGEV S1抗原基因的联合使用,能够明显的促进机体的细胞免疫应答,也能够在体液免疫应答中发挥一定作用,从而提高机体免疫水平对抗病毒感染。为新型核酸疫苗和细胞因子免疫佐剂免疫作用和免疫机理的深入研究进一步提供理论依据。
毛汐语[10]（2018）在《表达猪流行性腹泻—轮状病毒的重组伪狂犬病病毒株的构建及部分生物学特性研究》文中指出猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害养猪业的三种重要传染病,分别由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪轮状病毒（Rotavirus,PoRV）和猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）引起。PEDV和PoRV主要导致仔猪腹泻,PRV则引起母猪繁殖障碍及新生仔猪急性死亡,并伴有呕吐、腹泻、震颤和运动失调等症状。三种病毒常常混合感染导致更大的危害,为了有效预防和控制这三种疾病,研究一种可同时预防这三种疾病的安全、高效的疫苗显得迫切而必须。本项目拟用PoRV VP7和PEDV S基因的免疫优势抗原区域为目标基因,以PRV XJ株作为活载体,同源重组构建表达PEDV S、PoRV VP7的重组伪狂犬病病毒PRV（CM）株,并开展培养特性、遗传稳定性、安全性等生物学特性研究。1 PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S的构建根据已有文献对PEDV S基因和PoRV VP7基因优势抗原表位的研究,结合生物信息学软件分析,参照NCBI上PEDV和PoRV序列分别设计引物S-a/S-b和VP7-a/VP7-b,在引物上下游5’引入合适的酶切位点、保护碱基和柔性肽序列。RT-PCR扩增出部分VP7和S基因作为本研究的候选基因片段,分别克隆至pMD19-T（Simple）,构建pMD-VP7、pMD-S克隆质粒。对pMD-VP7、pMD-S克隆质粒进行Kpn I、BamH I双酶切反应,回收目的片段连接转化,构建了重组质粒pMD-VP7.S,对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,表明目的基因片段无碱基的突变和缺失,相应酶切位点和柔性肽序列准确引入。对pEGFP-gI28k真核表达载体和pMD-VP7.S重组质粒用Xho I、Sal I双酶切,回收目的片段,连接转化,构建含有VP7.S融合基因的PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S,对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。2表达PEDV S和PoRV VP7基因的重组伪狂犬病毒PRV（CM）株的构建将PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S和伪狂犬野毒株PRV XJ株共转染至293T细胞,通过同源重组构建了共表达VP7和S基因并且gI、gE毒力基因缺失的重组伪狂犬病毒PRV（CM）株,经过PCR、Western-Blotting等鉴定,结果表明VP7和S基因成功表达,重组病毒构建成功。3 PRV（CM）株部分生物学特性研究通过将PRV（CM）接种到BHK-21细胞上,增值特性观察发现VP7.S融合基因片段的插入不影响重组病毒株的增值,测定PRV（CM）的TCID50和亲本株相比较,重组病毒株的增值滴度略有降低;一步生长曲线显示重组病毒株和亲本株具有相似的生长动力学;将PRV（CM）在BHK-21细胞传至20代,各代次病毒增殖规律相似;PCR测定显示外源基因稳定存在,毒力基因稳定缺失;安全性试验结果表明,以不同病毒滴度的PRV（CM）接种哺乳仔猪和怀孕母猪,无临床异常是安全的。
二、HBV3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）基于比较转录组学分析代谢改造粘质沙雷氏菌JNB5-1高效合成灵菌红素（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 灵菌红素概述 |
| 1.1.1 灵菌红素 |
| 1.1.2 灵菌红素合成途径 |
| 1.1.3 灵菌红素合成的基因调控 |
| 1.2 RNA测序(RNA-seq) |
| 1.2.1 RNA-seq测序发展 |
| 1.2.2 RNA-seq建库和测序 |
| 1.2.3 RNA-seq数据分析 |
| 1.3 聚腺苷酸化 |
| 1.3.1 聚腺苷酸化概述 |
| 1.3.2 聚腺苷酸化相关酶 |
| 1.3.3 聚腺苷酸化在RNA代谢和基因表达中的作用 |
| 1.4 蛋白质翻译后修饰 |
| 1.4.1 蛋白质稳定性概述 |
| 1.4.2 二硫键工程提高蛋白质稳定性 |
| 1.4.3 蛋白质磷酸化 |
| 1.5 课题的研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 基于比较转录组学分析初步解析不同温度下粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的差异 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 灵菌红素产量测定 |
| 2.2.6 转录组取样 |
| 2.2.7 提取总RNA |
| 2.2.8 文库制备和转录组测序 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 基因表达模式分析 |
| 2.2.11 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 转录组样本制备 |
| 2.3.2 RNA样品检测 |
| 2.3.3 转录组测序总体分析 |
| 2.3.4 qPCR验证 |
| 2.3.5 基因表达模式分析 |
| 2.3.6 温度差异分析 |
| 2.3.7 温度对基因转录的影响 |
| 2.3.8 群体感应参与灵菌红素合成 |
| 2.3.9 sRNA响应温度刺激参与灵菌红素合成 |
| 2.3.10 双组分调控系统参与灵菌红素合成 |
| 2.3.11 涉及灵菌红素生物学功能的相关因子 |
| 2.3.12 氨基酸代谢途径响应温度变化参与灵菌红素合成 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 设计多聚核苷酸片段提高pig基因簇基因mRNA稳定性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 PigF克隆表达,制备和纯化 |
| 3.2.6 PigF酶活性测定 |
| 3.2.7 温度对氧甲基转移酶(PigF)合成及酶活性的影响 |
| 3.2.8 粘质沙雷氏菌pig F敲除菌构建 |
| 3.2.9 PNF的筛选 |
| 3.2.10 mRNA半衰期测定 |
| 3.2.11 粘质沙雷氏菌敲入菌株构建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 pig基因簇基因转录水平受温度影响 |
| 3.3.2 温度对氧甲基转移酶(PigF)的影响 |
| 3.3.3 设计PNF |
| 3.3.4 PNF提高gfp基因mRNA稳定性 |
| 3.3.5 PNF提高mRNA半衰期 |
| 3.3.6 引入PNF提高PigF基因转录和表达水平 |
| 3.3.7 利用PNF在 JNB5-1 中重构pig基因簇 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 引入二硫键提高氧甲基转移酶稳定性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要仪器 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 PigF突变酶的构建,制备和纯化 |
| 4.2.6 PigF及其突变酶热稳定性研究 |
| 4.2.7 验证二硫键的形成 |
| 4.2.8 PigF及其突变体酶动力学参数研究 |
| 4.2.9 结构和分子动力学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 设计PigF二硫键引入位点 |
| 4.3.2 PigF突变体酶二硫键验证 |
| 4.3.3 引入二硫键提高了PigF突变体酶热稳定性 |
| 4.3.4 PigF及突变体酶酶动力学参数研究 |
| 4.3.5 PigF及其突变体酶结构分析 |
| 4.3.6 PigF突变体酶分子动力学模拟 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 cpx系统负转录调控PG生物合成 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要仪器 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.2.5 粘质沙雷氏菌cpxR敲除菌构建 |
| 5.2.6 测量pig基因簇的启动子 |
| 5.2.7 CpxR、CpxR_(D51A)及Cpx A克隆表达,制备和纯化 |
| 5.2.8 氯霉素乙酰转移酶(CAT)和GFP荧光实验 |
| 5.2.9 电泳迁移率实验 |
| 5.2.10 细菌双杂交实验 |
| 5.2.11 Pull down实验 |
| 5.2.12 Western blot |
| 5.2.13 体外磷酸化验证 |
| 5.2.14 灵菌红素产量测定 |
| 5.2.15 实时荧光定量PCR |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 cpx系统转录水平响应JNB5-1 的培养温度变化而变化 |
| 5.3.2 cpxR基因插入失活提高了PG的产量 |
| 5.3.3 cpxR基因插入失活提高了PG合成相关途径基因的转录水平 |
| 5.3.4 CpxR结合pig基因簇启动子 |
| 5.3.5 cpx系统通过磷酸化影响PG产量 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 组合代谢改造粘质沙雷氏菌高效合成灵菌红素 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要仪器 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 6.2.4 培养基 |
| 6.2.5 粘质沙雷氏菌敲入菌株构建 |
| 6.2.6 摇瓶发酵测定灵菌红素产量 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 引入二硫键提高PigF稳定性促进PG产量 |
| 6.3.2 外源添加前体物质促进PG产量 |
