一、FG020326通过增加泰素帝介导caspase-8和3激活的敏感性克服多药耐药细胞MCF-7/ADR的凋亡抗性（论文文献综述）
张玺[1]（2020）在《苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究》文中提出背景:卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。由于早期无明显症状,缺乏有效的早期检测筛查手段,约70%患者在诊断时已是晚期。目前,手术联合化疗是卵巢恶性肿瘤的主要治疗手段,但化疗对患者身体毒副作用大,且容易复发并产生耐药性。磷酸化是目前研究最广泛的翻译后修饰（post-translational modifications,PTMs）,能够调节细胞生长、分化、凋亡等多种细胞功能。磷酸化信号通路的改变与癌症密切相关,同时它们也可作为抗癌药物开发的潜在靶点。蛋白质组学研究表明,由磷酸化等蛋白翻译后修饰介导的信号通路在卵巢癌的发生和耐药过程中起着关键作用。苦参碱是从中药苦参中提取的有效生物活性成分,具有广泛的生物学活性,比如抗炎、抗病毒、抗癌、镇痛、抗菌、抗氧化、降血脂、抗肝纤维化等。大量研究表明,苦参碱在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多种类型的癌症中具有明确的抗癌效果。然而,苦参碱对卵巢癌的影响及其潜在的分子机制尚未见报道。目的:本研究旨在探究苦参碱对卵巢癌的作用及其分子机理,为苦参碱作为新型抗癌药物的深入研究提供线索和依据。方法:1.MTT法和平板克隆形成实验检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP增殖能力的影响。2.流式细胞术检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞周期和凋亡的影响。3.透射电子显微镜和荧光显微镜观察苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP自噬的影响。4.划痕实验、Transwell侵袭实验和免疫荧光技术评估苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞迁移和侵袭的影响。5.体外血管生成试验探讨苦参碱对肿瘤血管生成的影响。6.酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3分泌血管内皮生成因子VEGFA的影响。7.逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测苦参碱对血管内皮生成因子VEGFA和血管生成素ANG-1m RNA水平的影响。8.Western blot检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关蛋白的表达及肿瘤相关磷酸化信号通路的影响。9.分别建立卵巢癌细胞A2780和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP裸鼠皮下移植瘤和尾静脉小鼠模型,定期腹腔注射苦参碱,观察苦参碱对体内卵巢癌细胞增殖和转移能力的影响。10.苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,H&E）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织坏死、肿瘤转移及肝脏损伤的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记技术（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织凋亡的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780和小鼠肿瘤组织总的蛋白质磷酸化水平的影响以及肿瘤组织中增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响。12.免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）进一步验证苦参碱对小鼠肿瘤组织中信号通路蛋白磷酸化水平的影响。13.全自动生化分析仪测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartic aminotransferase,AST）含量,评估苦参碱对小鼠肝功能的影响。结果:1.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱阻滞卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞周期在G0/G1期,上调p21蛋白表达,下调cyclin D1和CDK4蛋白表达;同时降低ERK1/2和MEK1/2蛋白磷酸化水平。3.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3发生凋亡,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达;同时降低PI3K和Akt蛋白磷酸化水平。4.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3自噬,上调LC3-II蛋白表达,下调SQSTM1蛋白表达;同时降低Akt和m TOR蛋白磷酸化水平。5.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3迁移和侵袭,降低FAK和Rho A蛋白活性及磷酸化水平。6.苦参碱抑制卵巢癌细胞对血管生成的促进作用,降低卵巢癌细胞A2780和SKOV3分泌VEGFA水平,同时降低卵巢癌A2780和SKOV3细胞中VEGFA m RNA和蛋白表达水平。7.苦参碱降低HUVEC/A2780和HUVEC/SKOV3共培养体系中内皮细胞HUVECs中ANG-1 m RNA和蛋白表达水平,同时下调VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。8.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780体内肿瘤增殖和转移能力,降低卵巢癌细胞和肿瘤组织中总的蛋白质磷酸化水平。9.Western blot和IHC结果表明,苦参碱下调肿瘤组织中信号通路相关蛋白ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2、Tie2蛋白磷酸化水平。10.苦参碱对肝脏组织无损伤作用,对小鼠血清中ALT和AST含量变化无显着影响。11.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,抑制细胞迁移和肿瘤血管生成。12.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP体内肿瘤增殖和转移能力。结论:苦参碱能够抑制卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制细胞迁移和侵袭、抑制肿瘤血管生成,同时降低ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。苦参碱通过抑制肿瘤相关磷酸化信号通路调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成,从而抑制卵巢癌的发生发展。背景:近几十年来,分子靶向治疗已在许多癌症类型的临床治疗中取得了良好的疗效,如乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌等。确定理想的靶点是肿瘤分子靶向治疗成功的关键。分子靶向治疗的靶点可作用于细胞表面抗原、受体和生长因子,能够调控细胞增殖和转移、细胞周期和血管生成相关信号转导通路。靶向治疗可与过表达的分子结合,调节该分子调控的信号转导通路,从而抑制肿瘤细胞增殖,最终导致细胞死亡。原癌基因c-Src（Src）是一种非受体酪氨酸激酶,与多种人类癌症的发生、维持、进展和转移扩散密切相关。Src通过与多种蛋白和蛋白复合物相互作用并使其磷酸化,在细胞信号传导过程中起关键作用。苦参碱是从传统中药苦参中提取的生物碱之一,具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等广泛的药理学活性。研究表明,苦参碱对多种癌症类型包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、白血病等均具有抗肿瘤活性。苦参碱发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭、抑制血管生成等途径实现的。目前,有关苦参碱抗肿瘤作用的研究颇为广泛,然而其发挥抗癌活性的直接作用靶点尚未见报道。目的:本研究旨在寻找苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点并探讨其作用机制,为开发肿瘤靶向药物提供实验依据。方法:1.选取人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF7、人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3、人宫颈癌细胞He La六种癌细胞为研究对象,MTT法检测苦参碱对癌细胞增殖能力的影响。2.分别建立人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3皮下移植瘤模型,定期腹腔注射苦参碱或生理盐水,观察苦参碱对体内肿瘤增殖能力的影响。3.以槐果碱和乙醇胺为原料进行化学反应,合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱。红外光谱和质谱对13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱进行结构表征。4.13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱与氨基偶联树脂进行偶联反应,制备苦参碱偶联树脂。紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度变化,间接反映偶联反应效率。5.提取卵巢癌细胞SKOV3总蛋白,利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色寻找苦参碱特异性结合蛋白。液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）鉴定苦参碱特异性结合蛋白。6.细胞热转变分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）实验验证苦参碱作用靶点;构建GST-Src重组蛋白,Pull down实验进一步验证苦参碱作用靶点。7.构建Src分段质粒,转染HEK293T细胞,Pull down实验验证苦参碱结合区域。8.构建GST-Kinase重组蛋白,Western blot进一步验证苦参碱结合区域。9.采用Discovery Studio 4.5软件,分子对接苦参碱与Src激酶结构域,探究苦参碱结合Src激酶结构域的氨基酸。10.选取苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞,测定苦参碱对癌细胞中Src激酶活性的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:1.苦参碱抑制癌细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱抑制体内癌细胞增殖能力。3.化学合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱,产率为65%,红外光谱与质谱结构表征结果与13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱结构一致。4.制备苦参碱偶联树脂,紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度,偶联反应效率为54%。5.利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色结果显示,分子量55-70 k Da之间有明显蛋白条带;且加入苦参碱后,此蛋白条带明显减弱,猜测此蛋白可能为苦参碱特异性结合蛋白。LC-MS/MS质谱定性分析发现,Src为苦参碱特异性结合蛋白。6.CETSA实验结果表明,与对照组相比,苦参碱处理组Src蛋白的热稳定性明显增强。同时,GST-Src重组蛋白进行Pull down实验,结果显示,苦参碱偶联树脂组检测到Src蛋白,且加入苦参碱后,Src蛋白明显减少,进一步证实Src为苦参碱作用靶点。7.分别构建Src分段质粒USH3、SH4-UD、SH3、SH2、Kinase,转染HEK293T细胞过表达后,提取总蛋白进行Pull down实验,Western blot结果分析显示,苦参碱结合Src激酶结构域。8.GST-Kinase重组蛋白进行Pull down实验,Western blot结果表明,苦参碱偶联树脂组检测到目的蛋白,且加入苦参碱后,目的蛋白明显减少,进一步证实Src激酶结构域为苦参碱结合区域。9.Discovery Studio 4.5软件预测苦参碱与Src激酶结构域3D分子对接情况,结果显示,苦参碱结合Src激酶结构域,主要作用可能是因为苦参碱与Ala392形成较强的氢键作用力;同时,苦参碱与周围氨基酸形成范德华力等其他作用力。10.苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞后,细胞中Src激酶活性均显着降低。11.Western blot结果表明,苦参碱显着下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。结论:苦参碱抑制癌细胞增殖。苦参碱作用靶点为Src,Src激酶结构域为苦参碱结合区域。同时,苦参碱能够下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3和PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。因此,苦参碱通过靶向Src激酶结构域下调磷酸化信号通路进而抑制癌细胞增殖。