| 6.3.3 重组PG合成代谢流促进PG产量 |
| 6.3.4 重组菌JNB5-1/S4 发酵合成PG |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 I:作者在攻读博士学位期间发表的论文与专利 |
| 附录 II:转录组差异基因 |
（2）SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.核盘菌及油菜菌核病 |
| 1.1 核盘菌及其分类地位 |
| 1.2 油菜菌核病及其病害循环 |
| 1.3 核盘菌的致病机理 |
| 1.4 菌核病的防治 |
| 2.真菌病毒及其多样性 |
| 2.1 病毒与真菌病毒的发现 |
| 2.2 真菌病毒的分类 |
| 2.3 真菌病毒的广泛分布 |
| 2.4 真菌病毒的传播方式 |
| 2.5 真菌病毒的应用 |
| 3.真菌病毒与寄主互作研究 |
| 3.1 真菌病毒对寄主的影响 |
| 3.2 真菌对真菌病毒的影响 |
| 3.3 真菌病毒-寄主互作研究 |
| 4.转录组学与真菌病毒研究 |
| 4.1 转录组学及转录组测序(RNA-Seq)简介 |
| 4.2 转录组数据的分析流程 |
| 4.3 转录组学在真菌病毒研究中的应用 |
| 5.代谢组学及其应用 |
| 5.1 代谢组学的基本概念 |
| 5.2 代谢组的研究方法 |
| 5.3 代谢组数据分析 |
| 5.4 代谢组学在微生物研究中的应用 |
| 6.单股负义链RNA病毒与SsNSRV-1 |
| 6.1 单股负义链RNA病毒 |
| 6.2 Mymonaviridae的建立 |
| 6.3 核盘菌负链病毒SsNSRV-1 |
| 7.本研究的目的意义 |
| 第二章 利用高通量测序分析菌株AH98中的病毒 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 菌株的培养 |
| 1.3.2 RNA提取及cDNA合成 |
| 1.3.3 测序方案 |
| 1.3.4 数据分析流程 |
| 1.3.5 病毒序列的验证和分析 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 测序数据QC质量分析 |
| 2.2 测序获得的病毒验证 |
| 2.3 病毒SsNSRV-5X |
| 2.3.1 SsNSRV-5X的基因组结构 |
| 2.3.2 SsNSRV-5X基因功能预测 |
| 2.3.3 SsNSRV-5X的系统发育分析 |
| 2.4 BcHV1/AH98 的基因组结构和进化树分析 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 AH98被6种病毒复合侵染 |
| 3.2.2 AH98的弱毒特性由多种病毒共同导致 |
| 3.2.3 病毒BcHV1存在跨属传播的现象 |
| 3.2.4 SsNSRV-5X可能代表Mymonaviridae科病毒一个新的属 |
| 第三章 SsNSRV-1 基因超表达转化子的表达特性 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 菌株的培养和保存 |
| 1.4.2 真菌DNA提取 |
| 1.4.4 RNA提取及cDNA合成 |
| 1.4.5 农杆菌介导真菌的遗传转化 |
| 1.4.6 ORF超表达转化子PCR验证 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 核盘菌超表达转化子中病毒基因的表达特性 |
| 2.2 病毒基因剪切位点的序列特征 |
| 2.3 病毒ORF Ⅲ的剪切现象在禾谷镰孢菌和稻瘟菌中存在 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 病毒SsNSRV-1 基因被真菌内含子剪接系统编辑 |
| 3.2.2 病毒SsNSRV-1 可能存在防止内含子剪接的机制 |
| 3.2.3 病毒SsNSRV-1 N基因具有两个转录峰 |
| 第四章 结合转录组技术揭示SsNSRV-1 的基因功能及其与核盘菌互作机理 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 转录组测序样品制备 |
| 1.3.2 转录组数据分析方法 |
| 1.3.3 病毒SsNSRV-1 蛋白的定位、结构和功能预测 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 转录组测序样品质量检测 |
| 2.2 测序数据质量评估 |
| 2.3 测序数据比对基因组 |
| 2.4 基因ORFⅠ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.4.1 SsNSRV-1 P1 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.4.2 核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.4.3 核盘菌ORF I超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.4.4 核盘菌ORF I超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.4.5 核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 2.4.6 核盘菌ORFⅠ超表达转化子中的分泌蛋白和致病相关蛋白 |
| 2.5 基因ORF Ⅱ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.5.1 SsNSRV-1N蛋白的结构和功能分析 |
| 2.5.2 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.5.3 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.5.4 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.5.5 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.6 基因ORF Ⅲ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.6.1 SsNSRV-1 P3 的蛋白结构和功能预测 |
| 2.6.2 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 差异表达基因概述 |
| 2.6.3 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.6.4 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.6.5 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.7 基因ORF Ⅳ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.7.1 SsNSRV-1 P4 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.7.2 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.7.3 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.7.4 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.7.5 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.8 基因ORF Ⅵ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.8.1 SsNSRV-1 P6 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.8.2 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.8.3 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.8.4 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.8.5 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.9 核盘菌病毒基因超表达转化子共有差异基因分析 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 病毒ORFⅠ可能参与病毒粒子的形成 |
| 3.2.2 病毒SsNSRV-1 导致核盘菌致病力衰退的机制 |
| 3.2.3 病毒SsNSRV-1 影响核盘菌的转录调控 |
| 3.2.4 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌的跨膜运输 |
| 3.2.5 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌生长发育 |
| 3.2.6 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌的信号传导途径 |
| 3.2.7 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌蛋白质合成和降解 |
| 3.2.8 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌自噬 |
| 第五章 真菌病毒SsNSRV-1 基因表达对寄主代谢的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 代谢组分析菌株的培养 |
| 1.3.2 代谢样品的提取 |
| 1.3.3 LC-MS分析条件 |
| 1.3.4 LC-MS数据处理 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 代谢数据预处理 |
| 2.2 病毒核盘菌ORFⅠ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.2.1 核盘菌ORFⅠ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.2.2 代谢组数据统计分析 |