程旭[2]（2020）在《基于肿瘤微环境设计多功能纳米前药用于逆转肿瘤多药耐药性》文中认为近些年来,化疗一直是癌症治疗的首选手段,在临床应用中可明显改善癌症患者生存状况。然而,传统的药物化疗缺乏选择性和靶向性,易被体内清除同时给患者带来严重的副作用,这些不利因素极大地限制了临床化疗疗效。随着纳米医学的发展,一些纳米药物制剂被设计用来提高化疗效应,尽管这些纳米制剂在一定程度上改善了抗癌药剂的不足,但是实际应用到临床并取得突出效果的仍然是极少的。机体的多种屏障（如血液循环、清除系统等）以及肿瘤的异质性（如细胞间质、流体压力、多药耐药等）严重阻碍了纳米药物制剂的临床转化。其中,肿瘤耐药的产生极易导致化疗失败或癌症复发。针对于此,研究人员开发了一些耐药抑制剂,并将它们整合（包载或键合）进纳米系统用来克服或者规避肿瘤药物抗性。然而,大多数的抑制剂在体内是低效的并且伴随严重的内生毒性,此外,这些纳米系统或多或少均存在一定的缺陷,包括工艺复杂、重复性差、稳定性差、过早释放或低释放、低摄取效率等。更加重要的是,恶性肿瘤涉及众多的耐药机制（如外排转运体的过表达、解毒系统、酸性隔离、缺氧、炎性环境等）,单一途径的逆转剂起到的作用往往是有限的。因此,开发多效性的耐药逆转剂或合理设计新型的多功能纳米制剂用于改善肿瘤耐药逆转、提高癌症治疗指数已成为当前研究的重中之重。在本论文中,我们针对肿瘤的异质性设计了三种多功能的纳米前药制剂用于克服癌症治疗中的药物抗性,期望通过多重协同效应或多模式作用取得更佳的癌症治疗疗效。设计思路及主要的研究内容、结果如下:（1）苯硼酸靶向及pH敏感的普兰尼克前药胶束的制备及其体内药效评价设计苯硼酸修饰的pluronic（F127-PBA）及阿霉素前体修饰的pluronic前药（P123-CAD）,两种功能化的聚合物通过薄膜水化法制备成尺寸适宜的杂化前药胶束。体外实验表明这种胶束粒子在生理条件下相当稳定,而在低pH下,酸敏感的β-羧酸酰胺断裂加速DOX释放。细胞实验证明苯硼酸能够增加前药胶束的内化、P123可以触发多种生物学效应（线粒体去极化、下调ATP、上调ROS等）从而介导耐药逆转。体内实验揭示了该前药胶束能够高效地聚集在肿瘤部位,同时主动靶向能够介导更多的粒子进入肿瘤细胞;抗肿瘤评估证实前药胶束在体内呈现最高的肿瘤生长抑制效率;病理学分析则进一步表明前药粒子没有造成明显的机体损伤或体重下调,提示其良好的生物安全性。作为一个结果,这种纳米前药系统或许能比已经进入临床III期的SP1049C具有更好的抗肿瘤性能,有望进一步用于临床转化。（2）自产氧的纳米酶前药粒子用于克服缺氧介导的化疗-光动力治疗抗性通过酰胺缩合反应将乳糖酸和阿霉素前体修饰到过氧化氢酶上,得到两亲性的生物大分子,在水溶液中与光敏剂Ce6共自组装成多功能纳米粒子。体外评估表明这种纳米系统呈现酸触发的药物释放行为,同时亲水外层能有效避免CAT降解,维持较高的酶催化活性。细胞实验表明乳糖酸可以通过受体介导的胞吞提高细胞内化前药粒子,进入细胞的纳米酶能原位分解H2O2产氧,导致HIF-1α降解及P-gp下调,最终克服化疗耐药性。此外,氧气再生进一步促进ROS生成,极大地提高光动力介导的细胞杀伤效应。体内评估证明了这种纳米酶粒子能够有效的缓解瘤内乏氧,进而同时增敏化疗-光动力治疗,导致最高的抗肿瘤效率（>90%）甚至消融部分肿瘤。这些结果表明了通过氧气增敏的联合化疗-光动力治疗策略在对抗恶性肿瘤上是有效的,值得进一步优化或评估。（3）自组装三元杂化纳米前药粒子用于克服肿瘤耐药抗性及侵袭设计二硫键连接的阿霉素二聚体、塞来昔布二聚体以及两亲性修饰PEI,三者共组装成杂化的多功能纳米前药粒子。在pH 6.8条件下,粒子表面电荷呈现明显的相转变（由负到正）,同时展现出明显的质子缓冲能力。在DTT作用下,二硫键断裂,进而导致粒子逐渐崩解,两种药物快速释放。细胞实验证明粒子的电荷翻转效应能促进细胞摄取,PEI可以破除酸性隔离,而塞来昔布则能下调P-gp表达,这些效应增加了阿霉素的胞内滞留和药理活性。此外,该纳米系统还能显着地抑制肿瘤细胞迁移、侵袭,同时阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导更多的细胞凋亡。体内测试证明这种纳米前药靶向性强,能有效富集在肿瘤部位,进而提高药物生物利用度同时降低系统毒性。皮下抑瘤实验表明这种多效应前药能显着地抑制实体瘤生长（85%）,同时对根除肝、肺转移瘤也表现出突出的治疗效果。由此可知,针对癌症炎性环境的调控可以明显改善化疗疗效,这种多元杂化的设计或可用于临床上恶性肿瘤的协同治疗。
郭建丽[3]（2019）在《PFTα/大豆苷元协同拓扑替康对乳腺癌抑制作用及机理研究》文中提出拓扑替康（Topotecan,TPT）是一种半合成的水溶性喜树碱衍生物,它因价格便宜,抗癌效果明显而被广泛应用于实体瘤的二线治疗。TPT对肿瘤细胞选择性差,毒副作用强,同时,TPT的作用祀点是拓扑异构酶I（Topomerase I,Topo I）,靶点单一,易产生耐药性,这两个缺点严重限制了 TPT在临床上的应用范围。因此本研究的目的是通过联合用药的方式降低TPT用药剂量,减少其毒副作用;同时,提高肿瘤对TPT的药敏性,逆转其耐药性。本论文主要包括三部分内容:一是以TPT为主药,与p53抑制剂Pifithrin-α（PFTα）联合用药进行抗肿瘤作用研究;二是以TPT为主药,与大豆苷元（Daidzein,DAI）联合用药进行抗肿瘤作用研究;三是进行DAI逆转肿瘤对TPT耐药性的研究。研究结果和结论如下:（1）采用MTT方法检测TPT与PFTα联用对肿瘤细胞增殖的影响,结果表明:联合作用48 h时,PFTα显着增强了 TPT对MCF7、BGC823、HepG2增殖的抑制作用。采用DNA松弛实验、彗星实验检测了 TPT与PFTa联用对Topo I活性及DNA损伤的影响,结果表明:PFTα增强了 TPT对Topo I活性的抑制作用,导致DNA损伤增加。PI单染、AV/PI双染、qPCR以及流式细胞仪分析证明TPT与PFTα联合作用,导致肿瘤细胞周期阻滞在S期,并诱导更多的细胞发生凋亡;10 PFTα没有抑制MCF7细胞中p53和p21的表达,但抑制了 mdm2和磷酸化的p53的表达;联合用药组的p53、p21和Bax的表达显着增加,而mdm2的表达显着降低,但磷酸化p53的表达与TPT单药作用无明显差异。采用激光共聚焦的方法检测p53和TPT在细胞核内的积累,结果表明联合用药时,p53和TPT在细胞核内的积累均明显增加。这些结果说明PFTα一方面通过增加TPT在细胞内的积累量,来提高TPT对Topo I活性的抑制作用,从而诱导更多的DNA损伤;另一方面PFTα通过抑制mdm2的表达,减少p53的降解,增加了 p53在细胞核内的积累,从而导致细胞周期阻滞或细胞凋亡。（2）采用MTT方法筛选与TPT联合使用时对肿瘤细胞增殖具有协同抑制作用的药物,结果表明对MCF7细胞同时给药48 h时,DAI与TPT具有显着的协同作用。DNA松弛实验、彗星实验分析证明TPT与DAI联合使用时,DAI增强了 TPT对Topo I催化活性的抑制作用,诱导更多的DNA损伤。采用PI单染法、AV/PI双染和Western blot方法检测了 TPT与DAI联用对细胞周期和细胞凋亡的影响,结果表明,联合用药时,导致MCF7细胞周期阻滞在G2/M期,并通过激活线粒体凋亡通路诱导大量MCF7细胞发生凋亡。采用MCF7裸鼠异种移植模型进行TPT与DAI联用的体内药效评价,TPT和DAI的给药方式分别为腹腔注射和灌胃,结果表明给药15天时,组合药物组（TPT（3 mg/kg）+DAI（5 mg/kg））对肿瘤的抑制率为95.98±1.50%。与TPT单药作用相比,达到同等药效,组合药物组的TPT浓度可降低3倍。免疫组织化学分析进一步证明了TPT与DAI联用是通过上调肿瘤P21和p53表达,诱导细胞周期阻滞,通过调节Bax/Bcl2的比例促进细胞发生凋亡。（3）采用浓度梯度逐步提高的方法构建耐TPT的MCF7/ADR细胞模型,耐药指数为7.17。通过MTT方法分析TPT与DAI联用对MCF7/ADR细胞增殖的抑制作用,发现DAI能够逆转MCF7/ADR对TPT的耐药作用;采用qPCR方法检测相关基因的表达,结果表明:组合药物组中ERα和BCRP的表达明显降低,但P-gp的表达与TPT单药作用没有明显差别。采用激光共聚焦的方法检测MCF7/ADR细胞膜上BCRP的分布及TPT在细胞核内的积累量,结果表明DAI明显降低了 BCRP在细胞膜上的分布,增加了 TPT在细胞核内的积累量。这些结果说明DAI是通过降低ERα及BCRP的表达,减少BCRP在细胞膜上的分布,增加细胞内TPT的积累来逆转耐药细胞对TPT的耐药性的。利用MCF7/ADR裸鼠异种移植模型进行TPT与DAI联合使用的体内药效评价,TPT和DAI的给药方式分别为腹腔注射和灌胃,结果表明:给药15天时,联合用药组（TPT（1 mg/kg）+DAI（5 mg/kg））中肿瘤的抑制率为81.29±3.72%,与TPT单药作用相比,达到同等药效,组合药物组的TPT浓度可降低9倍;免疫组织化学分析证明TPT与DAI联合使用降低了实验动物肿瘤组织中的ERα及BCRP的表达,与体外细胞水平研究的结论一致。综上所述,本文发现了 PFTα与TPT之间具有协同作用,并且揭示了两种药物联合使用的作用机理。同时,发现DAI与TPT具有协同抗乳腺癌作用,并且DAI能够逆转耐药肿瘤对TPT的耐药作用,揭示了两药协同抗癌及DAI逆转耐药肿瘤对TPT耐药作用的机理,肿瘤动物模型评价证明DAI与TPT的联合使用具有显着的协同抗肿瘤作用及逆转耐药肿瘤对TPT耐药作用。
黄日镇[4]（2019）在《基于多靶点策略的松香二萜和五环三萜类衍生物的设计合成及抗肿瘤活性研究》文中研究说明肿瘤的转移和耐药是目前肿瘤临床治疗面临的两个巨大挑战,也是肿瘤患者死亡的主要原因。机制研究表明,核转录因子NF-κB信号传导与肿瘤发生和发展进程中基因过量表达相关,包括免疫应答、细胞存活、分化、增殖、侵袭和血管生成,NF-κB信号传导已成为抗肿瘤药物研发的热门靶标。基质金属蛋白酶（MMPs）是NF-κB的下游靶基因,已被证明与肿瘤的入侵和转移有着紧密联系。本论文在已取得的初步研究成果之上,选取具有良好抗肿瘤活性和多信号通路作用机制的脱氢松香酸二萜和熊果酸、积雪草酸等五环三萜类化合物进行结构优化,以研发靶向NF-κB/MMPs的新型、高效和特异性抗肿瘤药物。（1）合成了系列脱氢松香酸磺胺二肽衍生物（30个化合物）作为潜在的MMPs抑制剂,检测其对细胞迁移能力的影响。这些化合物对MMP具有相对良好的抑制活性,其中MMP-3的抑制活性优于MMP-8和MMP-9。分子对接研究揭示活性最好的化合物8k其磺酰胺部分和二肽基团与MMP-3活性位点中的关键氨基酸残基形成多个氢键,从而起到增强抑制MMP活性的作用。体外抗肿瘤活性筛选显示部分该类化合物展现出比临床抗癌药5-FU更好的抑制活性。特别是化合物8k对HepG2细胞显示出最佳的抑制活性,IC50=4.2±1.1μM。划痕实验证明化合物8k能抑制HepG2细胞的迁移并以剂量依赖性方式诱导Hep G2细胞凋亡。此外,细胞周期分析表明化合物8k阻滞HepG2细胞生长停滞于G1期。（2）合成了系列脱氢松香酸硫脲双磷酸酯衍生物（11个化合物）,并研究了目标化合物对SK-OV-3、BEL-7404、A549、HCT-116和NCI-H460等肿瘤细胞系的生长抑制活性。特别是,化合物6e（IC50=1.79±0.43 μM）对SK-OV-3细胞系表现出最佳的抗肿瘤活性。在该细胞系中通过annexinV-FITC/PI双染、诱导ROS产生,线粒体膜电位的去极化,激活caspase以及促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达研究其作为细胞凋亡诱导剂的作用。提高ROS的水平,激活caspase-3、caspase-8、caspase-9和Fas,增加Bax的表达,降低Bcl-2的表达,提升B ax/Bcl-2比率证明6e通过线粒体途径和死亡受体途径诱导细胞凋亡。此外,细胞周期分析表明,化合物6e引起细胞周期停滞在G1期。此外,分子对接研究表明6e可以与CDK2的ATP 口袋结合。（3）合成了系列侧链功能化的苯胺熊果酸衍生物（27个化合物）作为潜在的NF-κB抑制剂,并评价其NF-κB抑制活性及其抗肿瘤活性。体外活性测试表明目标化合物对NCI-H460细胞中TNF-α诱导的NF-κB表现出显着的抑制活性,IC50值在微摩尔浓度范围内。构效关系分析揭示侧链为小和强吸电子的基团时能增加NF-κB的失活,而且C-3位乙酰基对NF-κB抑制活性有一定的影响。分子对接研究进一步证明化合物5Y8的侧链二甲基丙胺与NF-κB形成氢键,说明C-28位小基团及强亲电子的功能化侧链是改善活性的重要因素。特别地,化合物5Y8对NCI-H460细胞表现出最优抗增殖活性（IC50=3.08±0.70 μM）,而且强于HCPT。此外,所选化合物可有效逆转耐阿霉素肿瘤细胞的多药耐药性,这至少部分地通过阻断NF-κB信号传导途径和诱导细胞凋亡实现。分子作用机制研究表明,代表性化合物5Y8可能通过阻断NF-κB信号通路而抑制NCI-H460细胞增殖并诱导细胞凋亡。同时,细胞周期分析表明化合物5Y8使NCI-H460细胞生长停滞在G1期。（4）合成了系列1,2,3-三唑积雪草酸衍生物（20个化合物）作为NF-κB抑制剂。通过基于细胞的荧光素酶法确定化合物6k对TNF-α诱导的NF-κB活化具有显着的抑制活性,IC50值在较低微摩尔范围内。分子对接研究揭示了 6k和NF-κB间的相互作用模式,其中1,2,3-三唑部分和积雪草酸骨架的羟基与NF-κB的关键氨基酸残基通过多个氢键形成网络结构。表面等离子共振分析验证了化合物6k与NF-κB蛋白间具有较强结合亲和力,平衡解离常数值为0.36μM。深入的作用机制研究表明,化合物6k显着抑制NF-κB/DNA的结合,NF-κB的核转移和IκBα的磷酸化。体外抗肿瘤活性筛选表明化合物6k对A549细胞显示出最优的活性（IC50=2.67±0.06 μM）,但弱于DOX的抑制活性。通过流式细胞术和AO/EB染色实验证实化合物6k能诱导A549细胞凋亡。此外,transwell迁移试验表明化合物6k阻断NF-κB信号通路从而抑制体外细胞迁移。本文合成了四个系列共88个化合物,机制研究表明代表性化合物能通过靶向NF-κB或MMPs而抑制肿瘤细胞迁移、逆转肿瘤耐药,这为进一步开发高效的抗肿瘤松香二萜和五环三萜类衍生物提供一定的研究基础。
陈丹妮[5]（2019）在《MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义》文中提出化疗是乳腺癌全身治疗的基石,但化疗耐药的产生严重制约了治疗效果。化疗耐药的分子机制复杂,尚未完全阐明,其逆转剂的开发更是进展缓慢。已有研究表明,microRNAs（miRNA）可在转录后水平调节下游靶基因的表达,在乳腺癌化疗耐药中发挥着重要调控作用。肿瘤基因图谱（TCGA）是目前最大的癌症基因信息数据库,我们利用TCGA数据库,比对了大量乳腺癌组织与正常乳腺组织的miRNA表达谱。另外针对接受紫杉醇类药物治疗的患者,根据其化疗效果分出耐药组和敏感组,比对两组患者的乳癌组织中miRNA表达谱。从上述两部分比对结果中筛选出差异显着的miRNA,建立文库。髓样乳腺癌是三阴性乳腺癌中的一种特殊组织类型,以化疗为主要治疗手段。目前对髓样乳腺癌化疗耐药的研究甚少。我们以髓样乳腺癌多药耐药细胞Bads-200对紫杉醇的耐药性变化为主要研究目标,通过高通量实验从miRNA文库中筛选出可有效调控细胞耐药性的miRNA分子:miR-27b-3p。临床样本检测结果显示miR-27b在乳癌组织中显着下调,尤其是在紫杉醇耐药的乳癌组织中。统计分析发现,miR-27b在乳癌组织中低表达与疾病进展、不良预后密切相关。另外,miR-27b表达量与细胞对紫杉醇的耐药性呈显着负相关。体外实验表明,miR-27b可显着抑制髓样乳腺癌细胞的增殖及对紫杉醇等多种化疗药物的耐药性,这种抑制作用在其他乳腺癌细胞中同样有效。体内实验表明,miR-27b可显着增强紫杉醇对耐药细胞生长的抑制作用,降低肿瘤对紫杉醇的抵抗性。我们利用生物信息学技术预测了 miR-27b下游靶基因,并通过KEGG和GO分析筛选出与肿瘤发生、药物反应等重要信号通路相关的靶基因。经过双荧光素酶报告基因实验验证CBLB、GRB2是miR-27b的直接靶标。进一步的实验证实miR-27b可通过抑制CBLB、GRB2的表达,一方面下调Akt、Erk通路中重要蛋白的表达,抑制细胞增殖;另一方面抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达,促进细胞凋亡;这两方面的共同作用降低髓样乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性。综上所述,本课题筛得的乳腺癌耐药相关miR-27b可作为判断乳腺癌患者预后及疾病进展的风险预测因子;可通过下调CBLB、GRB2的表达,显着抑制乳腺癌的生长及耐药。这些研究结果将有助于加深我们对乳腺癌化疗耐药机制的理解,可为乳腺癌治疗提供潜在靶点,为化疗耐药逆转剂的开发提供新思路。