| 2.2.3 核盘菌ORFⅠ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.3 病毒ORF Ⅱ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.3.1 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.3.2 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.3.3 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.4 病毒ORF Ⅲ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.4.1 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.4.2 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.4.3 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.5 病毒ORF Ⅳ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.5.1 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.5.2 代谢组数据统计分析 |
| 2.5.3 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.6 病毒ORF Ⅵ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.6.1 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.6.2 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.6.3 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.7 核盘菌ORF Ⅰ、ORF Ⅱ和 ORF Ⅲ超表达转化子共有差异代谢物 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1.论文中使用的引物 |
| 附录2.附图 |
| 附图1.转录组测序样品质量评估 |
| 附图2.转录组测序样品平均错误率 |
| 附图3.转录组测序样品碱基含量分布 |
| 附图4.转录组测序样品比对基因组质量分析 |
| 附录3.附表 |
| 附表1.核盘菌中已研究的部分弱毒相关病毒 |
| 附表2.核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表3.核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表4.核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 显着差异表达基因 |
| 附表5.核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表6.核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表7.核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异代谢物 |
| 附表8.核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980显着差异代谢物 |
| 附表9.核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 显着差异代谢物 |
| 附表10.核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980差异代谢物 |
| 附表11.核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980差异代谢物 |
| 附录4.已发表的论文及参与的会议 |
| 致谢 |
（3）CRISPR系统对大肠杆菌Ⅰ类整合子的敲除、抑制及基因重组工具的开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细菌的抗生素耐药性概述 |
| 1.1.1 细菌耐药的机制 |
| 1.1.2 细菌的固有性耐药 |
| 1.1.3 细菌的获得性耐药 |
| 1.2 整合子 |
| 1.2.1 整合子的结构及特点 |
| 1.2.2 整合子的分类 |
| 1.2.3 基因盒的结构与特点 |
| 1.2.4 常见耐药基因盒的种类 |
| 1.2.5 整合子介导的基因盒重组 |
| 1.2.6 整合子介导的基因盒的表达 |
| 1.2.7 整合子与细菌耐药性的关系 |
| 1.2.8 整合子在原核生物中的开发和应用 |
| 1.3 CRISPR系统 |
| 1.3.1 CRISPR系统的结构 |
| 1.3.2 CRISPR系统的分类 |
| 1.3.3 CRISPR系统的作用机制 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术 |
| 1.3.5 CRISPRi基因干扰技术 |
| 1.4 乌头酸 |
| 1.4.1 乌头酸的结构与特性 |
| 1.4.2 乌头酸的功能与用途 |
| 1.4.3 乌头酸的生产与合成 |
| 1.5 大肠杆菌及其乌头酸合成途径 |
| 1.6 课题研究意义及主要研究内容 |
| 第二章 CRISPR/Cas9 敲除Ⅰ类整合子 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 培养基和常用溶液的配制 |
| 2.2.4 实验菌株和质粒来源 |
| 2.2.5 实验引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组质粒p Cas9-Dn的构建 |
| 2.3.2 实验菌株E.coli HB101(R388+p Cas9-Dn)的构建 |
| 2.3.3 转化效率的计算 |
| 2.3.4 复敏率的计算 |
| 2.3.5 影印区分不同表型 |
| 2.3.6 微量肉汤稀释法测定MIC |
| 2.3.7 qPCR测定Ⅰ类整合子相关基因拷贝数 |
| 2.3.8 测序比对Ⅰ类整合子intI1基因序列 |
| 2.3.9 测序比对CRISPR/Cas9 系统全序列 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 重组质粒p Cas9-Dn的构建 |
| 2.4.2 实验菌株E.coli HB101(R388+p Cas9-Dn)的构建 |
| 2.4.3 重组质粒p Cas9-Dn的转化效率 |
| 2.4.4 E.coli HB101(R388+p Cas9-Dn)对TMP、SUL的复敏率 |
| 2.4.5 TMP、SUL对 E.coli HB101(R388+p Cas9-Dn)的MIC |
| 2.4.6 E.coli HB101(R388+p Cas9-Dn)中int I1、dfr B2和sul1 的拷贝数 |
| 2.4.7 耐药基因拷贝数与其对应抗生素MIC的相关性分析 |
| 2.4.8 测序比对Ⅰ类整合子intI1基因序列 |
| 2.4.9 测序比对CRISPR/Cas9 系统全序列 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 CRISPRi敲低Ⅰ类整合子介导的耐药基因表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 培养基和常用溶液的配制 |
| 3.2.4 实验菌株和质粒来源 |
| 3.2.5 实验引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组质粒plv-d Cas9-Rn的构建 |
| 3.3.2 实验菌株E.coli C600(R388+plv-d Cas9-Rn)的构建 |
| 3.3.3 转化效率的计算 |
| 3.3.4 RT-q PCR测定Ⅰ类整合子中耐药基因的转录水平 |
| 3.3.5 药物敏感性的测定 |
| 3.3.6 生长曲线的测定 |
| 3.3.7 诱导剂浓度优化 |
| 3.3.8 连续传代培养 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 重组质粒plv-d Cas9-Rn的构建 |
| 3.4.2 实验菌株E.coli C600(R388+plv-d Cas9-Rn)的构建 |
| 3.4.3 重组质粒plv-d Cas9-Rn的转化效率 |
| 3.4.4 E.coli C600(R388+plv-d Cas9-Rn)中dfr B2和sul1 的转录情况 |
| 3.4.5 E.coli C600(R388+plv-d Cas9-Rn)对TMP、SUL的药物敏感性 |
| 3.4.6 相关性分析 |
| 3.4.7 E.coli C600(R388+plv-d Cas9-Rn)的生长曲线 |
| 3.4.8 诱导剂aTc工作浓度的优化 |
| 3.4.9 CRISPRi敲低dfr B2、sul1 的可逆性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 CRISPRi抑制Ⅰ类整合子介导的耐药基因整合 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 培养基和常用溶液的配制 |
| 4.2.4 实验菌株和质粒来源 |
| 4.2.5 实验引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组质粒p INT-cassette的构建 |
| 4.3.2 实验菌株E.coli C600(R388+plv-d Cas9-Rn+p INT-cassette)的构建 |
| 4.3.3 转化效率的计算 |
| 4.3.4 RT-q PCR测定Ⅰ类整合酶基因的转录水平 |
| 4.3.5 耐药基因盒整合效率的计算 |
| 4.3.6 诱导剂浓度优化 |
| 4.3.7 连续传代培养 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 重组质粒p INT-cassette的构建 |
| 4.4.2 实验菌株E.coli C600(R388+plv-d Cas9-Rn+p INT-cassette)的构建 |
| 4.4.3 重组质粒p INT-cassette的转化效率 |
| 4.4.4 E.coli C600(R388+plv-d Cas9-Rn+p INT-cassette)中int I1 的转录情况 |
| 4.4.5 Ⅰ类整合子介导的耐药基因盒的整合效率 |
| 4.4.6 intI1转录量与耐药基因盒整合效率的相关性分析 |
| 4.4.7 诱导剂aTc浓度的优化 |
| 4.4.8 CRISPRi抑制耐药基因盒整合的可逆性 |
| 4.4.9 CRISPRi的遗传稳定性 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 利用CRISPR和 λRed构建整合子重组工具 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 主要仪器和设备 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.2.3 培养基和常用溶液的配制 |
| 5.2.4 实验菌株和质粒来源 |
| 5.2.5 实验引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 重组质粒p Target-BL21 的构建 |
| 5.3.2 DNA修复模板Integron的拼接组装 |
| 5.3.3 Ⅰ类整合子敲入株E.coli BINT的构建 |
| 5.3.4 基因盒工程载体p Li-int I1-cassette的构建 |
| 5.3.5 报告质粒p Li-int I1-egfp的构建 |
| 5.3.6 整合子重组工具的构建及效果表征 |
| 5.3.7 重组质粒p Li-int I1-cit S的构建 |
| 5.3.8 利用整合子重组工具构建工程菌E.coli BINT-cit S |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 重组质粒p Target-BL21 的构建 |
| 5.4.2 DNA修复模板X1-Integron-X2 的拼接组装 |
| 5.4.3 利用CRISPR和 λRed构建Ⅰ类整合子敲入株E.coli BINT |
| 5.4.4 基因盒工程载体p Li-int I1-cassette的构建 |
| 5.4.5 报告质粒p Li-int I1-egfp的构建 |
| 5.4.6 整合子重组工具的效果表征 |
| 5.4.7 重组质粒p Li-int I1-cit S的构建 |
| 5.4.8 利用整合子重组工具构建柠檬酸利用菌株E.coli BINT-cit S |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 利用CRISPRi和整合子重组工具提高大肠杆菌中乌头酸的合成 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 主要仪器和设备 |
| 6.2.2 主要实验试剂 |
| 6.2.3 培养基和常用溶液的配制 |
| 6.2.4 实验菌株和质粒来源 |
| 6.2.5 实验引物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 CRISPRi重组质粒的构建 |
| 6.3.2 含有CRISPRi系统的重组菌株的构建 |
| 6.3.3 高产乌头酸菌株E.coli BINT-cit S(pd Cas9-pyk F1icd A1)的构建 |
| 6.3.4 RT-q PCR测定靶标基因的转录水平 |
| 6.3.5 体外酶活性的检测 |
| 6.3.6 摇瓶发酵 |
| 6.3.7 上罐发酵 |
| 6.3.8 生长曲线的监测 |
| 6.3.9 葡萄糖剩余量的测定 |
| 6.3.10 HPLC测定发酵液中代谢产物的浓度 |
| 6.3.11 数据统计分析 |
| 6.4 实验结果与分析 |
| 6.4.1 靶标icd A的 CRISPRi质粒的构建 |
| 6.4.2 CRISPRi抑制IDH的效果表征 |
| 6.4.3 CRISPRi菌株抑制IDH生产乌头酸 |
| 6.4.4 靶标pyk A/pyk F的 CRISPRi质粒的构建 |
| 6.4.5 CRISPRi抑制PK的效果表征 |
| 6.4.6 CRISPRi菌株抑制PK生产乌头酸 |
| 6.4.7 同时靶标icd A和 pyk F的 CRISPRi质粒的构建 |
| 6.4.8 CRISPRi同时抑制IDH和 PK的效果表征 |
| 6.4.9 CRISPRi菌株同时抑制IDH和 PK生产乌头酸 |
| 6.4.10 上罐发酵E.coli BL21(DE3)+pd Cas9-pyk F1icd A1 生产乌头酸 |
| 6.4.11 高产乌头酸菌株E.coli BINT-cit S(pd Cas9-pyk F1icd A1)的构建 |
| 6.4.12 上罐发酵E.coli BINT-cit S(pd Cas9-pyk F1icd A1)生产乌头酸 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要仪器设备 |
| 附录2 其他实验试剂 |
| 附录3 常规培养基的制备 |
| 附录4 常用溶液的配制 |
| 附录5 重组质粒p Cas9-Dn的测序结果 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）猪流行性腹泻病毒E蛋白参与病毒复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻病毒简介 |
| 2 猪流行性腹泻病毒的基因结构和蛋白功能 |
| 2.1 S蛋白的结构与功能 |
| 2.2 E蛋白的结构与功能 |
| 2.3 M蛋白的结构与功能 |
| 2.4 N蛋白的结构与功能 |
| 2.5 ORF3的结构与功能 |
| 2.6 ORF1的结构与功能 |
| 3 猪流行性腹泻病毒的流行情况 |
| 3.1 欧洲PED的流行病学 |
| 3.2 美国PED的流行病学 |
| 3.3 亚洲PED的流行病学 |
| 3.4 中国PED的流行病学 |
| 4 猪流行性腹泻病毒的反向遗传学研究 |
| 4.1 基于靶向RNA重组的反向遗传系统 |
| 4.2 基于BAC载体的反向遗传系统 |
| 4.3 基于体外连接的反向遗传系统 |
| 4.4 其他反向遗传系统 |
| 5 研究的目的与意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 PEDV非结构蛋白表达特性的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒和抗体 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 溶液配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗复制酶蛋白抗体的鉴定 |
| 2.2 复制酶蛋白在感染细胞中的表达特性 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 IFA鉴定几种抗Nsp蛋白抗体 |
| 3.2 IFA分析几种Nsp蛋白在感染细胞中的表达特性 |
| 4 讨论 |
| 第三章 PEDV E蛋白的表达及多克隆抗体制备 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 溶液配方和试剂 |
| 1.3.1 试剂 |
| 1.3.2 溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PEDV E蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.1.1 pET-32a-E重组质粒的构建 |
| 2.1.2 通过原核表达系统表达和纯化E蛋白 |
| 2.2 使用原核表达的E蛋白制备多克隆抗体 |
| 2.2.1 准备免疫抗原 |
| 2.2.2 实施免疫程序 |
| 2.2.3 鉴定E蛋白抗血清 |
| 2.3 使用E多肽制备多克隆抗体 |
| 2.3.1 多肽与抗体的制备 |
| 2.3.2 鉴定E多肽的抗血清 |
| 2.4 PEDV E蛋白的真核表达与纯化 |
| 2.4.1 pFastBacl-E重组转移质粒的构建 |
| 2.4.2 Bacmid-E重组表达质粒的构建 |
| 2.4.3 重组杆状病毒的构建 |
| 2.4.4 E蛋白的表达与纯化 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 E蛋白的原核表达、纯化及多抗制备 |
| 3.1.1 E蛋白原核表达质粒的鉴定 |
| 3.1.2 通过原核表达系统表达E蛋白并纯化 |
| 3.1.3 E蛋白多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 3.2 E多肽多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.3 E蛋白的真核表达与纯化 |
| 3.3.1 E蛋白真核表达质粒的鉴定 |
| 3.3.2 通过真核表达系统表达E蛋白并纯化 |
| 4 讨论 |
| 第四章 构建PEDV E蛋白稳定表达细胞系 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 溶液和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 pWPI-E慢病毒表达质粒的构建 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 全长E基因的扩增 |
| 2.1.3 双酶切pWPI载体和E基因 |
| 2.1.4 通过双酶切反应和无缝克隆构建重组质粒 |
| 2.2 包装重组慢病毒 |
| 2.2.1 293T细胞中慢病毒的包装 |
| 2.2.2 重组慢病毒的收集 |
| 2.3 建立E蛋白稳定表达细胞系 |
| 2.3.1 确定靶细胞药物筛选浓度 |
| 2.3.2 慢病毒感染与细胞筛选 |
| 2.4 E蛋白稳定表达细胞系的鉴定 |
| 2.4.1 总RNA的提取及反转录 |
| 2.4.2 一步法实时荧光定量PCR |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组慢病毒表达质粒pWPI-E的鉴定 |
| 3.2 Blasticidin S筛选细胞使用浓度的测定 |
| 3.3 稳定表达E蛋白细胞系的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第五章 缺失E或nsp2基因的PEDV全长克隆的构建及病毒拯救 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 全长克隆质粒pSB2μ-PEDV-ΔE的构建 |
| 2.1.1 引物的设计 |
| 2.1.2 缺失E基因的PEDV全长基因组的克隆 |
| 2.1.3 全长克隆质粒pSB2μ-PEDV-ΔE的连接 |