马乾章[6]（2018）在《小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究》文中认为目的:近年来,新兴的化学生物学学科发展非常迅猛。该学科利用现有的数量庞大而且化学结构多样的小分子化合物库,针对研究者所需要的化合物的生物活性进行筛选,并以此为依据进行相关的作用机制研究。本研究所选药物为小白菊内酯和大黄素,二者是从天然植物中提取的小分子化合物。其生物活性均具有明显的抗癌作用,尤其是肠腺癌,近年来的研究逐渐增多。因此,延续我们前期对小白菊内酯和大黄素抗肠腺癌生物活性的研究,本课题采用体外实验的方式,对小白菊内酯诱导HCT-8/VCR细胞凋亡和耐药逆转作用机制靶点,以及大黄素诱导CACO-2细胞凋亡和调控PI3K/AKT信号通路的作用机制靶点进行了相关研究。通过对小白菊内酯和大黄素抗癌活性及作用机制的研究,为天然植物药物来源的小分子化合物抗癌作用提供基础,为天然植物药物用于临床肿瘤的治疗开拓市场。后续,我们将针对前期的研究成果,对两种小分子化合物的生物活性与其结构的相关性进行分析,对于不理想的结构进行修饰,为新的抗癌小分子药物的研发做出贡献。研究方法:一、小白菊内酯诱导HCT-8/VCR细胞凋亡和耐药逆转作用研究1、MTT法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用培养结肠癌细胞株HCT-8、HCT-8/VCR细胞株,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL,对照组则加等量不含药物的培养液,处理12、24、48小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率。2、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。消化收集对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8、HCT-8/VCR细胞,AnnexinV/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。3、吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。取对数生长期HCT-8、HCT-8/VCR细胞,每孔1×104个/ml、2ml接种于6孔板中,孔内放入盖玻片。设小白菊内酯浓度5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、及对照组共4组,每组3个复孔,每组给药24h后,取出盖玻片,固定、AO/EB染色、、封片,荧光显微镜观察,每组分别计数,每次计数细胞300个,计算凋亡率。4、Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2、蛋白表达的影响。收集对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8、HCT-8/VCR细胞蛋白,用western blot方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。5、MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用（1）取对数生长期HCT-8、HCT-8/VCR细胞,加入96孔板,分别加入不同浓度的VCR,处理24小时后,MTT法检测HCT-8、HCT-8/VCR细胞VCR的半数抑制浓度,及HCT-8/VCR对VCR的耐药指数。（2）取对数生长期HCT-8/VCR细胞,加入96孔板,分别设对照组、PTL5μmol/L、VCR（0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml）、PTL5μmol/L+VCR各浓度组,处理24小时后,MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。6、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。消化收集对照组、PTL5μmol/L、VCR2μg/ml、PTL5μmol/L+VCR2μg/ml处理24h的HCT-8/VCR细胞,AnnexinV/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。7、Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响。收集HCT-8对照组、HCT-8/VCR对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8/VCR细胞蛋白,用western blot方法检测P-gp、MRP、GST-π蛋白的表达。二、大黄素诱导CACO-2细胞凋亡及对PI3K/AKT信号通路的调控作用研究1、MTT法检测大黄素对CACO-2细胞增殖抑制的影响对数生长期的CACO-2细胞,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL,对照组则加等量不含药物的培养液,处理24小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率。2、流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响。消化收集对数生长期的CACO-2细胞,以大黄素处理CACO-2细胞24h,终浓度分别为0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L,然后以AnnexinV/FITC染色,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。3、DAPI染色检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响取对数生长期CACO-2细胞,每孔1×104个/ml、2ml接种于6孔板中,孔内放入盖玻片。设大黄素浓度15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L、及对照组共4组,每组3个复孔,,每组给药24h后,取出盖玻片,固定、DAPI染色、碳酸盐缓冲甘油封片,荧光显微镜观察,激发波长为359 nm。观察细胞凋亡情况。4、流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞周期的影响取对数生长期的CACO-2细胞,用RPMI-1640完全培养基制成2×104个/m1的单细胞悬液,接种于6孔培养板中,每孔2ml,37℃培养12小时,更换培养液,加入药物。大黄素物终浓度分别为0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L;对照组为加入完全培养基组,空白对照为只加入完全培养基,置培养箱中培养24h后,用胰酶消化细胞,调整细胞浓度为1x106个/ml,取0.25ml细胞,PBS清洗,1000rpm,4℃离心5分钟,弃上清（重复两次）;将细胞重悬于0.25ml结合缓冲液中,取0.1ml细胞悬液置于5ml流式管中,加入PI 20ul至终浓度50ug/ml,锡箔纸包住,避光4度染色30min,24h内上机检测。用流式细胞仪进行细胞周期检测,重复实验3次。5、Western-blot法检测大黄素对CACO-2细胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响收集对照组、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L大黄素处理24h的CACO-2细胞蛋白,用western blot方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:1、PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用小白菊内酯对结肠癌HCT-8、HCT-8/VCR细胞株有增殖抑制作用,并呈浓度及时间依赖关系,PTL12h半数抑制浓度IC50分别为20.21±2.63μmol/L,21.52±3.25μmol/L。PTL24h半数抑制浓度IC50分别为15.46±1.22μmol/L,17.05±2.78μmol/L。PTL48h半数抑制浓度IC50分别为11.44±1.65μmol/L,10.85±2.02μmol/L。2、PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。对照组HCT-8细胞凋亡率4.23%±0.75%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为8.23%±1.45%,22.46%±2.75%,38.16%±3.25%。对照组HCT-8/VCR细胞凋亡率4.42%±1.16%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为8.43%±0.95%,21.67%±3.53%,39.16%±3.51%。上述结果表明PTL以浓度依赖方式诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。3、荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响荧光染色结果显示,PTL以浓度依赖方式诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。对照组HCT-8细胞凋亡细胞比率为10.33%±2.05%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为20.55%±3.55%,32.46%±3.76%,46.8%±4.28%。对照组HCT-8/VCR细胞凋亡细胞比率9.42%±1.25%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为18.66%±2.15%,30.65%±2.87%,45.44%±3.81%。4、Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。对照组HCT-8、HCT-8/VCR细胞可见Bax低表达,与对照组比较,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组Bax表达显着增加（p<0.05）。对照组HCT-8、HCT-8/VCR细胞可见Bcl-2高表达,与对照组比较,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组Bax表达显着减少（p<0.05）。上述结果表明,PTL通过以浓度依赖方式增加HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax的表达,降低Bcl-2的表达,诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。5、MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用（1）VCR对结肠癌HCT-8、HCT-8/VCR细胞株有增殖抑制作用（p<0.05）,并呈浓度依赖关系（p<0.05）,VCR半数抑制浓度IC50分别为2.21±0.24μg/ml、38.9±3.04μg/ml,HCT-8/VCR对VCR的耐药指数为17.6倍。（2）VCR0.25、0.5、1、2、4μg/ml对HCT-8/VCR细胞无显着增殖抑制作用（p>0.05）,VCR 6、10μg/ml对HCT-8/VCR细胞有轻度增殖抑制作用（p<0.05）,PTL5μmol/L与VCR（0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml）联用可显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用（p<0.05）。联用后VCR IC50为3.01±0.45μg/ml,与VCR单独应用时比较,IC50显着降低（p<0.05）,PTL可显着降低HCT-8/VCR对VCR的耐药指数（p<0.05）。上诉结果说明,PTL可显着增加显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用,逆转HCT-8/VCR的耐药。6、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡结果显示,对照组细胞凋亡率5.01%±0.47%,经VCR2μg/ml处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率为6.93%±1.45%,与对照组比较,无显着差异（p>0.05）,经PTL5μmol/L处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率为10.02%±0.86%,与对照组比较,凋亡率显着增加（p<0.05）,PTL5μmol/L+VCR2μg/ml处理24h的HCT-8/VCR细胞凋亡率为34.7%±2.33%,与VCR2μg/ml组及PTL5μmol/L组比较,凋亡率均显着性增加（p<0.05）。结果表明,PTL可显着增加VCR诱导HCT-8/VCR细胞凋亡能力,逆转HCT-8/VCR细胞对VCR的耐药。7、Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响。western blot方法检测结果显示,HCT-8对照组可见P-gp、MRP、GST-π蛋白的低表达;与HCT-8对照组比较,HCT-8/VCR对照组P-gp、MRP、GST-π蛋白表达显着增加（p<0.05）;与HCT-8对照组比较,HCT-8/VCR对照组PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理HCT-8/VCR细胞24h后,P-gp、MRP、GST-π蛋白表达显着减少（p<0.05）,且PTL浓度越大蛋白表达越低。8、随着大黄素浓度的逐渐提高,CACO-2细胞生存率逐渐降低,至200μmol/L,细胞生存率几乎接近0。而大黄素对CACO-2细胞培养24h的IC 50值为30μmol/L。9、随着大黄素浓度的逐渐升高,CACO-2细胞凋亡率也随之升高,从对照组的1.85%,升至60μmol/L大黄素组的42.66%。大黄素对CACO-2细胞诱导凋亡的作用呈剂量依赖趋势。10、30μmol/L和60μmol/L的大黄素干预后,细胞核明显浓缩,染色加深,偶见核染色质呈新月形聚集于核膜一边。尤其是60μmol/L的大黄素干预后,凋亡细胞核碎裂成大小不等的圆形小体,并被细胞膜所包绕,疑似凋亡小体。11、对照组细胞大部分处于G0/G1期,为62.3%,处于S期33.7%,处于G2/M期4.0%;大黄素干预后,细胞周期在G2/M期明显发生停滞,该期细胞数显着增多。并且随着大黄素浓度的提高,停滞于G2/M期的细胞也逐渐增多。以60μmol/L的大黄素组G2/M细胞周期阻滞最为明显。12、对照组细胞Bax呈低水平表达,而随着大黄素浓度的增高,表达水平逐渐上调;Bcl-2表达水平与Bax正好相反,对照组细胞Bcl-2、p-PI3K和p-AKT呈高水平表达,随着大黄素浓度的增高,表达水平逐渐下调。而非磷酸化PI3K、AKT表达水平各组间无明显差异。结论:1、小白菊内酯对HCT-8、HCT-8/VCR细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用,小白菊内酯对结肠癌细胞增殖抑制及诱导凋亡作用不受HCT-8/VCR细胞耐药性的影响,小白菊内酯可通过增加Bax的表达,降低Bcl-2的表达来诱导结肠癌细胞凋亡。2、小白菊内酯可显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制能力及凋亡诱导能力,小白菊内酯对HCT-8/VCR细胞具有耐药逆转作用。其机制主要是通过PTL降低HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白的表达,逆转HCT-8/VCR细胞的耐药性。3、大黄素对CACO-2结肠癌细胞的生长具有明显的抑制作用。其抗癌作用主要是由于诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,它还能抑制CACO-2细胞的PI3/AKT信号级联,提示大黄素在结肠癌治疗中的潜在应用。