| 2.1.4 全长克隆质粒pSB2μ-PEDV-ΔE的验证 |
| 2.2 重组病毒rPEDV-ΔE的拯救与鉴定 |
| 2.2.1 重组病毒rPEDV-ΔE的拯救 |
| 2.2.2 rPEDV-ΔE的RT-PCR鉴定及测序验证 |
| 2.2.3 间接免疫荧光检测 |
| 2.3 全长克隆质粒pSB2μ-PEDV-Δnsp2的构建 |
| 2.3.1 引物的设计 |
| 2.3.2 缺失nsp2基因的PEDV全长基因组的克隆 |
| 2.3.3 全长克隆pSB2μ-PEDV-Δnsp2的连接与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 全长克隆质粒pSB2μ-PEDV-ΔE的鉴定 |
| 3.2 重组病毒rPEDV-ΔE的拯救 |
| 3.3 重组病毒rPEDV-ΔE的鉴定 |
| 3.4 全长克隆质粒pSB2μ-PEDV-Δnsp2的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 研究创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（5）甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 甜菜夜蛾的抗药性 |
| 1.1.1 甜菜夜蛾的发生与危害 |
| 1.1.2 甜菜夜蛾的化学防治与抗药性 |
| 1.2 害虫对杀虫剂抗性的机制 |
| 1.2.1 靶标抗性 |
| 1.2.2 代谢抗性 |
| 1.3 细胞色素P450 |
| 1.3.1 细胞色素P450 |
| 1.3.2 NADPH-细胞色素P450还原酶 |
| 1.3.3 昆虫细胞色素P450基因的可诱导性 |
| 1.3.4 昆虫细胞色素P450在昆虫抗药性中的作用 |
| 1.3.5 昆虫P450基因的功能验证 |
| 1.4 昆虫谷胱甘肽-S-转移酶 |
| 1.4.1 谷胱甘肽-S-转移酶的分类及一般特性 |
| 1.4.2 谷胱甘肽-S-转移酶的生化特性 |
| 1.4.3 谷胱甘肽-S-转移酶与抗药性的关系 |
| 1.5 昆虫解毒基因表达的调控机制 |
| 1.5.1 诱导表达调控机制 |
| 1.5.2 组成型高表达调控机制 |
| 1.6 本论文的研究目的和意义 |
| 第二章 甜菜夜蛾P450的克隆与表达规律 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试虫源 |
| 2.1.2 试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 样品准备与总RNA提取 |
| 2.1.5 cDNA合成 |
| 2.1.6 基因克隆 |
| 2.1.7 基因末端扩增 |
| 2.1.8 生物信息学分析 |
| 2.1.9 细胞培养与处理 |
| 2.1.10 MTT测定 |
| 2.1.11 基因表达水平分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 甜菜夜蛾P450家族基因的克隆 |
| 2.2.2 甜菜夜蛾P450超家族系统进化分析 |
| 2.2.3 甜菜夜蛾P450组织表达谱 |
| 2.2.4 杀虫剂处理对CYP450基因表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 P450介导甜菜夜蛾抗药性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试虫源 |
| 3.1.2 试剂与试剂盒 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 甜菜夜蛾的生物测定 |
| 3.1.5 P450酶活性测定 |
| 3.1.6 基因表达水平分析 |
| 3.1.7 转基因果蝇的构建 |
| 3.1.8 转基因果蝇的生物测定 |
| 3.1.9 真核表达 |
| 3.1.10 还原型CO差异光谱分析 |
| 3.1.11 P450酶活性测定 |
| 3.1.12 杀虫剂的体外代谢 |
| 3.1.13 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 甜菜夜蛾的抗药性水平与生化机制 |
| 3.2.2 P450在抗性种群和敏感种群中的表达差异 |
| 3.2.3 P450过表达对果蝇杀虫剂敏感性的影响 |
| 3.2.4 P450的真核表达与杀虫剂代谢 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 甜菜夜蛾CYP321A8和CYP321B1组成型高表达的调控机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试虫源 |
| 4.1.2 试剂与试剂盒 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 甜菜夜蛾RNA提取 |
| 4.1.5 cDNA第一链合成 |
| 4.1.6 转录因子的克隆 |
| 4.1.7 转录因子的表达水平分析 |
| 4.1.8 上游启动子区的克隆与序列分析 |
| 4.1.9 荧光报告质粒的构建 |
| 4.1.10 突变体构建 |
| 4.1.11 转录因子过表达载体构建 |
| 4.1.12 报告质粒的细胞转染 |
| 4.1.13 报告质粒荧光活性测定 |
| 4.1.14 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CYP321A8的转录调控机制 |
| 4.2.2 CYP321B1的转录调控机制 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 甜菜夜蛾谷胱甘肽-S-转移酶基因诱导表达的调控机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试虫源 |
| 5.1.2 试剂与试剂盒 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 甜菜夜蛾不同组织样本的收集 |
| 5.1.5 GST基因克隆 |
| 5.1.6 生物信息学分析 |
| 5.1.7 基因表达水平分析 |
| 5.1.8 昆虫细胞培养与药剂处理 |
| 5.1.9 上游启动子区的克隆与预测分析 |
| 5.1.10 荧光报告质粒构建 |
| 5.1.11 报告质粒的细胞转染 |
| 5.1.12 荧光测定 |
| 5.1.13 ROS测定 |
| 5.1.14 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 甜菜夜蛾GST家族基因的克隆 |
| 5.2.2 甜菜夜蛾GST的系统进化 |
| 5.2.3 GSH结合位点和底物结合位点 |
| 5.2.4 组织特异性表达谱 |
| 5.2.5 GST家族基因对杀虫剂的响应 |
| 5.2.6 上游序列转录因子结合位点的预测 |
| 5.2.7 杀虫剂通过CncC/Maf途径调控GST基因的共表达 |
| 5.2.8 ROS介导杀虫剂对GST基因的诱导表达 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点与尚有待解决的问题 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 攻读学位期间发表的论文 |
| 附录Ⅱ 攻读学位期间获得奖励及参加学术会议 |
| 致谢 |
（6）核酸G四链体结构在伪狂犬病毒EPO基因的表达和病毒增殖中的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病(Pseudorabies,PR) |
| 1.1 伪狂犬病的简介 |
| 1.2 伪狂犬病的流行特点 |
| 1.3 伪狂犬病的防控现状 |
| 1.4 伪狂犬病疫苗的研究进展 |
| 2 伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)的分子生物学特性 |
| 2.1 PRV的主要理化性质 |
| 2.2 PRV基因组 |
| 2.3 PRV的主要蛋白 |
| 2.4 PRV的复制周期 |
| 2.5 PRV EPO基因研究进展 |
| 3 G四链体结构的结构特征以及生物学功能 |
| 3.1 G四链体的结构特征 |
| 3.2 G四链体结构的生物学功能 |
| 3.2.1 对DNA复制的影响 |
| 3.2.2 对DNA转录的影响 |
| 3.2.3 对mRNA翻译的影响 |
| 3.2.4 对表观遗传的影响 |
| 3.2.5 对前体RNA剪接的影响 |
| 3.2.6 对病理学过程的影响 |
| 3.2.7 对端粒酶活性的影响 |
| 4 G四链体结构在病毒中的研究 |
| 4.1 G四链体结构在DNA病毒中的研究 |
| 4.2 G四链体结构在RNA病毒中的研究 |
| 5 G四链体结构小分子配体 |
| 6 小结 |
| 第二章 EPO基因启动子序列中G四链体的结构和功能鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂配制方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂配制方法 |
| 3 方法 |
| 3.1 生物信息学分析 |
| 3.2 双链DNA的制备及回收 |
| 3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) |
| 3.3.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.3.2 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.4 硫酸二甲酯足迹保护试验(DMS Footprinting) |
| 3.5 Taq聚合酶延伸阻滞试验 |
| 3.6 圆二色光谱分析(CD) |
| 3.7 PDS与双链DNA |
| 3.8 FRET melting |
| 3.9 MTT检测细胞活性 |
| 3.10 载体构建 |
| 3.11 无内毒素的质粒中量提取 |
| 3.12 质粒转染 |
| 3.13 荧光素酶报告基因试验 |
| 3.14 BCA法测蛋白浓度 |
| 4 结果 |
| 4.1 伪狂犬病毒EPO基因启动子序列的生物信息学分析 |
| 4.2 不同条件对双链DNA形成G四链体结构的影响 |
| 4.2.1 FAM标记的双链DNA的制备 |
| 4.2.2 钾离子对G4形成的影响 |
| 4.2.3 PEG200对G4形成的影响 |
| 4.2.4 不同离子对G4形成的影响 |
| 4.3 富含G的单链DNA形成稳定的G四链体结构 |
| 4.3.1 变性聚丙烯酰胺凝胶 |
| 4.3.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.3.3 圆二色光谱分析(CD) |
| 4.4 EPO启动子的富含G区域可以形成多种G四链体结构 |
| 4.4.1 硫酸二甲酯足迹保护试验鉴定参与G四链体结构形成的鸟嘌呤碱基 |
| 4.4.2 Taq聚合酶延伸阻滞试验验证G四链体结构的多样性 |
| 4.5 小分子配体可以促进并稳定G四链体结构的形成 |
| 4.5.1 FRET melting |
| 4.5.2 Taq聚合酶延伸阻滞试验 |
| 4.5.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.6 G四链体结构对EPO启动子的负调控 |
| 4.6.1 含有EPO启动子质粒的构建 |
| 4.6.2 野生型和G4突变的启动子活性 |
| 4.6.3 PDS对野生型和G4突变的启动子活性 |
| 4.6.4 MTT检测PDS对细胞活性的影响 |
| 5 讨论与结论 |
| 第三章 Sp1蛋白的原核表达及其与G-四链体结构的关系探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂配制方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂配制方法 |
| 3 方法 |
| 3.1 引物设计与合成 |
| 3.2 PCR扩增 |
| 3.3 PCR产物纯化回收 |
| 3.4 重组表达载体的构建 |
| 3.5 重组质粒的诱导表达及鉴定 |
| 3.5.1 最佳诱导表达条件的筛选 |
| 3.5.2 SDS-PAGE鉴定目的蛋白 |
| 3.5.3 重组融合蛋白的可溶性分析 |
| 3.6 融合蛋白的纯化 |
| 3.6.1 融合蛋白大量诱导表达 |
| 3.6.2 融合蛋白的纯化 |
| 3.7 电泳迁移率试验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA) |
| 3.7.1 双链DNA的扩增与回收 |
| 3.7.2 退火形成G四链体结构 |
| 3.7.3 双链DNA与Sp1蛋白结合试验 |
| 3.7.4 单链DNA与Sp1蛋白结合试验 |
| 4 结果 |
| 4.1 Sp1基因的克隆 |
| 4.2 六种不同标签原核表达载体的构建 |
| 4.3 六种表达载体的最优表达条件探究 |
| 4.3.1 重组载体Grifin-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.2 重组载体GST-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.3 重组载体MBP-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.4 重组载体SUMO-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.5 重组载体Thioredoxin-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.6 重组载体Arsc-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.4 六种融合蛋白的可溶性分析 |
| 4.5 融合蛋白的纯化 |
| 4.6 G四链体结构促进了Sp1与EPO启动子的结合 |
| 4.6.1 Sp1蛋白与双链DNA形成的G四链体结构的关系 |
| 4.6.2 Sp1蛋白与单链DNA形成的G四链体结构的关系 |
| 5 结论与讨论 |
| 第四章 稳定G-四链体结构的小分子配体的抗病毒研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂配制方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂及配制方法 |
| 3 方法 |
| 3.1 Sp1基因细胞内的过表达 |
| 3.1.1 Sp1基因的引物设计 |
| 3.1.2 PCR以及双链DNA的回收 |
| 3.1.3 过表达载体的构建 |
| 3.1.4 中提质粒 |
| 3.1.5 质粒的转染 |
| 3.2 Sp1过表达对EPO启动子活性的影响 |
| 3.2.1 过表达质粒与启动子活性检测质粒的共转染 |
| 3.2.2 荧光素酶报告基因试验 |
| 3.3 Sp1基因敲减细胞系的建立 |
| 3.3.1 shRNA的设计 |
| 3.3.2 慢病毒载体的构建 |
| 3.3.3 慢病毒的包装 |
| 3.3.4 稳定敲减细胞系的建立 |
| 3.4 Sp1敲减后对EPO启动子活性的影响 |
| 3.5 病毒的扩增以及TCID50的测定 |
| 3.5.1 病毒的扩增 |
| 3.5.2 病毒TCID50的测定 |
| 3.6 流式细胞仪检测细胞中PRV-GFP病毒感染的细胞数 |
| 3.7 小分子配体PDS以及BRACO19对细胞的毒性 |
| 3.8 小分子配体对PRV的抗病毒效果最优条件的探索 |
| 3.9 不同浓度PDS在不同时间点对PRV-GFP病毒滴度的影响 |
| 3.10 小分子配体对PRV病毒生活周期的影响 |
| 3.10.1 病毒灭活试验 |
| 3.10.2 病毒入侵试验 |
| 3.10.3 预处理试验 |
| 3.10.4 复制试验 |
| 3.10.5 吸附试验 |
| 3.10.6 全过程加药 |
| 3.11 PDS对PRV HN-1201病毒生长曲线的影响 |
| 3.12 细胞RNA的提取 |
| 3.13 反转录 |
| 3.14 荧光定量PCR |
| 3.15 细胞总蛋白的提取及定量 |
| 3.16 Western blotting检测 |
| 3.16.1 SDS-PAGE胶分离蛋白 |
| 3.16.2 转膜 |
| 3.16.3 抗体孵育 |
| 3.16.4 显影 |
| 4 结果 |
| 4.1 过表达Sp1对EPO启动子活性的影响 |
| 4.1.1 Sp1过表达载体的构建 |
| 4.1.2 过表达Sp1后EPO启动子活性增强 |
| 4.2 Sp1敲减后对EPO启动子活性的影响 |
| 4.2.1 敲减载体的构建 |
| 4.2.2 敲减效率的测定 |
| 4.2.3 Sp1敲减后EPO启动子活性降低 |
| 4.3 小分子配体PDS和BRACO19的细胞毒性 |
| 4.4 小分子配体PDS对PRV-GFP病毒的影响 |
| 4.5 小分子配体PDS以及BRACO19对PRV-GFP病毒周期的影响 |
| 4.5.1 PDS对PRV-GFP在Vero细胞中生活周期的影响 |
| 4.5.2 PDS对PRV-GFP在PK15细胞中生活周期的影响 |
| 4.5.3 BRACO19对PRV-GFP在Vero细胞中生活周期的影响 |
| 4.6 PDS对PRV HN-1201生长曲线的影响 |
| 4.7 PDS对PRV HN-1201毒株基因组中基因的影响 |
| 4.7.1 Vero细胞中PDS对PRV HN-1201毒株基因组中基因的影响 |
| 4.7.2 PK15细胞中PDS对PRV HN-1201毒株基因组中基因的影响 |
| 5 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附录1 攻读博士期间发表文章及个人荣誉 |
| 附录2 英文缩略词表 |
（7）乙肝病毒PreS区突变的人肝癌细胞系HepG2稳定株的构建及其生物学行为（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1.1 在线数据库、细胞和质粒 |
| 1.1.1 在线数据库GenBank |
| 1.1.2 细胞系及菌株 |
| 1.1.3 质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.2.1 主要试剂和试剂盒 |
| 1.2.2 主要溶液和缓冲液 |
| 1.2.3 主要仪器、设备 |
| 1.3 实验方法及流程 |
| 1.3.1 PreS片段序列的设计 |
| 1.3.2 全基因组合成目的片段及重组质粒的慢病毒液制备 |
| 1.3.3 重组质粒的鉴定 |
| 1.3.4 细胞培养与慢病毒转染 |
| 1.3.5 嘌呤霉素压力浓度筛选 |
| 1.3.6 FLAG标签Western Bolt鉴定 |
| 1.3.7细胞克隆形成实验 |
| 1.3.8细胞划痕实验 |
| 1.3.9 统计学方法 |
| 结果 |
| 2.1 HepG2细胞稳定株筛选和验证实验 |
| 2.1.1 PCR、双酶切验证实验 |
| 2.1.2 目的片段Sanger测序 |
| 2.1.3 FLAG-HBV-S蛋白表达的检测 |
| 2.2 HepG2 细胞稳定株的生物学行为的检测 |
| 2.2.1 HepG2 细胞稳定株增殖活性的检测 |
| 2.2.2 HepG2细胞稳定株迁移能力的检测 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 乙肝病毒突变导致的内质网应激及乙肝相关肝癌的抗病毒治疗的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）乙型肝炎病毒通过miR-192-3p-XIAP轴调控NF-κB信号通路诱导自噬以促进病毒自身复制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 乙型肝炎病毒(HBV)研究现状概述 |
| 1.1.1 HBV的发现 |
| 1.1.2 HBV的基因组结构和编码的蛋白 |
| 1.1.3 HBV的感染周期 |
| 1.1.4 HBx的功能研究 |
| 1.2 HBV利用自噬反应促进自身复制 |
| 1.2.1 自噬的发现 |
| 1.2.2 自噬的分类 |
| 1.2.3 自噬反应发生的过程 |
| 1.2.4 HBV利用自噬促进自身复制 |
| 1.3 miRNA在 HBV诱导自噬反应中的研究进展 |
| 1.3.1 miRNA的发现 |
| 1.3.2 miRNA的产生和功能 |
| 1.3.3 miRNA与自噬 |
| 1.3.4 miRNA与 HBV |
| 1.3.5 miRNA在 HBV诱导自噬反应中的调控作用 |
| 1.4 NF-κB信号通路的研究进展 |
| 1.4.1 NF-κB信号通路的组成 |
| 1.4.2 NF-κB信号通路的类别 |
| 1.4.3 HBV/HBx调控NF-κB信号通路的活性 |
| 1.4.4 NF-κB信号通路与自噬 |
| 1.5 XIAP的研究进展 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验相关仪器设备 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 细胞,细胞培养与细胞转染 |
| 2.2.2 表达质粒的构建 |
| 2.2.3 化学药品,抗体和其他试剂 |