张坤[7]（2018）在《浙贝黄芩汤通过调控Wip1对白血病模型化疗效果的影响》文中进行了进一步梳理目的对小鼠急性髓系白血病模型进行干预,明晰浙贝黄芩汤通过调控Wip1对髓系白血病化疗效果的影响。方法1.探索白血病病情进展与Wip1、野生型p53表达的相关性。采集复发/难治急性髓系白血病患者、初诊/敏感急性髓系白血病患者、健康成年人3-5ml外周血,提取中性粒细胞、单个核细胞的总RNA,应用定时定量PCR检测Wip1、野生型p53表达量,检测急性髓系白血病患者p53热点突变情况。2.尾静脉接种构建急性髓系白血病小鼠模型。应用4-5周龄雌性SCID beige小鼠,2GyX射线预处理后,经尾静脉接种不同浓度的HL60、HL60/ADR细胞悬液。通过观察一般情况,照射前、造模第10、18、28天全血细胞分析、外周血白细胞分类、外周血CD33阳性细胞比例、骨髓形态学检查和组织切片病理检查鉴定模型。3.浙贝黄芩汤联合阿霉素体内干预白血病动物模型,对比化疗敏感株与耐药株的疗效差异,明晰Wip1、P53的表达与疗效的相关性。将上述课题组构建HL60白血病模型,随机分为4组:模型组、浙贝黄芩汤灌胃（中药）组、阿霉素腹腔注射（化疗）组、浙贝黄芩汤灌胃+阿霉素腹腔注射（中药+化疗）组。模型组灌胃等量蒸馏水;中药组灌胃浙贝黄芩汤（7.58g/d/kg）每天一次,化疗组腹腔注射盐酸阿柔比星（1mg/kg）隔日一次,中药+化疗组应用浙贝黄芩汤联合盐酸多柔比星进行干预,周期14天。HL60/ADR白血病模型分组及给药处理方式均同上。实验过程中观察小鼠生存状态,于给药第15天或濒死前处死动物,取材进行各项指标检查,对比HL60白血病模型及HL60/ADR白血病模型各项指标及疗效的差异,包括全血细胞分析、外周血CD33阳性细胞比例、骨髓白血病细胞比值、脾脏重量、组织切片病理检查、Wip1及P53的表达情况,评价浙贝黄芩汤调控Wip1对化疗敏感性的影响。结果1.白血病病情进展者,Wip1表达升高,野生型p53表达降低。白血病发病不同阶段Wip1的表达情况。共采集25例复发/难治性急性髓系白血病患者（复发/难治组）外周血、10例初诊或化疗敏感的急性髓系白血病患者（初诊/缓解组）、7例健康成年人（正常对照组）,检测结果如下（正态分布以均值±标准差表示,非正态分布以中位数（四分位间距）表示）:①Wip1mRNA:正常对照组、初诊/缓解组、复发/难治组中性粒细胞 Wip1mRNA 相对β-actin 的表达量分别为 0.0021（0.0016,0.0116）、0.0109（0.0050,0.0207）、0.0092（0.0037,0.0278）,单个核细胞 Wip1mRNA 相对 β-actin 的表达量分别为 0.0024±0.0011、0.0080±0.0063、0.0042（0.0024,0.0100）;复发/难治急性髓系白血病患者Wip1表达升高。②野生型p53mRNA:正常对照组、初诊/缓解组、复发/难治组单个核细胞p53mRNA相对β-actin的表达量分别为0.0056（0.0022,0.0063）、0.0060（0.0041,0.0359）、0.0018（0.0008,0.0045）;复发/难治急性髓系白血病患者野生型p53mRNA表达下降。③检测了 8例急性髓系白血病患者p53热点突变,突变率为25%,分别位于6、7外显子,p53突变患者预后差。2.尾静脉接种成功构建急性髓系白血病小鼠模型。各模型组于接种细胞7-10天,出现竖毛、萎靡少动、脊背弓起、步态不稳、偏侧或转圈,接种HL60、HL60/ADR细胞悬液高浓度（1×107个/只）发病进展更快,通过比较全血细胞分析、外周血CD33阳性细胞比例、组织病理检查鉴定动物模型,而骨髓形态学检查因随实验进程,小鼠疾病进入终末期,极度消瘦,生存状态极差,处死取材时未能吹出骨髓细胞,未能得到有效制片获得实验数据。根据其余相关检测结果显示:接种浓度为1×107个/只的HL60、HL60/ADR两模型组白血病浸润更明显,可满足下一步实验需求。3.浙贝黄芩汤可减轻白血病模型肿瘤负荷、增强化疗敏感性、部分逆转耐药,与降低Wip1的表达有关。HL60、HL60/ADR模型均分为模型组、中药组、化疗组、中药+化疗组,每组6只。①生存期（天）:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为17.83±6.88、20.00±6.23、22.00±4.43、23.00±2.00;HL60/ADR 模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为20.83±5.00、21.33±4.55、23.17±2.04、24.00±0.00,单用浙贝黄芩汤即可延长生存期,中药联合化疗生存期最长。②给药第15天小鼠体重（g）:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:9.80±2.60、10.24± 1.59、11.03±1.31、11.62±1.96;HL60/ADR 模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为 1 0.94±0.92、11.67±2.03、13.52±1.65、15.56±0.87,仅HL60/ADR中药+化疗组的体重较造模时（13.16±1.04g）增加,其余组均较造模前下降,说明耐药白血病模型应用化疗时联合中药可改善恶病质状态。③给药第15天外周血白细胞计数（×109/L）:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为3.36±1.08、1.39±0.39、0.45±0.24、0.45±0.23,化疗、中药+化疗组较其余两组明显下降。HL60/ADR模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为0.96±0.40、1.24± 1.04、0.66±0.44、0.81±0.72,差异无统计学意义。④给药第15天外周血CD33阳性细胞比例（%）:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:55.21±7.29、39.24±2.94、31.49±2.36、25.52±0.81。浙贝黄芩汤具有减轻白血病负荷、化疗增敏的作用。HL60/ADR模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:77.42±0.73、75.65±0.18、72.74±1.18、67.03±3.83,耐药株 HL60/ADR 各实验组化疗耐药,浙贝黄芩汤联合化疗可部分逆转耐药。⑤脾脏重量（g）:脾脏为髓外白血病细胞增殖浸润的主要场所,通过观察脾脏的重量可反映体内白血病负荷。HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组:0.1637±0.0359、0.1132±0.0075、0.0662±0.0152、0.0854±0.0008,HL60/ADR模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:0.1768±0.0226、0.1765±0.0191、0.0828±0.0074、0.0968±0.0052,耐药株各组脾脏重量明显高于敏感株,中药联合化疗可减轻白血病模型脾脏肿瘤负荷。⑥脾脏病理切片HE染色:HL60模型组小鼠脾脏镜下可见,脾脏正常组织结构被完全破坏,弥漫性白血病细胞浸润灶,中药联合化疗能明显减少白血病细胞浸润;HL60/ADR模型组脾脏正常结构亦完全破坏,镜下白血病细胞弥漫浸润,且耐药株各组小鼠脾脏浸润灶均明显多于敏感株相应组别。⑦Wip1mRNA相对表达量:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:1.3733±0.4347、0.4525±0.2298、0.4700±0.3220、0.1825±0.1410;HL60/ADR模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:0.8166±0.6886、0.7193±0.3412、0.1061±0.1074、0.1011 ±0.0976。随着白血病病情的控制,Wip1表达量减低,中药联合化疗可进一步下调Wip1表达。结论浙贝黄芩汤可通过下调Wip1减轻白血病负荷、增强化疗敏感性、部分逆转白血病耐药,白血病病情进展与Wip1表达升高相关。
刘晶晶[8]（2016）在《miR-205靶向VEGFA与FGF2调控乳腺癌化疗耐药性》文中提出背景:乳腺癌的多药耐药性（Multidrug Resistance,MDR）是导致化疗失败及复发的最主要原因。肿瘤细胞可随诱导药物、诱导方式、细胞分化阶段及所处微环境的不同而表现出不同的耐药表型。MDR是指肿瘤对一种化疗药物出现耐药的同时对其他结构和功能各异的药物亦产生交叉耐药现象。难以避免的化疗耐药一直是有效控制乳腺癌的关键瓶颈。因此深入的研究乳腺癌的耐药机制,寻找新的耐药相关生物学标志物对于有效逆转化疗耐药,提高乳腺癌的整体治疗水平具有非常重要的理论意义,并且为其临床应用开展提供前期基础。micro RNA（mi RNA）是由长1824个核苷酸组成的、内源性高度保守的非编码单链RNA,mi RNA发挥作用的机制是通过与靶基因的m RNA结合进而降解或者抑制其翻译,不同的mi RNA可以靶向调控同一靶基因,而一个mi RNA在不同情况下可以调控下游不同的靶基因,其基因表达调控方式为我们更加全面地了解肿瘤的发生发展,包括肿瘤细胞的MDR均开拓了更多的思路,对进一步认识和理解肿瘤耐药发生的潜在的分子机制均具有重要意义。在本文的工作中,我们主要对乳腺癌多药耐药相关mi RNA:mi R-205在乳腺癌耐药过程中发挥的功能,明确与mi R-205直接结合并受其调控的靶基因,及是否通过该靶基因影响乳腺癌的耐药及相关分子机制进行了研究与探讨。方法:1.使用mi RNA芯片对敏感株乳腺癌细胞MCF-7与耐药株乳腺癌细胞MCF-7/A02中的人源mi RNA表达谱进行检测,筛选出在两种细胞系中表达差异最显着的mi RNA:mi R-205作为后续实验研究的对象。2.用Taqman实时定量PCR的方法在不同乳腺癌细胞及对应耐药细胞株中验证mi R-205表达与肿瘤细胞耐药的相关性,并在其他耐药细胞系进一步验证。并且检测新辅助化疗前乳腺癌组织中mi R-205表达的情况,了解mi R-205的表达与乳腺癌新辅助化疗敏感性的关系。3.在MCF-7/A02细胞和CALDOX细胞中用慢病毒感染方式过表达mi R-205,以MTT方法检测细胞对阿霉素（DOX）、紫杉醇（Taxol）、依托泊苷（VP-16）的IC50,检测其耐药性的变化;采用平板克隆形成实验方法,评价肿瘤细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性;通过Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测紫杉醇对目标细胞的凋亡诱导作用,同时使用实时定量PCR法检测凋亡相关基因的m RNA水平改变,采用Western-blotting检测了PI3K/AKT信号转导通路活性及相关凋亡蛋白的改变。4.综合生物信息学预测软件得到mi R-205的候选基因VEGFA和FGF2。实时定量PCR方法检测FGF2与VEGFA在MCF-7 VS MCF-7/A02细胞和CAL51VS CALDOX细胞系中的表达差异,同时ELISA法检测四组细胞上清液中VEGFA和FGF2两种因子的变化情况。进一步检测MCF-7/A02和CALDOX两组耐药细胞系转染mi R-205后,细胞VEGFA和FGF2基因的变化及上清液中两种因子的变达改变,分析比较各细胞系中mi R-205表达、VEGFA和FGF2基础表达水平的相关性。双荧光素酶报告实验验证mi R-205和VEGFA 3’UTR和FGF23’UTR的靶向关系。5.检测新辅助化疗前乳腺癌组织中VEGFA和FGF2表达情况,分析其表达水平与乳腺癌新辅助化疗敏感性及mi R-205的相关性。以MTT方法检测过表达VEGFA和FGF2和沉默两者后细胞对阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,检测其药物敏感性的变化;并进一步检测VEGFA和FGF2对细胞凋亡的影响。6.采用rescue实验检测VEGFA和FGF2的过表达是否可以逆转mi R-205对乳腺癌化疗耐药性抑制,以确认VEGFA和FGF2作为mi R-205下游功能性的直接靶点调控乳腺癌化疗耐药性:以MTT方法检测处理后各组细胞对阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,检测其耐药性的变化;采用平板克隆形成实验方法,评价各组细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性;通过Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测紫杉醇对各组细胞的凋亡诱导作用,同时检测凋亡相关蛋白及PI3K/AKT信号通路蛋白的变化,以确认mi R-205与VEGFA和FGF2的相互作用对下游通路的影响。7.采用上述方法检测在MCF-7/A02和CALDOX耐药细胞系应用PI3K抑制剂后对凋亡的影响,以进一步证明mi R-205对MCF-7/A02与CALDOX细胞化疗敏感性的调控作用是通过影响PI3K/AKT通路活性完成的。8.建立裸鼠皮下移植瘤模型。将BALB/c裸鼠随机分为四组,将MCF-7/A02-mi R-205、MCF-7/A02-NC、CALDOX-mi R-205和CALDOX-NC细胞的细胞悬液分别接种于各组裸鼠右腋皮下,约1周后,开始每隔3天清晨用游标卡尺测量小鼠移植瘤最长径L和最短径W,计算肿瘤体积并做好记录。于d15最后一次测量肿瘤体积后,给药DOX（1mg/kg）Taxol（2.5mg/kg）每三天1次腹腔注射。开始每隔3天测量小鼠移植瘤,计算肿瘤体积,于d45最后一次测量肿瘤体积,统一颈椎脱臼处死,剥离瘤块,称重,液氮保存备用。分别取各组瘤组织,实时定量PCR检测MCF-7/A02-mi R-205及空白对照细胞移植瘤体中mi R-205的表达及VEGFA、FGF2、bax和survivin的表达变化情况。ELISA法检测动物模型血液中VEGFA和FGF2的表达变化。结果:1.对比MCF-7细胞与MCF-7/A02细胞中mi RNA芯片表达谱结果,在这两种细胞内共获得19个差异表达的mi RNA,结合本课题组前期血清学mi RNA检测结果,选定在耐药细胞系中为下调表达的mi R-205为进一步的研究对象。2.采用q PCR方法对芯片结果进行验证后发现在乳腺癌MCF-7细胞、Cal51细胞、MTMEC细胞及其对应耐药细胞系中,mi R-205在耐药细胞中低表达,同时在白血病K562细胞、HL60细胞、淋巴瘤BJAB细胞及对应耐药细胞中mi R-205表达量与耐药性呈负相关性。mi R-205表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效正相关,即mi R-205表达越高疗效越好。3.在乳腺癌耐药细胞MCF-7/A02和CALDOX细胞中过表达mi R-205后肿瘤细胞对阿霉素的敏感性提高,同时对紫杉醇、依托泊苷的化疗敏感性均有所提高;平板克隆形成实验检测发现,相同化疗药物浓度下,mi R-205过表达能抑制MCF-7/A02和CALDOX细胞的克隆形成能力;对于由紫杉醇诱导的细胞凋亡检测实验,过表达mi R-205后乳腺癌细胞凋亡程度显着提高;过表达mi R-205后,各组细胞凋亡基因Bax m RNA表达增加,抗凋亡基因survivin m RNA表达下降;在蛋白水平的检测中,p AKT表达下降,促凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白survivin表达下降。4.生物信息学软件预测显示VEGFA和FGF2 m RNA 3’UTR和mi R-205有两处可以结合的保守序列。VEGFA和FGF2在两种耐药细胞系中表达均高于在对照细胞中的表达,在细胞上清液中的两种因子的表达也明显升高。且在mi R-205过表达的乳腺癌细胞系中,mi R-205不仅可以在m RNA水平并且也可以在细胞因子水平抑制VEGFA和FGF2的表达。双荧光素酶报告实验中,mi R-205可以降低构建的VEGFA 3’UTR和FGF2 3’UTR野生载体的荧光活性。5.分析新辅助化疗前患者乳腺癌组织中mi R-205和VEGFA和FGF2表达,发现三者呈负相关,并且mi R-205含量越高,患者新辅助化疗疗效越好,而高表达VEGFA和FGF2的患者其新辅助化疗疗效较差。在MCF-7和CAL 51细胞中加入VEGFA和FGF2因子后,直接导致细胞对阿霉素的耐药,凋亡减少,Bax的m RNA和蛋白表达均下降,而survivin m RNA和蛋白表达增多,激活PI3K/AKT通路;而外源转入VEGFAsi RNA和FGF2 si RNA的CALDOX细胞,对阿霉素的敏感性提高。6.Rescue实验结果显示,在mi R-205稳定转染细胞中转入VEGFA和FGF2后,降低耐药细胞的化疗敏感性,凋亡减少。VEGFA和FGF2过表达后,逆转mi R-205促进紫杉醇诱导的细胞凋亡,并且可减弱mi R-205对PI3K/AKT通路的削弱作用。Bax的m RNA和蛋白表达均下降,而survivin m RNA和蛋白表达增多。7.MCF-7/A02细胞给予10μM,CALDOX细胞给予2μM PI3K抑制剂LY294002处理24小时,同时添加不同浓度的紫杉醇（0.25μM VS 2.5 n M）处理48小时后,Bax的m RNA和蛋白表达均增加,而survivin m RNA和蛋白表达减少。也间接提示mi R-205是通过抑制PI3K/AKT通路活性来诱导凋亡而增加乳腺癌细胞化疗敏感性的。8.通过裸鼠皮下移植瘤模型证明过表达mi R-205能显着抑制MCF-7/A02接种后小鼠肿瘤体积的生长,同时能够提高裸鼠接受紫杉联合蒽环类化疗的敏感性。肿瘤组织中VEGFA、FGF2和survivin表达减少,bax表达增多。小鼠外周血清中VEGFA和FGF2两种因子表达下降。而CALDOX-mi R-205细胞接种后的小鼠未见明显成瘤。结论:mi R-205在乳腺癌细胞及其他多种肿瘤细胞中与多药耐药性呈负相关。mi R-205表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效正相关,其表达越高疗效越好。在乳腺癌细胞中过表达mi R-205后,肿瘤细胞对阿霉素的敏感性提高,同时对紫杉醇、依托泊苷的化疗敏感性均有所提高;并能促进紫杉醇诱导的细胞凋亡。并且mi R-205是直接通过靶向VEGFA和FGF2实现削弱PI3K/AKT通路活性,减少p AKT表达,增加促凋亡蛋白Bax,减少抗凋亡蛋白survivin表达进而实现其促进凋亡影响乳腺癌细胞多药耐药的功能。过表达mi R-205能明显抑制裸鼠移植瘤的生长,并且可以通过抑制VEGFA和FGF2提高肿瘤的化疗敏感性。以mi R-205为治疗靶点逆转乳腺癌的耐药,将为乳腺癌的治疗带来新的探索。
张洪[9]（2014）在《埃博霉素衍生物抗肿瘤作用的研究》文中研究表明埃博霉素（epothilones）是由土壤粘细菌合成的大环内酯类化合,具有很强的抗肿瘤活性。虽与临床主流抗癌药紫杉醇（taxanes）具有相似的作用机制,但在疗效、副作用和安全性等方面均优于紫杉醇,尤其是对紫杉醇耐药的肿瘤仍有很好的治疗效果。因此,埃博霉素类化合物成为新型抗肿瘤药物的开发热点。我们的前期工作利用同源重组的方法对甲基转移基团进行缺失突变,得到单甲基埃博霉素衍生物UTD2,研究表明UTD2表现出很好的抗肿瘤活性。虽然已有报道表明埃博霉素类化合物可以通过稳定微管来诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是埃博霉素类化合物对Rho家族小GTP酶（Rho GTPases）相关通路的影响目前尚未见报道,并且从作用于微管蛋白到诱导细胞凋亡之间的分子机制仍有待阐明,同时埃博霉素类化合物不产生耐药性的机制迄今为止几乎毫无了解。本论文通过研究埃博霉素衍生物UTD2对肌动蛋白细胞骨架关键调节因子RhoGTPases及相关信号通路的影响,进一步阐明埃博霉素类化合物的抗肿瘤分子机制。具体研究结果及结论如下：1.采用MTT检测UTD2和Ixabepilone对乳腺癌细胞增殖的影响,结果显示：UTD2显着抑制乳腺癌细胞增殖,其抑制乳腺癌细胞生长的IC50值显着低于Ixabepilone,说明UTD2具有更好的抗肿瘤活性；微管聚合实验证明UTD2与Ixabepilone同样具有很强的促进微管蛋白聚合的能力；IC50浓度下,UTD2可以阻滞乳腺癌细胞周期于G2/M期；20nmol/L UTD2诱导MCF-7细胞早期凋亡和晚期凋亡的比率分别为19%和29%；进一步通过Western blot检测UTD2对凋亡相关蛋白表达的影响,结果显示：UTD2可以显着抑制Bcl-2的表达,同时增加Bax表达量,激活caspase-8。以上结果表明,UTD2通过稳定微管蛋白,阻滞肿瘤细胞于G2/M期,调控Bcl-2家族,激活caspase级联通路,诱导MCF-7细胞凋亡。2.通过免疫细胞化学方法检测UTD2对MCF-7细胞骨架重组的影响,结果显示：UTD2可以促进微管蛋白的聚合,改变微管蛋白的形态和分布,进而影响微管细胞骨架的重组；MCF-7细胞经UTD2处理后,片状伪足消失,肌动蛋白丝也呈现较为混乱的分布,表明UTD2同样影响肌动蛋白细胞骨架的重组。Trans well实验结果表明UTD2可以抑制MCF-7细胞迁移和侵袭。明胶酶谱实验结果表明,UTD2对基质金属蛋白酶MMP2活性有较明显的抑制作用。以上结果说明,UTD2通过影响细胞骨架重组,进而影响细胞骨架的相关功能,如肿瘤细胞迁移、侵袭和基质金属蛋白酶活性等。3.利用MTT法检测UTD2对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的抑制,Trans well法检测HUVEC的运动能力,明胶酶谱分析UTD2对基质金属蛋白酶活性的影响,RT-PCR检测MMP2RNA表达水平；以鸡胚绒毛尿囊膜为模型,研究UTD2对血管新生的影响；发现UTD2可以显着抑制HUVEC的增殖、迁移和侵袭以及MMPs的活性,同时可以抑制鸡胚尿囊膜中新生血管的数目。4.通过GST pull down和Western blot实验检测UTD2对Rho GTPases;和MAPK通路的影响,发现UTD2可以显着抑制Racl的活性,同时减少PAK和p38的磷酸化。以上结果表明UTD2通过抑制Rac/PAK/p38MAPK信号通路调控乳腺癌细胞肌动蛋白细胞骨架进而调节细胞的运动。5.采用Focus formation assay计数转化集落的数目,结果显示经UTD2处理后Rac和Raf共同诱导产生的转化集落数目明显减少,说明UTD2抑制Rac在细胞转化实验中与Raf激酶的协同效应,同时可以影响Raf激酶通路。Western blot检测ERK1/2的磷酸化水平发现,UTD2可以使ERK1/2的磷酸化水平显着降低。以上结果说明UTD2可通过抑制Rac/Raf/ERK通路调控肿瘤细胞增殖和转化。6.采用Western blot、双荧光素酶报告基因等实验检测UTD2对Rac下游Akt和Wnt信号通路中关键蛋白表达、活性及相关转录因子的影响,发现UTD2可以降低Akt磷酸化水平,抑制其活性,其下游信号蛋白FKHR磷酸化下游转录因子CREB均被抑制,结果表明UTD2抑制Racl的活性,减弱Akt通路信号,最终诱导肿瘤细胞凋亡。UTD2对Wnt信号通路中β-catenin的表达和转录因子活性无显着影响,说明UTD2UTD2影响肿瘤细胞增殖和转移则不依赖Wnt通路。7.利用MTT、流式细胞术和Western blot等方法,检测UTD2和Palitaxel在肿瘤多药耐药性方面表现不同的分子机制,结果显示：UTD2抑制MCF-7/ADR细胞生长的IC50值为78.02nmol/L; Palitaxel抑制MCF-7/ADR细胞生长的IC50值则远远大于1000nmol/L; UTD2以终浓度为100nmol/L作用MCF-7/ADR细胞24h后,MCF-7/ADR细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别为]4.46%和30.7%；UTD2同样可以显着降低MCF-7/ADR细胞Akt激酶磷酸化,但是对照药物Paclitaxel作用后,MCF-7/ADR细胞内的Akt蛋白磷酸化程度没有任何变化。以上结果表明,UTD2对多药耐药细胞MCF-7/ADR同样敏感,可能与UTD2阻断Akt信号通路有关。综上所述,论文研究阐明了UTD2影响乳腺癌细胞增殖,抑制肿瘤转移和血管新生,诱导MCF-7细胞凋亡的机制；证实UTD2可通过改变Rho GTPases相关信号通路蛋白的活性,影响肌动蛋白细胞骨架并诱导肿瘤细胞凋亡。研究工作为埃博霉素类药物作用机制提供了新的例证,同时可以为埃博霉素类药物的临床应用提供指导。
卢菲[10]（2014）在《急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究》文中提出研究背景：急性髓性白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种异质性很强的恶性克隆性疾病,严重影响人类的健康。近年来,随着化疗、造血干细胞移植、基因靶向治疗以及生物免疫治疗等多种治疗方法的发展,AML患者的完全缓解率及5年无病生存率均较前有所改善,但是仍有大部分患者出现耐药和复发,预后不良。白血病多药耐药（multidrug resistance, MDR）的产生是导致化疗失败的关键因素,也是造成白血病患者复发、难治的重要原因。白血病多药耐药是指白血病细胞对一种化疗药物产生耐药后,同时对不同化学结构和不同作用机理的多种化疗药物产生交叉耐药的现象,包括原发性耐药与继发性耐药。MDR产生机制非常复杂,包括药物外排介导的耐药、MDR相关酶类异常所致耐药、药物作用靶点基因突变、肿瘤干细胞、细胞凋亡受抑、周期阻滞、药代动力学的改变等。因此从多个角度阐明AML多药耐药的机制,寻找有效逆转多药耐药的方法,不仅是克服AML多药耐药的重要思路,也是准确评估预后、改善患者生存率的必由之路。MicroRNA （miRNAs）是一类长度为19-25nt,序列高度保守的内源性非编码小RNA分子。成熟miRNA通过与目的基因3’端非编码（3’-UTR）区结合促使靶基因抑制或蛋白降解,在转录或转录后水平调控基因表达,广泛参与细胞的增殖、凋亡、分化、免疫系统、个体发育以及机体代谢等一系列生命过程。近年来研究发现,白血病中miRNA表达谱存在差异表达,在白血病形成及疾病进展过程中,miRNA参与癌细胞生物程序的调控,表现出癌基因或抑癌基因的作用。但是,关于miRNA在AML耐药过程中的作用机制尚不十分明确,有待于进一步研究。因此,筛选在AML耐药中起关键作用的miRNA并阐明其具体作用机制,研究急性髓性白血病中miRNA的异常表达与临床化疗敏感性、预后的关系,可以为难治/复发AML的早期预警和检测提供新的生物学标记物,对于提高难治/复发AML诊疗水平具有重要的临床意义。研究目的：筛选并鉴定出参与AML多药耐药的miRNA分子；研究该miRNA分子在成人AML骨髓标本中的表达,分析其与临床特征的关系；明确该miRNA分子在AML多药耐药中的作用；进一步确定该miRNA分子的靶基因,并探讨其参与AML多药耐药的机制,从而为逆转AML耐药带来全新的治疗思路和方案。研究方法：1.应用miRNA芯片技术筛选AML敏感与耐药细胞株之间差异表达的miRNA分子,选取差异倍数较高的miRNA分子作为候选分子。2.标本采集：收集120例AML患者和40例健康对照者的骨髓标本,其中AML患者标本分为初诊组（56例）,完全缓解组（44例）以及复发／难治组（20例）。采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离收集标本中骨髓单个核细胞,-80℃保存备用。3.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）法检测miR-29b的表达情况：采用mirVanaTM miRNA Isolation试剂盒提取AML患者骨髓单个核细胞及AML细胞株中miRNA,应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription （RT）试剂盒将miRNA逆转录为cDNA,应用TaqMan探针Real-time RT-PCR方法检测AML患者骨髓单个核细胞及AML细胞株miR-29b表达水平,验证芯片结果。4. miR-29b, AFlq和CD44分子在AML耐药中的作用。4.1细胞转染：应用Lipofectamine2000分别将miR-29b模拟物（mimic）或抑制剂（inhibitor）及各自阴性对照转染AML敏感与耐药细胞株,48小时后收集各组细胞,Real time RT-PCR检测转染后miR-29b表达情况。4.2病毒包装及细胞感染：分别包装携带AF1q表达载体或AF1q shRNA的慢病毒,感染AML敏感或耐药细胞株,上调或下调AF1q表达,48小时后荧光显微镜观测感染效率,应用Blastin药物筛选获得稳定感染细胞,Real timeRT-PCR、Western blot方法检测病毒感染稳筛后AF1q表达情况。4.3载体构建：构建携带CD44shRNA的真核表达载体,转染AML耐药细胞株,Real time RT-PCR和Western blot实验方法检测转染后CD44表达情况。4.4CCK8法检测药物敏感性：将稀释成一定浓度梯度的化疗药物阿霉素（DOX）,阿糖胞苷（Ara-C）,去甲氧柔红霉素（IDA）分别加入改变miR-29b, AF1q和CD44分子表达后的各组细胞,孵育48小时,CCK8法检测AML敏感及耐药株细胞对化疗药物的敏感性,分别计算各组细胞对三种化疗药物的IC50值。4.5流式细胞术检测细胞凋亡：选取一定浓度的阿霉素（DOX）,阿糖胞苷（Ara-C）,去甲氧柔红霉素（IDA）分别加入改变miR-29b, AF1q和CD44分子表达后各组细胞,作用48小时后,经AnnexinV/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率。5. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控机制研究。5.1生物信息学方法预测miR-29b分子可能调控的下游靶基因AF1q, Real-time RT-PCR、Western blot实验检测miR-29b分子表达变化对靶基因AF1q表达水平影响。5.2双荧光素酶报告实验验证miR-29b与下游靶基因AF1q结合作用：构建AF1q基因3’-UTR区野生及突变型荧光素酶报告载体,检测miR-29b上调后荧光素酶活性的改变。5.3Real-time RT-PCR、Western blot实验检测AF1q、CD44在AML细胞株及上述收集AML骨髓标本中mRNA及蛋白水平的表达情况,统计分析miR-29b和AF1q、CD44表达相关性。5.4AF1q对下游基因CD44表达水平影响：收集稳定筛选后AFlq上调或下调AML细胞株,Real-time RT-PCR, Western blot实验检测AF1q分子表达变化对下游基因CD44在mRNA及蛋白表达水平影响。5.5MiR-29b对下游基因CD44表达水平影响：应用Lipofectamine2000分别将miR-29b mimic或miR-29b inhibitor及各自阴性对照转染AML细胞株,48小时后收集各组细胞,Real-time RT-PCR, Western blot实验检测miR-29b分子表达变化对下游基因CD44在mRNA及蛋白表达水平影响。5.6将DOX作用与AML细胞并分别于12h,24h,48h收集细胞,设不加药对照组。利用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测AFlq和CD44表达。5.7细胞分组：①miR-29b mimic转染组；②miR-NC转染组；③AF1q表达载体转染组；④AF1q表达载体对照转染组；⑤miR-29b mimic+AF1q表达载体同时转染组；⑥miR-29b mimic+AF1q表达载体对照同时转染组；⑦miR-NC+AF1q表达载体对照同时转染组。CCK8法检测上述各组细胞药物敏感性,Western blot实验检测CD44表达水平。5.8双荧光素酶报告实验检测AFlq对CD44的转录调控作用：构建含有CD44启动子区域的荧光素酶报告载体,上调AFlq表达检测荧光素酶活性变化。5.9免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验检测AFlq蛋白与TCF7L2结合作用：构建携带有6myc标签AFlq基因全长表达载体,同时构建带有FLAG标签的TCF7L2表达载体,应用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,Co-IP实验检测验证AFlq蛋白与TCF7L2结合作用。5.10蛋白染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, CHIP）实验检测TCF7L2与CD44分子启动子区域结合作用：通过生物信息学软件预测TCF7L2与CD44分子启动子区域具体结合位点,设计CD44引物序列,将TCF7L2分子表达载体转染HEK293细胞,CHIP实验检测TCF7L2与CD44分子启动子区域结合作用。6.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据分别进行差异性分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.芯片结果：应用miRNA芯片技术在K562与耐药株K562/A02、HL60与耐药株HL60/ADM间筛选出24种表达明显差异的miRNA分子,选择表达明显差异的miR-29b、miR-181b作为候选miRNA分子。2.验证芯片结果：Real time RT-PCR结果表明与AML敏感株K562、HL60相比较,miR-29b在耐药株K562/A02、 HL60/ADM中表达明显下调。3. miR-29b, AF1q和CD44分子在AML患者骨髓标本中的表达水平：3.1miR-29b在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显低于健康对照组；初诊AML患者miR-29b表达水平明显高于难治／复发组患者；完全缓解组AML患者miR-29b表达水平明显高于初诊组和难治／复发组患者；而健康对照组与完全缓解组相比较miR-29b表达水平无明显差异。3.2与健康对照组相比较,AFlq在AML初诊组和难治/复发患者组中表达明显上调；初诊组和难治/复发组AML患者AF1q表达水平明显高于完全缓解组患者；初诊AML患者AFlq表达水平明显低于难治/复发组患者；健康对照组与完全缓解组相比较AFlq表达水平无明显差异。3.3CD44分子在AML初诊组和难治/复发患者中表达明显高于健康对照组；初诊组和难治/复发组AML患者CD44表达水平较完全缓解组AML患者明显升高；初诊AML患者CD44表达水平较难治/复发组AML患者显着降低；完全缓解组与健康对照组与相比较CD44表达水平无明显差异。4. miR-29b, AF1q和CD44分子在AML多药耐药中的作用：4.1Real time RT-PCR结果证实miR-29b mimic可明显上调miR-29b在AML耐药细胞株中的表达水平,miR-29b inhibitor可显着下调miR-29b在AML敏感细胞株中的表达水平。