| 2.2.4 细胞/组织/血清中的RNA提取 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂 |
| 2.2.6 免疫印迹(western blot)所用试剂 |
| 2.2.7 双荧光素酶报告基因实验所用材料 |
| 2.2.8 共聚焦和透射电镜观察自噬体所用材料 |
| 2.2.9 酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒 |
| 2.2.10 Southern blot and Northern blot所用试剂 |
| 2.2.11 免疫共沉淀实验(Co-IP) |
| 2.2.12 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验所用试剂 |
| 2.2.13 小鼠尾静脉高压注射相关材料 |
| 2.2.14 本研究所用引物列表 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 细胞相关实验 |
| 2.3.2 质粒的构建与扩增 |
| 2.3.3 RNA的提取 |
| 2.3.4 qRT-PCR实验 |
| 2.3.5 免疫印迹(western blot) |
| 2.3.6 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.7 激光共聚焦显微镜观察自噬体 |
| 2.3.8 ELISA检测HBV抗原分泌 |
| 2.3.9 Southern blot 和 Northern blot 实验 |
| 2.3.10 Co-IP 实验 |
| 2.3.11 CHIP 实验 |
| 2.3.12 Balb/C小鼠尾静脉高压注射 |
| 2.3.13 HBV病毒的浓缩与定量 |
| 2.3.14 HBV病毒感染人原代肝细胞 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 HBV感染抑制miR-192-3p的表达 |
| 3.1.1 研究背景 |
| 3.1.2 HBV浓度梯度抑制miR-192-3p的分泌 |
| 3.1.3 HBV浓度梯度抑制miR-192-3p的胞内表达 |
| 3.1.4 HBV通过HBx抑制miR-192-3p转录 |
| 3.1.5 c-Myc显着抑制miR-192-3p的水平 |
| 3.1.6 HBx通过稳定c-Myc表达而抑制miR-192-3p的水平 |
| 3.1.7 HBx与c-Myc共同结合miR-192 的启动子 |
| 3.2 HBV抑制miR-192-3p而上调XIAP的表达 |
| 3.2.1 研究背景 |
| 3.2.2 筛选miR-192-3p的靶基因 |
| 3.2.3 确证XIAP作为miR-192-3p的靶基因 |
| 3.2.4 HBV抑制miR-192-3p而上调XIAP的表达 |
| 3.3 HBV通过miR-192-3p-XIAP轴诱导自噬 |
| 3.3.1 研究背景 |
| 3.3.2 HBV诱导自噬发生 |
| 3.3.3 miR-192-3p抑制自噬反应但不影响自噬流 |
| 3.3.4 miR-192-3p抑制HBV诱导的自噬反应 |
| 3.3.5 XIAP诱导自噬 |
| 3.3.6 Anti-miR-192-3p通过上调XIAP而促进自噬 |
| 3.3.7 HBV调控miR-192-3p-XIAP轴诱导自噬 |
| 3.4 HBV通过miR-192-3p-XIAP诱导自噬而促进HBV复制 |
| 3.4.1 研究背景 |
| 3.4.2 miR-192-3p抑制HBV壳体化DNA的水平和抗原分泌 |
| 3.4.3 XIAP促进HBV复制 |
| 3.4.4 Anti-miR-192-3p通过上调XIAP而促进病毒复制 |
| 3.4.5 HBV调控miR-192-3p-XIAP轴诱导HBV自身复制 |
| 3.5 HBV通过miR-192-3p-XIAP轴调控NF-ΚB通路诱导自噬而促进HBV复制 |
| 3.5.1 研究背景 |
| 3.5.2 miR-192-3p靶向XIAP抑制NF-κB信号通路 |
| 3.5.3 HBV通过miR-192-3p上调XIAP激活NF-κB信号通路 |
| 3.5.4 SC-514 抑制NF-κB信号通路减弱了HBV诱导的自噬和HBV病毒复制 |
| 3.5.5 SN50 抑制NF-κB信号通路减弱了HBV诱导的自噬和HBV病毒复制 |
| 3.6 体内实验证实HBV通过miR-192- 3p-XIAP轴诱导自噬并且促进其自身的复制 |
| 3.6.1 研究背景 |
| 3.6.2 在小鼠体内HBV急性感染抑制miR-192-3p的表达 |
| 3.6.3 在小鼠体内HBV-miR-192-3p-XIAP轴诱导自噬 |
| 3.6.4 在小鼠体内HBV通过miR-192-3p-XIAP轴促进自身复制 |
| 3.7 HBV病毒感染人的原代肝细胞后抑制miR-192-3p而上调XIAP水平进而诱导自噬并且促进其自身的复制 |
| 3.7.1 研究背景 |
| 3.7.2 HBV感染原代肝细胞抑制miR-192-3p的表达 |
| 3.7.3 HBV感染原代肝细胞促进XIAP的转录 |
| 3.7.4 miR-192-3p抑制HBV感染原代肝细胞诱导的自噬 |
| 第四章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（9）猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎病毒概述 |
| 1.1.1 猪传染性胃肠炎病毒的致病机制 |
| 1.1.2 猪传染性胃肠炎病毒的流行特点 |
| 1.1.3 猪传染性胃肠炎病毒的形态特征 |
| 1.1.4 猪传染性胃肠炎病毒的分类 |
| 1.1.5 猪传染性胃肠炎病毒的理化性质 |
| 1.1.6 猪传染性胃肠炎病毒的培养特性 |
| 1.1.7 猪传染性胃肠炎病毒的抗原特性 |
| 1.1.8 猪传染性胃肠炎病毒引起的机体免疫应答 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒的分子特征 |
| 1.2.1 猪传染性胃肠炎病毒的基因组结构 |
| 1.2.2 猪传染性胃肠炎病毒结构蛋白基因 |
| 1.2.3 猪传染性胃肠炎病毒的非结构蛋白基因 |
| 1.2.4 猪传染性胃肠炎病毒蛋白的表达和生物学功能 |
| 1.3 猪传染性胃肠炎疫苗 |
| 1.3.1 常规疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 1.4 白细胞介素12研究进展 |
| 1.4.1 白细胞介素12的分子结构和信号传导途径 |
| 1.4.2 白细胞介素12的生物学活性 |
| 1.4.3 白细胞介素12在疾病感染中的治疗作用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 分子生物学试剂 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.1.4 试剂的配制和贮存 |
| 2.1.5 主要实验仪器设备 |
| 2.1.6 细胞株、毒株、载体及质粒 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪传染性胃肠炎病毒分布情况调查和S基因的生物信息学分析 |
| 2.2.2 重组真核表达质粒pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)和pVAX1-TGEV-S1的制备 |
| 2.2.3 重组真核表达质粒pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)和pVAX1-TGEV-S1在BHK细胞中的体外瞬时表达 |
| 2.2.4 重组真核表达质粒pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)和pVAX1-TGEV-S1的仔猪免疫保护实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪传染性胃肠炎病毒感染分布情况的调查和S基因的生物信息学分析 |
| 3.1.1 TGEV感染的RT-PCR调查 |
| 3.1.2 TGEVS基因的生物信息学分析 |
| 3.2 pVAX1-TGEVS1和pVAX1-pIL-12(p40)-linker-pIL-12(p35)真核表达质粒的体外瞬时转染 |
| 3.2.1 内毒素检测 |
| 3.2.2 pVAX1-TGEVS1真核表达质粒的体外瞬时转染 |
| 3.2.3 pVAX1-pIL-12(p40)-linker-pIL-12(p35)真核表达质粒的体外瞬时转染 |
| 3.3 免疫仔猪TGEV攻毒后外周血中T淋巴细胞的增殖变化 |
| 3.4 免疫仔猪TGEV攻毒后外周血中不同亚型T淋巴细胞的动态变化 |
| 3.4.1 仔猪外周血中CD4+T淋巴细胞的动态变化 |
| 3.4.2 仔猪外周血中CD8+T淋巴细胞的动态变化 |
| 3.5 免疫仔猪TGEV攻毒后外周血中细胞毒性T淋巴细胞的含量 |
| 3.6 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中抗TGEVS1IgG抗体含量的动态变化 |
| 3.7 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中TGEV中和抗体的效价 |
| 3.8 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中TGEV-IgA抗体的含量 |
| 3.9 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中IL-4和IFN-γ含量的动态变化 |
| 3.10 免疫仔猪TGEV攻毒后肠道组织内的病毒分布 |
| 3.11 免疫仔猪TGEV攻毒后肠道组织内病理组织学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TGEV感染分布情况的调查和S基因的生物信息学分析 |
| 4.2 TGEVS1核酸疫苗和免疫佐剂pIL-12的设计 |
| 4.3 重组真核表达质粒的体外瞬时转染 |
| 4.4 免疫仔猪TGEV攻毒后细胞免疫应答的动态变化 |
| 4.5 免疫仔猪TGEV攻毒后体液免疫应答的动态变化 |
| 4.6 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中细胞因子IL-4和IFN-γ的水平 |
| 4.7 免疫仔猪TEGV攻毒后肠道组织中的病毒分布和病理变化 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）表达猪流行性腹泻—轮状病毒的重组伪狂犬病病毒株的构建及部分生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒的危害和流行特点 |