4.2Real time RT-PCR、Western blot结果显示携带AFlq表达载体的慢病毒可有效上调AF1q表达,携带AF1q shRNA的慢病毒可有效下调AFlq表达。4.3将CD44shRNA真核表达载体转染AML耐药细胞后,Real time RT-PCR、 Western blot结果显示CD44表达水平较对照组明显下调。4.4miR-29b,AF1q和CD44分子表达变化对AML细胞药物敏感性的影响：CCK8检测发现,miR-29b表达上调,AFlq或CD44表达下调均明显增加了AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）对化疗药物的敏感性；抑制miR-29b表达或上调AFlq表达明显降低了AML敏感细胞株（K562、HL60）对化疗药物的敏感性。4.5miR-29b, AF1q和CD44分子表达变化后对化疗药物诱导AML细胞凋亡的影响：AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率显示,miR-29b表达上调,AFlq或CD44表达下调后,化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、 HL60/ADM）凋亡率明显升高；抑制miR-29b表达或上调AFlq表达后,化疗药物诱导的AML敏感细胞株（K562、HL60）凋亡率明显下降。5. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控机制研究：5.1采用生物信息学软件（target scan和pictar）预测AFlq为miR-29b下游靶基因。在AML耐药细胞株中有效上调miR-29b表达水平后,AF1q蛋白表达水平均明显降低; miR-29b表达水平明显下调后,AFlq蛋白表达水平明显升高。5.2双荧光素酶报告实验证实miR-29b直接结合与AF1q3’-UTR区的预测靶位点。5.3Real time RT-PCR、Western blot结果显示AFlq和CD44分子在AML耐药株K562/A02. HL60/ADM中表达水平显着高于AML敏感株K562、HL60。Spearman秩相关分析结果显示：miR-29b和AF1q的表达水平呈显着负相关关系；miR-29b和CD44的表达水平呈显着负相关；AF1q和CD44的表达水平呈显着正相关关系。5.4Real time RT-PCR、Western blot结果显示AFlq表达上调后,CD44分子表达明显上调；AFlq表达下调后,CD44分子表达亦明显下调。5.5Real time RT-PCR、Western blot结果显示,在AML耐药株中过表达miR-29b可明显下调CD44分子在mRNA和蛋白水平表达；抑制miR-29b表达可显着上调CD44分子在mRNA和蛋白水平表达。5.6CCK8. Western blot实验结果显示：AFlq表达上调可减弱miR-29b的逆转耐药作用以及对CD44的正调控作用。5.7Real time RT-PCR、Western blot结果显示：化疗药物作用于AML耐药细胞后,AF1q和CD44表达水平显着降低；并且随着时间延长,AF1q和CD44表达均逐渐下调,呈正相关关系。5.8双荧光素酶报告实验结果显示AFlq结合于CD44启动子区域,在转录水平调控CD44表达活性。5.9Co-IP实验证实AFlq蛋白与TCF7L2存在结合作用。5.10CHIP实验证实TCF7L2作用于CD44分子启动子区域。结论：1. MiRNA分子在AML敏感细胞株及耐药细胞株之间表达谱存在明显差异,提示miRNA分子可能参与AML耐药过程。2.逆转miR-29b在AML耐药细胞株中的表达水平后,明显增加了AML耐药细胞对化疗药物的敏感性和化疗药物诱导的细胞凋亡。3. MiR-29b, AF1q和CD44分子形成miR-29b/AF1q/CD44作用轴在AML耐药发生、发展过程中发挥重要作用,有望成为AML治疗的新靶点。4.AFlq通过与Wnt/β-catenin信号通路TCF7L2转录因子共同作用,在转录水平激活CD44表达。MiR-181b在急性髓性白血病多药耐药中的作用及机制研究研究目的：检测niR-181b在AML细胞株中的表达水平,验证芯片结果；检测miR-181b在成人AML骨髓标本及健康对照组中的表达,分析其与临床特征的关系；明确miR-181b在AML耐药中的作用；预测并验证miR-181b的靶基因,进一步探讨miR-181b参与AML耐药发生发展的分子机制,为白血病治疗提供新的靶点。研究方法：1.标本采集：收集AML病患共80例,健康对照20例。AML患者骨髓标本包括初诊组（31例）,完全缓解组（37例）和复发/难治组（12例）。采用淋巴细胞分离液（Ficoll）密度梯度离心法分离骨髓标本中单个核细胞,-80℃保存备用。2. Taqman探针Real-time RT-PCR法检测miR-181b的表达情况：mirVanaTM miRNA Isolation试剂盒提取AML细胞株miRNA, MicroRNA Reverse Transcription （RT）试剂盒逆转录获得cDNA, Taqman探针Real-time RT-PCR方法检测AML敏感及耐药细胞株miR-181b表达水平,验证芯片结果。3. miR-181b在AML骨髓标本中表达情况检测：Taqman探针Real-time RT-PCR法检测AML患者及健康对照骨髓单个核细胞中miR-181b表达水平,分析miR-181b表达与临床疗效、病程及预后的相关性。4. miR-181b在AML耐药中的生物学作用研究。4.1细胞转染：分别将miR-181b mimic及其阴性对照miR-NC, miR-181b inhibitor及其阴性对照miR-inNC转染AML耐药细胞株K562/A02与HL60/ADM,48小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR方法检测转染后miR-181b表达情况。4.2CCK8法检测药物敏感性：将不同浓度梯度的DOX、Ara-C和IDA分别加入转染后的各组细胞,孵育48小时,CCK8法检测AML耐药细胞株对化疗药物敏感性并计算各组细胞对三种化疗药物的IC50值。4.3流式细胞术检测细胞凋亡：选取一定浓度的DOX、Ara-C和IDA分别作用与转染后各组细胞,作用48小时后,经AnnexinV/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。5.确定miR-181b分子的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的机制。5.1生物信息学方法预测miR-181b分子可能调控的下游靶基因。5.2Real-time RT-PCR、Western blot实验检测miR-181b分子表达上调或是下调后下游靶基因HMGB1和Mcl-1表达水平。5.3双荧光素酶报告实验验证miR-181b与下游靶基因结合作用：分别构建HMGB1和Mcl-1基因3’-UTR区野生及突变型荧光素酶报告基因载体,转染HEK293细胞检测miR-181b上调后对荧光素酶活性的影响。6. HMGB1在AML耐药中的生物学作用研究。6.1Real-time RT-PCR、Western blot实验检测HMGB1在AML细胞株及上述收集AML患者及健康对照标本中mRNA及蛋白的表达情况,分析HMGB1与临床疗效、病程及预后的相关性。6.2设计合成HMGB1siRNA,转染AML耐药细胞株,48小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR和Western blot检测转染后HMGB1表达情况。6.3CCK8实验检测转染后AML细胞药物敏感性：将DOX、Ara-C和IDA三种化疗药物与各组细胞共孵育48小时后,CCK8法检测AML耐药细胞株对化疗药物敏感性的变化并比较各组细胞对三种化疗药物的IC50值。6.4流式细胞术检测转染后AML细胞凋亡：将DOX、Ara-C和IDA三种化疗药物作用于各组细胞48小时后, AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。7.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.验证芯片结果：miR-181b在AML耐药株K562/A02、HL60/ADM中表达较AML敏感株K562、HL60明显下降。2. miR-181b在AML患者骨髓标本中的表达水平：Real time RT-PCR结果显示miR-181b在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显低于健康对照组；初诊AML患者miR-181b表达水平较难治／复发组AML患者明显升高；完全缓解组AML患者miR-181b表达水平较初诊组和难治／复发组AML患者显着上调；健康对照组与完全缓解组相比较miR-181b表达水平无明显差异。3. miR-181b分子在AML多药耐药中的作用：3.1Real time RT-PCR结果显示：miR-181b mimic转染组AML细胞niR-181b表达水平较转染miR-NC组明显升高；miR-181b inhibitor转染组AML细胞miR-181b表达水平较转染miR-181binNC组明显降低。3.2miR-181b表达变化后对AML细胞药物敏感性的影响：miR-181b表达上调后,CCK8实验结果显示AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）对化疗药物的敏感性显着增强。3.3miR-181b表达变化后对化疗药物诱导的AML细胞凋亡影响：miR-181b表达上调后,AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）凋亡率明显升高。4.确定miR-181b的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的分子机制。4.1采用生物信息学软件（target scan和pictar）预测HMGB1和Mcl-1为miR-181b下游靶基因。4.2在AML耐药细胞株中过表达miR-181b可在转录后水平抑制HMGB1和Mcl-1表达。4.3双荧光素酶报告实验证实miR-181b直接结合于HMGB1和Mcl-13’-UTR区预测靶位点。5. HMGB1分子在AML耐药中的作用：5.1Real-time RT-PCR、Western blot实验结果显示：HMGB1在AML耐药株K562/A02、HL60/ADM中表达水平明显高于AML敏感株K562、HL60。5.2Real-time RT-PCR、Western blot实验结果显示：HMGB1在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显高于健康对照组；初诊组和难治／复发组AML患者HMGB1表达水平较完全缓解组AML患者明显升高；初诊AML患者HMGB1表达水平低于难治／复发组AML患者；完全缓解组与健康对照组相比较HMGB1表达水平无明显差异。5.3Real-time RT-PCR、Western blot结果显示：设计合成的HMGB1siRNA转染AML耐药细胞株48小时后可有效下调HMGB1表达。5.4CCK8实验结果显示：HMGB1表达下调明显增加了AML耐药细胞株（K562/A02. HL60/ADM）对化疗药物的敏感性。5.5AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率显示：HMGB1表达下调后,化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）凋亡率显着升高。结论：1. miR-181b在AML耐药株和难治/复发病患骨髓标本中表达明显下调,提示miR-181b可能在AML耐药过程中有潜在抑癌基因作用。2.在AML耐药细胞株过表达miR-181b可明显增加AML耐药细胞对化疗药物的敏感性和化疗药物诱导的细胞凋亡。3. HMGB1和Mcl-1表达下调为miR-181b发挥逆转耐药作用的可能机制之一。
二、FG020326通过增加泰素帝介导caspase-8和3激活的敏感性克服多药耐药细胞MCF-7/ADR的凋亡抗性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、FG020326通过增加泰素帝介导caspase-8和3激活的敏感性克服多药耐药细胞MCF-7/ADR的凋亡抗性（论文提纲范文）
（1）苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 苦参碱通过调控肿瘤相关磷酸化信号通路抑制卵巢癌的发生发展 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点与作用机制研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 苦参碱抗肿瘤作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（2）基于肿瘤微环境设计多功能纳米前药用于逆转肿瘤多药耐药性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肿瘤多药耐药性 |
| 1.2.1 肿瘤细胞因素 |
| 1.2.2 肿瘤环境因素 |
| 1.3 多药耐药逆转剂 |
| 1.3.1 ABC转运体抑制剂 |
| 1.3.2 GSH/GST抑制剂 |
| 1.3.3 HIF抑制剂 |
| 1.3.4 炎症抑制剂 |
| 1.3.5 其他抑制剂 |
| 1.4 纳米药物系统逆转肿瘤耐药策略 |
| 1.4.1 物理包封 |
| 1.4.2 化学键合 |
| 1.4.3 药物自组装 |
| 1.5 理想的纳米药物输送系统 |
| 1.5.1 稳定性 |
| 1.5.2 靶向性 |
| 1.5.3 释药性 |
| 1.5.4 联合治疗 |
| 1.6 本论文研究工作 |
| 1.7 参考文献 |
| 第二章 苯硼酸靶向及pH敏感的普兰尼克前药胶束的制备及其体内药效评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 阿霉素前体合成 |
| 2.3.2 pluronic前药聚合物合成 |
| 2.3.3 pluronic靶向聚合物合成 |
| 2.3.4 杂化前药胶束制备及表征 |
| 2.3.5 pH敏感性及稳定性评估 |
| 2.3.6 体外药物释放 |
| 2.3.7 细胞培养及唾液酸检测 |
| 2.3.8 细胞摄取 |
| 2.3.9 细胞毒性 |
| 2.3.10 逆转机制评估 |
| 2.3.11 细胞凋亡 |
| 2.3.12 动物模型建立及肿瘤部位药物分布 |
| 2.3.13 小鼠抑瘤实验及组织学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 化学结构分析 |
| 2.4.2 前药胶束表征 |
| 2.4.3 pH敏感性评估 |
| 2.4.4 体外药物释放 |
| 2.4.5 细胞唾液酸水平 |
| 2.4.6 细胞摄取 |
| 2.4.7 细胞毒性 |
| 2.4.8 逆转机制评估 |
| 2.4.9 细胞凋亡 |
| 2.4.10 体内药物分布 |
| 2.4.11 体内抗肿瘤 |
| 2.4.12 病理学评估 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 自产氧的纳米酶前药粒子用于克服缺氧介导的化疗-光动力治疗抗性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 两亲性生物大分子前药合成 |
| 3.3.2 前药粒子及Ce6 装载粒子制备 |
| 3.3.3 理化表征分析 |
| 3.3.4 pH触发DOX及 Ce6 释放 |
| 3.3.5 氧气生成及酶活性评估 |
| 3.3.6 缺氧细胞模型建立 |
| 3.3.7 体外HIF-1α及 P-gp分析 |
| 3.3.8 细胞摄取 |
| 3.3.9 胞外/内ROS评估 |
| 3.3.10 MTT分析 |
| 3.3.11 体外凋亡分析 |
| 3.3.12 体内药物分布及成像 |
| 3.3.13 免疫荧光分析 |
| 3.3.14 免疫组化分析 |
| 3.3.15 在荷瘤小鼠及裸鼠体内的抗肿瘤作用评估 |
| 3.3.16 体内安全性分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 大分子前药合成及表征 |
| 3.4.2 前药粒子及Ce6 装载粒子制备及表征 |
| 3.4.3 酶活性评估 |
| 3.4.4 pH触发的降解及释放 |
| 3.4.5 HIF-1α及 P-gp表达 |
| 3.4.6 细胞摄取 |
| 3.4.7 胞外/胞内PDT效应评估 |
| 3.4.8 细胞毒性评估 |
| 3.4.9 细胞凋亡评估 |
| 3.4.10 药代动力学及体内成像 |
| 3.4.11 体内缺氧及P-gp评估 |
| 3.4.12 体内抗肿瘤评估 |
| 3.4.13 生物安全性评估 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 自组装的PEI/DOX/CXB杂化前药粒子用于克服肿瘤抗性及侵袭 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 阿霉素与塞来昔布二聚体合成 |
| 4.3.2 双亲性PEI合成 |
| 4.3.3 纳米前药粒子制备及表征 |
| 4.3.4 电荷翻转及质子缓冲 |
| 4.3.5 体外药物释放 |
| 4.3.6 细胞毒性评估 |
| 4.3.7 细胞摄取及亚细胞共定位 |
| 4.3.8 P-gp定量检测 |
| 4.3.9 细胞划痕、迁移、侵袭评估 |
| 4.3.10 细胞周期 |
| 4.3.11 细胞凋亡 |
| 4.3.12 体内药物分布 |
| 4.3.13 实体瘤抑制及组织学评估 |
| 4.3.14 转移瘤抑制及免疫组化评估 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 化合物结构分析 |
| 4.4.2 前药粒子表征 |
| 4.4.3 质子缓冲及电荷翻转 |
| 4.4.4 体外药物释放 |
| 4.4.5 细胞摄取与亚细胞共电位 |
| 4.4.6 P-gp表达评估 |
| 4.4.7 细胞毒性 |
| 4.4.8 划痕、迁移、侵袭实验评估 |
| 4.4.9 细胞周期与凋亡 |
| 4.4.10 体内器官分布 |
| 4.4.11 体内实体瘤抑制评估 |
| 4.4.12 体内转移瘤抑制评估 |
| 4.4.13 生物安全性评估 |
| 4.5 小结 |
| 4.6 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 缩略词 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（3）PFTα/大豆苷元协同拓扑替康对乳腺癌抑制作用及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 癌症 |
| 1.1.1 癌症研究现状 |
| 1.1.2 癌症日益增加的原因 |
| 1.1.3 癌症的治疗手段 |
| 1.2 喜树碱类药物 |
| 1.2.1 喜树碱类药物的作用靶点 |
| 1.2.2 肿瘤细胞对喜树碱类药物产生耐药性的机制 |
| 1.2.3 拓扑替康 |
| 1.3 Pifithrin-α |
| 1.4 异黄酮类化合物 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容及技术路线 |
| 2 TPT与PFTα的联合抗癌作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及设备 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 TPT耐药细胞株的构建 |
| 2.4.2 MTT分析 |
| 2.4.3 DNA松弛分析 |
| 2.4.4 彗星实验 |
| 2.4.5 细胞周期分析 |
| 2.4.6 细胞凋亡分析 |
| 2.4.7 qPCR方法检测相关基因的表达 |
| 2.4.8 流式细胞仪检测相关蛋白的表达 |
| 2.4.9 激光共聚焦显微镜观察细胞核内p53蛋白的分布 |
| 2.4.10 激光共聚焦显微镜观察细胞核内药物的积累量 |
| 2.4.11 统计学分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 TPT与PFTα的联合使用对细胞增殖的影响 |
| 2.5.2 TPT与PFTα的联合使用对Topo I催化活性的影响 |
| 2.5.3 TPT和PFTα的联合使用对DNA损伤的影响 |
| 2.5.4 TPT和PFTα的联合使用对细胞周期的影响 |
| 2.5.5 TPT和PFTα的联合使用对细胞凋亡的影响 |
| 2.5.6 TPT与PFTα的联合使用对p53响应基因的影响 |
| 2.5.7 TPT与PFTα的联合使用对p53响应蛋白的影响 |
| 2.5.8 TPT与PFTα的联合使用对p53在MCF7细胞核中分布的影响 |
| 2.5.9 PFTα对细胞中药物积累量的影响 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 小结 |
| 3 TPT与DAI的联合抗癌作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 主要生化试剂和试剂盒 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 试剂配制 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 MTT分析 |
| 3.4.2 DNA松弛分析 |
| 3.4.3 彗星实验 |
| 3.4.4 细胞周期分析 |
| 3.4.5 细胞凋亡分析 |
| 3.4.6 Western blotting检测相关蛋白的表达 |
| 3.4.7 构建MCF7裸鼠异种移植模型进行体内药效评价 |
| 3.4.8 统计学分析 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 TPT与雌二醇的联合使用对MCF7细胞增殖的影响 |
| 3.5.2 TPT和五种异黄酮的联合使用对MCF7细胞增殖的影响 |
| 3.5.3 TPT和DAI的联合使用对三种人源癌细胞增殖的影响 |
| 3.5.4 TPT和DAI的联合使用对Topo I催化活性的影响 |
| 3.5.5 TPT和DAI的联合使用对DNA损伤的影响 |
| 3.5.6 TPT和DAI的联合使用对细胞周期的影响 |
| 3.5.7 TPT和DAI的联合使用对细胞凋亡的影响 |
| 3.5.8 TPT和DAI的联合使用对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.5.9 TPT与DAI联合使用的体内药效评价 |
| 3.5.10 TPT与DAI的联合使用对肿瘤组织中相关蛋白表达的影响 |
| 3.5.11 TPT与DAI的联合使用对裸鼠主要内脏器官的毒性 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 4 DAI逆转MCF7/ADR对TPT的耐药性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和设备 |
| 4.2.1 细胞株 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MTT分析 |
| 4.3.2 qPCR方法检测相关基因的表达 |
| 4.3.3 激光共聚焦方法观察MCF7/ADR细胞膜上BCRP蛋白的分布 |
| 4.3.4 激光共聚焦方法观察细胞核内TPT的积累量 |
| 4.3.5 构建MCF7/ADR裸鼠异种移植模型进行体内药效评价 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 TPT和DAI的联合使用对MCF7/ADR细胞增殖的影响 |
| 4.4.2 TPT和DAI的联合使用对相关基因的表达的影响 |
| 4.4.3 TPT和DAI的联合使用对MCF7/ADR细胞膜上BCRP分布的影响 |
| 4.4.4 TPT和DAI的联合使用对MCF7/ADR细胞核内TPT积累量的影响 |
| 4.4.5 DAI与TPT联合使用的体内药效评价 |
| 4.4.6 TPT与DAI的联合使用对肿瘤组织中相关蛋白表达的影响 |
| 4.4.7 TPT与DAI的联合使用对裸鼠主要内脏器官的毒性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）基于多靶点策略的松香二萜和五环三萜类衍生物的设计合成及抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 脱氢松香酸的研究进展 |
| 1.2.1 抗肿瘤活性 |
| 1.2.2 抗菌活性 |
| 1.3 五环三萜的抗肿瘤研究进展 |
| 1.3.1 熊果酸抗肿瘤活性研究 |
| 1.3.2 积雪草酸抗肿瘤活性研究 |
| 1.4 NF-κB与肿瘤间的关系研究 |
| 1.5 MMPs与癌症转移 |
| 1.5.1 MMPs的功能 |
| 1.5.2 MMPs的分类 |
| 1.5.3 MMPs的结构及其抑制剂 |
| 1.6 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 脱氢松香酸磺酰胺衍生物的设计合成及MMPs抑制活性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 主要原料、试剂与仪器 |
| 2.2.2 合成路线 |
| 2.2.3 合成步骤 |
| 2.2.3.1 化合物8a-8u的合成 |
| 2.2.3.2 化合物9a-9u的合成 |
| 2.2.4 基质金属蛋白酶活性测定 |
| 2.2.5 分子对接 |
| 2.2.6 体外抗肿瘤活性测试 |
| 2.2.7 体外抗迁移活性测试 |
| 2.2.8 细胞周期分析 |
| 2.2.9 细胞凋亡分析 |
| 2.2.10 AO/EB染色分析 |
| 2.2.11 数据显着性分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 体外MMPs抑制活性检测及构效关系分析 |
| 2.3.2 分子对接 |
| 2.3.3 体外抗肿瘤活性研究 |
| 2.3.4 化合物8k抑制HepG2细胞迁移 |
| 2.3.5 细胞周期分析 |
| 2.3.6 化合物8k诱导HepG2细胞凋亡 |
| 2.3.7 吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法检测细胞凋亡 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 双磷酸酯脱氢松香酸硫脲衍生物的合成及药理活性评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 主要原料、试剂与仪器 |
| 3.2.2 合成路线 |
| 3.2.3 合成步骤 |
| 3.2.3.1 化合物4的制备 |
| 3.2.3.2 化合物6a-6k的制备 |
| 3.2.4 药理活性测试 |
| 3.2.4.1 体外细胞毒性检测 |
| 3.2.4.2 细胞凋亡分析 |
| 3.2.4.3 Hoechst 33258染色分析 |
| 3.2.4.4 AO/EB染色分析 |
| 3.2.4.5 活性氧(ROS)测定 |
| 3.2.4.6 线粒体膜电位检测 |
| 3.2.4.7 caspase-3和-9活性测定 |
| 3.2.4.8 细胞周期分析 |
| 3.2.4.9 Western Blotting分析 |
| 3.2.4.10 CDK2酶测定 |
| 3.2.4.11 分子对接 |
| 3.2.4.12 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 构效关系分析 |
| 3.3.2 化合物6e诱导SK-OV-3细胞凋亡 |
| 3.3.3 化合物6e诱导SK-OV-3细胞凋亡的形态学表征 |
| 3.3.4 化合物6e诱导ROS产生 |
| 3.3.5 化合物6e诱导线粒体途径依赖性凋亡 |
| 3.3.6 化合物6e激活半胱蛋白酶和释放细胞色素c |
| 3.3.7 化合物6e诱导促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达 |
| 3.3.8 细胞周期的分析 |
| 3.3.9 分子对接 |
| 3.3.10 CDK2抑制活性 |
| 3.4. 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 功能化侧链的熊果酸苯胺衍生物作为NF-κB抑制剂研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 主要原料、试剂与仪器 |
| 4.2.2 合成路线 |
| 4.2.2.1 制备化合物2Y的一般程序 |
| 4.2.2.2 制备化合物3Y的一般程序 |
| 4.2.2.3 制备化合物5Y的一般程序 |
| 4.2.3 细胞毒活性测定 |
| 4.2.4 抑制TNF-α诱导的NF-κB活化测试 |
| 4.2.5 分子对接 |
| 4.2.6 细胞凋亡分析 |
| 4.2.7 细胞周期分析 |
| 4.2.8 Hoechst 333258测定 |
| 4.2.9 蛋白质印迹 |
| 4.2.10 NF-κB DNA结合试验 |
| 4.2.11 数据显着性分析 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 体外细胞毒活性 |
| 4.3.2 抑制NCI-H460肺癌细胞中TNF-α诱导的NF-κB活化 |
| 4.3.3 对接模型 |
| 4.3.4 化合物5Y8抑制NF-κB/DNA结合 |
| 4.3.5 选择的化合物对耐药细胞系的影响 |
| 4.3.6 化合物5Y8抑制NCI-H460细胞中TNF-α-TAK1-NF-κB信号级联反应 |
| 4.3.7 化合物5Y8诱导NCI-H460细胞凋亡 |
| 4.3.8 细胞周期分析 |
| 4.3.9 Hoechst 33258对NCI-H460细胞凋亡的形态学表征 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 积雪草酸1,2,3-三唑衍生物阻断NF-κB活化及抗肿瘤活性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 主要原料、试剂与仪器 |
| 5.2.2 合成路线 |
| 5.2.3 积雪草酸衍生物的合成 |
| 5.2.3.1 化合物5a-5h的合成 |
| 5.2.3.2 化合物6a-6l的合成 |
| 5.2.4 抑制TNF-α诱导的NF-κB活化测试 |
| 5.2.5 NF-κB DNA结合试验 |
| 5.2.6 SPR分析 |
| 5.2.7 分子对接 |
| 5.2.8 免疫荧光染色 |
| 5.2.9 细胞毒活性测定 |
| 5.2.10 细胞凋亡分析 |
| 5.2.11 细胞周期分析 |
| 5.2.12 Hoechst 333258测定 |
| 5.2.13 蛋白质印迹 |
| 5.2.14 Transwell迁移试验 |
| 5.2.15 数据显着性分析 |
| 5.3 结果和讨论 |
| 5.3.1 体外抑制TNF-α诱导的A549肺癌细胞NF-κB活化 |
| 5.3.2 分子对接 |
| 5.3.3 表面等离子体共振测定 |
| 5.3.4 化合物6k抑制NF-κB/DNA结合 |
| 5.3.5 化合物6k抑制NF-κB易位至细胞核 |
| 5.3.6 化合物6k抑制IKKβ和IκBα磷酸化的活性 |
| 5.3.7 体外细胞毒活性 |
| 5.3.8 化合物6k诱导A549细胞凋亡 |
| 5.3.9 AO/EB染色法检测细胞凋亡 |
| 5.3.10 化合物6k在体外抑制A549细胞的迁移 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间以第一作者发表论文题录 |
（5）MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 问题的提出 |
| 1.3 研究路线 |
| 1.4 本文创新点 |
| 1.5 研究意义 |
| 2 乳腺癌化疗耐药相关miRNAs的筛选与鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验思路 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 TCGA数据库筛选与乳腺癌生长及耐药相关的miRNAs |
| 2.5.2 高通量鉴定可显着下调乳腺癌细胞耐药性的miRNAs |
| 2.5.3 MiR-27b、miR-204表达量在乳腺癌组织中显着下调 |
| 2.5.4 MiR-27b表达失调与紫杉醇耐药相关 |
| 2.5.5 MiR-27b的表达失调与乳腺癌患者的预后相关 |