| 1.2 PEDV的分子生物学 |
| 1.2.1 PEDV的分子结构 |
| 1.2.2 PEDV S基因及纤突蛋白功能 |
| 1.3 PEDV疫苗研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 2 轮状病毒 |
| 2.1 轮状病毒的危害和流行特点 |
| 2.2 RV的病原学特征 |
| 2.3 PoRV的分子生物学 |
| 2.3.1 PoRV的分子结构及部分蛋白功能 |
| 2.3.2 RV编码的主要抗原蛋白 |
| 2.4 PoRV疫苗研究进展 |
| 2.4.1 传统疫苗 |
| 2.4.2 基因工程疫苗 |
| 3 病毒活载体疫苗的研究进展 |
| 3.1 病毒活载体疫苗概述 |
| 3.2 伪狂犬病毒活载体疫苗 |
| 3.2.1 PRV基因组的结构 |
| 3.2.2 国内外伪狂犬病病毒活载体疫苗的研究进展 |
| 第二章 PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、质粒、毒株和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PEDV S基因和PoRVVP7基因的扩增 |
| 2.1.1 PEDV S基因和PoRVVP7基因片段引物设计和合成 |
| 2.1.2 Vero细胞和MA-104细胞的复苏 |
| 2.1.3 病毒的增值培养 |
| 2.1.4 PoRV和PEDV的总RNA提取 |
| 2.1.5 cDNA的获得 |
| 2.1.6 VP7基因和S基因的RT-PCR扩增 |
| 2.1.7 VP7基因和S基因的纯化回收 |
| 2.2 pMD-VP7、pMD-S克隆质粒的构建 |
| 2.2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2.2 目的片段和pMD19-T(simple)载体的连接 |
| 2.2.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 |
| 2.2.4 阳性重组工程菌的筛选和PCR鉴定 |
| 2.2.5 质粒的提取 |
| 2.2.6 目的基因的序列测定与抗原参数分析 |
| 2.3 pMD-VP7.S重组质粒的构建 |
| 2.3.1 pMD-VP7和pMD-S质粒DNA抽提 |
| 2.3.2 S基因和质粒pMD-VP7的酶切回收 |
| 2.3.3 S基因和pMD-VP7的连接转化 |
| 2.3.4 pMD-VP7.S阳性重组工程菌的筛选和PCR鉴定 |
| 2.3.5 pMD-VP7.S的酶切鉴定 |
| 2.4 pEGFP-VP7.S真核转移载体的构建 |
| 2.4.1 pMD-VP7.S和pEGFP-gI28k质粒DNA抽提 |
| 2.4.2 VP7.S融合基因和质粒pEGFP-gI28k的酶切回收 |
| 2.4.3 VP7.S融合基因和pEGFP-gI28k的连接 |
| 2.4.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 |
| 2.4.5 pEGFP-gI28k阳性工程菌的筛选和PCR鉴定 |
| 2.4.6 pEGFP-VP7.S真核转移质粒的酶切鉴定 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 PEDV S基因和PoRVVP7基因的扩增结果 |
| 3.2 pMD-VP7、pMD-S克隆质粒的构建结果 |
| 3.2.1 pMD-VP7、pMD-S重组工程菌的PCR鉴定 |
| 3.2.2 pMD-VP7、pMD-S克隆质粒的序列测定 |
| 3.2.3 目的基因片段抗原参数分析 |
| 3.3 pMD-VP7.S重组质粒的构建结果 |
| 3.3.1 pMD-VP7.S重组工程菌的PCR鉴定 |
| 3.3.2 pMD-VP7.S重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.3 pMD-VP7.S重组质粒的序列测定结果 |
| 3.4 pEGFP-VP7.S真核转移载体的构建结果 |
| 3.4.1 pEGFP-VP7.S重组工程菌的PCR鉴定 |
| 3.4.2 pEGFP-VP7.S真核转移质粒的酶切鉴定 |
| 3.4.3 pEGFP-VP7.S真核转移质粒的序列测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PEDV S基因片段和PoRVVP7基因片段的选择 |
| 4.2 Linker序列的设计 |
| 4.3 PRV转移载体的构建 |
| 5 小结 |
| 第三章 表达PEDV S和PoRVVP7基因的重组伪狂犬病病毒株的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、毒株和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 PRV转移质粒pEGFP-VP7.S的抽提 |
| 2.2 PRV和pEGFP-VP7.S质粒DNA的共转染 |
| 2.3 重组病毒的筛选 |
| 2.4 重组病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的PCR鉴定 |
| 2.5.1 重组病毒的基因组DNA的抽提 |
| 2.5.2 重组病毒PCR鉴定 |
| 2.6 重组病毒的Western-Blotting检测 |
| 2.6.1 蛋白样品制备 |
| 2.6.2 SDS-PAGE |
| 2.6.3 Western-Blotting分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV转移质粒pEGFP-VP7.S在293T细胞中表达结果 |
| 3.2 重组病毒的筛选结果 |
| 3.3 重组病毒PRV(CM)的PCR鉴定结果 |
| 3.4 重组病毒PRV(CM)的Western-Blotting结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 提高同源重组效率的方式 |
| 4.2 重组病毒PRV(CM)株的筛选 |
| 4.3 重组病毒PRV(CM)株的表达 |
| 5 小结 |
| 第四章 重组病毒PRV(CM)株部分生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株和细胞 |
| 1.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV(CM)在BHK-21细胞上的增值特性观察 |
| 2.2 PRV(CM)在不同细胞上的增值特性观察 |
| 2.3 重组病毒PRV(CM)株和PRVXJ株的TCID50测定 |
| 2.4 PRVgB基因荧光定量方法的建立 |
| 2.4.1 引物设计 |
| 2.4.2 pMD-gB阳性标准品的制备 |
| 2.4.3 反应条件优化 |
| 2.4.4 重复性和特异性评价 |
| 2.4.5 PRVgB荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.5 重组病毒PRV(CM)和PRVXJ株一步生长曲线测定 |
| 2.6 重组病毒PRV(CM)株遗传稳定性测定 |
| 2.7 不同代次重组病毒株体外培养各时间点的病毒含量测定比较 |
| 2.8 重组病毒PRV(CM)的空斑观察 |
| 2.9 安全性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV(CM)在BHK-21细胞上的增值特性观察结果 |
| 3.2 重组病毒PRV(CM)株在不同细胞上的增值特性观察结果 |
| 3.3 重组病毒和亲本株的TCID50测定结果 |
| 3.4 PRVgB基因荧光定量方法的建立 |
| 3.4.1 PRVgB片段的扩增 |
| 3.4.2 反应条件的优化 |
| 3.4.3 PRVgB荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.4.4 PRVgB基因荧光定量PCR方法的特异性、重复性评价 |
| 3.5 PRV(CM)和PRVXJ株一步生长曲线的绘制 |
| 3.6 重组病毒PRV(CM)遗传稳定性检测结果 |
| 3.7 不同代次PRV(CM)在各时间点的病毒含量测定结果比较 |
| 3.8 重组病毒PRV(CM)的空斑形成 |
| 3.9 重组病毒PRV(CM)安全性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PEDV、PoRV、PRV三价基因工程疫苗的意义 |
| 4.2 外源基因的插入对伪狂犬病毒增殖的影响 |
| 4.3 重组病毒部分生物学特性研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、HBV3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]基于比较转录组学分析代谢改造粘质沙雷氏菌JNB5-1高效合成灵菌红素[D]. 孙杨. 江南大学, 2021(01)
- [2]SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究[D]. 高知枭. 华中农业大学, 2020
- [3]CRISPR系统对大肠杆菌Ⅰ类整合子的敲除、抑制及基因重组工具的开发[D]. 李清扬. 华南理工大学, 2020(05)
- [4]猪流行性腹泻病毒E蛋白参与病毒复制的研究[D]. 于佳琦. 浙江大学, 2020
- [5]甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制[D]. 胡波. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]核酸G四链体结构在伪狂犬病毒EPO基因的表达和病毒增殖中的作用[D]. 孔江南. 河南农业大学, 2019(04)
- [7]乙肝病毒PreS区突变的人肝癌细胞系HepG2稳定株的构建及其生物学行为[D]. 郑羽飘. 天津医科大学, 2019(02)
- [8]乙型肝炎病毒通过miR-192-3p-XIAP轴调控NF-κB信号通路诱导自噬以促进病毒自身复制[D]. 汪静雯. 武汉大学, 2019(08)
- [9]猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究[D]. 李训良. 东北农业大学, 2018(02)
- [10]表达猪流行性腹泻—轮状病毒的重组伪狂犬病病毒株的构建及部分生物学特性研究[D]. 毛汐语. 四川农业大学, 2018(02)