| 2.5.6 MiR-27b的表达量与乳腺癌的恶性程度相关 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 MiR-27b可抑制乳腺癌生长与耐药 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验思路 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 MiR-27b可抑制乳腺癌细胞增殖、逆转紫杉醇耐药 |
| 3.5.2 MiR-27b可影响乳腺癌细胞对多种化疗药物的耐药性 |
| 3.5.3 MiR-27b可抑制乳腺癌细胞的克隆形成 |
| 3.5.4 MiR-27b可促进乳腺癌细胞的凋亡 |
| 3.5.5 MiR-27b可在体内抑制乳腺癌的生长和耐药性 |
| 3.5.6 低表达miR-27b可在体内促进乳腺癌的生长 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 本章小结 |
| 4 MiRNA-27b下游靶基因的确定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验思路 |
| 4.3 实验材料 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 生物信息学预测miR-27b的下游靶标 |
| 4.5.2 筛选与乳腺癌生长及耐药相关的靶基因 |
| 4.5.3 确定miR-27b的直接靶标 |
| 4.5.4 MiR-27b可在体外抑制CBLB、GRB2的表达 |
| 4.5.5 MiR-27b可在体内抑制CBLB、GRB2的表达 |
| 4.5.6 CBLB、GRB2表达失调与紫杉醇耐药相关 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 5 MiR-27b抑制乳腺癌细胞增殖与耐药的机制研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验思路 |
| 5.3 实验材料 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 CBLB、GRB2可在体外促进乳腺癌细胞的增殖、耐药 |
| 5.5.2 MiR-27b通过抑制CBLB、GRB2从而抑制细胞的增殖与耐药 |
| 5.5.3 MiR-27b可逆转CBLB、GRB2对凋亡的调控作用 |
| 5.5.4 CBLB、GRB2可抑制AKT、ERK信号通路 |
| 5.5.5 MiR-27b可抑制AKT、ERK信号通路 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 本章小结 |
| 6 预测乳腺癌中以耐药相关miRNAs为中心的调控网络 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验思路 |
| 6.3 生信平台 |
| 6.4 实验方法 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 筛选关键miRNAs下游表达失调的靶基因 |
| 6.5.2 蛋白互作网络的构建及生物信息学分析 |
| 6.5.3 蛋白互作网络中筛选枢纽基因 |
| 6.5.4 筛选miRNAs上游表达失调的IncRNAs |
| 6.5.5 构建以关键miRNAs为中心的调控网络 |
| 6.6 本章小结 |
| 附图1 |
| 附图2 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 小白菊内酯对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。 |
| 3.3 荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响 |
| 3.4 Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 小白菊内酯对HCT-8/VCR细胞耐药逆转作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用 |
| 3.2 流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI染色)检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用 |
| 3.3 Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 大黄素通过调控PI3K/AKT信号通路诱导CACO-2凋亡的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 大黄素对CACO-2细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响。 |
| 3.3 DAPI染色检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响 |
| 3.4 流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞周期的影响 |
| 3.5 Western-blot法检测大黄素对CACO-2细胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 本研究自我创新性评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 第一篇 结肠癌研究现状 |
| 1.1 结肠癌的流行病学研究现状 |
| 1.2 结肠癌的致病因素 |
| 1.3 结肠癌相关基因的研究进展 |
| 1.4 结肠癌的治疗 |
| 第二篇 肿瘤多药耐药逆转剂研究进展 |
| 2.1 化学药物逆转剂 |
| 2.2 基因治疗逆转剂 |
| 2.3 免疫逆转剂 |
| 2.4 中药逆转剂型 |
| 2.5 其它 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）浙贝黄芩汤通过调控Wip1对白血病模型化疗效果的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药逆转白血病耐药的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 Wip1生理与病理研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究思路 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 Wip1调控野生型p53的表达与急性髓系白血病进程相关性研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 5 结论 |
| 6 讨论 |
| 实验二 尾静脉注射HL60、HL60/ADR建立小鼠白血病模型 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 实验三 浙贝黄芩汤调控Wip1对白血病模型化疗效果的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 第四部分 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成绩 |
（8）miR-205靶向VEGFA与FGF2调控乳腺癌化疗耐药性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、miR-205在乳腺癌耐药细胞的异常表达及其对化疗敏感性的影响 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 常用试剂 |
| 1.1.3 miRNA表达芯片与生物信息学软件 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要溶液配方 |
| 1.1.6 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 MCF-7与MCF-7/A02细胞microRNA表达谱芯片结果与分析 |
| 1.2.2 Taqman实时定量PCR法验证microRNA芯片结果 |
| 1.2.3 miR-205表达量与乳腺癌患者化疗敏感性的关系 |
| 1.2.4 miR-205慢病毒侵染与稳转细胞株的建立 |
| 1.2.5 过表达miR-205对乳腺癌多药耐药细胞药物敏感性 |
| 1.2.6 过表达miR-205对阿霉素和紫杉醇处理后乳腺癌细胞增殖的影响 |
| 1.2.7 过表达miR-205对紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡的影响 |
| 1.2.8 过表达miR-205对乳腺癌耐药细胞凋亡相关基因的影响 |
| 1.2.9 miR-205通过PI3K/AKT信号通路活性对耐药细胞凋亡的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、miR-205靶向VEGFA和FGF2影响乳腺癌耐药细胞的化疗敏感性 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象 |
| 2.1.2 常用试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 靶基因预测软件预测miR-205与VEGFA和FGF2的结合位点 |
| 2.2.2 VEGFA和FGF2在乳腺癌细胞系中的表达 |
| 2.2.3 RT-PCR检测过表达miR-205后VEGFA和FGF2在两种乳腺癌耐药细胞系中的表达 |
| 2.2.4 ELISA法检测检测过表达miR-205后分泌型VEGFA和FGF2在两种乳腺癌耐药细胞系中的表达 |
| 2.2.5 RT-PCR法检测检测新辅助化疗前乳腺癌组织中VEGFA和FGF2的表达 |
| 2.2.6 VEGFA和FGF2是miR-205的下游直接靶基因 |
| 2.2.7 VEGFA和FGF2对化疗敏感性的影响 |
| 2.2.8 VEGFA和FGF2对紫杉醇处理后乳腺癌细胞凋亡的影响 |
| 2.2.9 加入VEGFA和FGF2后对乳腺癌细胞凋亡相关基因的影响 |
| 2.2.10 VEGFA和FGF2通过PI3K/AKT信号通路影响乳腺癌细胞的凋亡 |
| 2.2.11 VEGFA和FGF2作为miR-205下游靶基因直接参与对乳腺癌耐药性的影响 |
| 2.2.12 PI3K抑制剂对紫杉醇诱导的凋亡的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、miR-205对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 对象 |
| 3.1.2 常用试剂 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 miR-205对裸鼠乳腺癌移植瘤生长的影响 |
| 3.2.2 RT-PCR检测miR-205、VEGFA、FGF2、bax和survivin在移植瘤中的表达 |
| 3.2.3 ELISA检测VEGFA和FGF2在小鼠血清中的表达 |
| 3.2.4 CALDOX-miR-205细胞在小鼠动物模型中的成瘤作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 miR-205调控肿瘤耐药性及肿瘤干细胞关系的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）埃博霉素衍生物抗肿瘤作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| CONTENTS |
| 图目录 |
| 表目录 |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 埃博霉素概述 |
| 1.1.1 埃博霉素的发现 |
| 1.1.2 埃博霉素的结构和理化性质 |
| 1.1.3 埃博霉素的构效关系 |
| 1.1.4 埃博霉素的合成 |
| 1.1.5 埃博霉素的药理活性 |
| 1.1.6 埃博霉素的作用机制 |
| 1.1.7 埃博霉素的抗多药耐药性 |
| 1.1.8 埃博霉素类药物的临床研究 |
| 1.2 Rho GTPases与乳腺癌关系的研究进展 |
| 1.2.1 细胞运动和肿瘤转移 |
| 1.2.2 Rho家族及其调控蛋白 |
| 1.2.3 Rho GTPases上游信号通路 |
| 1.2.4 Rho GTPase生物学功能 |
| 1.2.5 乳腺癌中Rho GTPases的调控作用 |
| 1.3 本论文的选题依据和研究目的及内容 |
| 2 埃博霉素衍生物对乳腺癌细胞生长的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料及主要试剂 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞增殖检测 |
| 2.3.3 微管蛋白的聚合分析 |
| 2.3.4 流式细胞术检测细胞周期时相变化 |
| 2.3.5 细胞凋亡检测 |
| 2.3.6 Western blot检测信号蛋白表达 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 埃博霉素衍生物对乳腺癌细胞增殖的抑制作用 |
| 2.4.2 埃博霉素衍生物稳定乳腺癌细胞微管蛋白的聚合 |
| 2.4.3 埃博霉素衍生物改变乳腺癌细胞周期时相 |
| 2.4.4 埃博霉素衍生物诱导乳腺癌细胞凋亡 |
| 2.4.5 埃博霉素衍生物对Bcl-2家族的影响 |
| 2.4.6 埃博霉素衍生物对caspase级联通路的影响 |
| 2.4.7 埃博霉素衍生物对不同转化程度的乳腺上皮细胞存活率的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 埃博霉素衍生物对细胞骨架及Rho GTPases的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料及主要试剂 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 免疫细胞化学 |
| 3.3.3 细胞划痕实验 |
| 3.3.4 细胞迁移实验 |
| 3.3.5 细胞侵袭实验 |
| 3.3.6 细胞粘附实验 |
| 3.3.7 明胶酶谱实验 |
| 3.3.8 GST pull down检测Rho GTPases活性 |
| 3.3.9 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 埃博霉素衍生物对乳腺癌细胞微管细胞骨架的影响 |
| 3.4.2 埃博霉素衍生物对乳腺癌细胞肌动蛋白细胞骨架的影响 |
| 3.4.3 埃博霉素衍生物抑制MCF-7细胞定向运动能力 |
| 3.4.4 埃博霉素衍生物抑制MCF-7细胞迁移能力 |
| 3.4.5 埃博霉素衍生物对MCF-7细胞粘附能力的影响 |
| 3.4.6 埃博霉素衍生物抑制MCF-7细胞侵袭能力 |
| 3.4.7 埃博霉素衍生物对基质金属蛋白酶活性的影响 |
| 3.4.8 埃博霉素衍生物对Rho GTPases活性的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 埃博霉素衍生物对血管新生的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料及主要试剂 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 MTT检测细胞增殖 |
| 4.3.3 细胞迁移实验 |
| 4.3.4 细胞侵袭实验 |
| 4.3.5 HUVEC分泌基质金属蛋白酶(MMPs)检测 |
| 4.3.6 RT-PCR检测HUVEC核内MMP2的mRNA |
| 4.3.7 Western blot检测VEGF表达 |
| 4.3.8 管生成体内实验 |
| 4.3.9 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 埃博霉素衍生物抑制HUVEC细胞的增殖 |
| 4.4.2 埃博霉素衍生物抑制HUVEC细胞的迁移能力 |
| 4.4.3 埃博霉素衍生物抑制HUVEC细胞的侵袭 |
| 4.4.4 埃博霉素衍生物抑制鸡胚尿囊膜的血管新生 |
| 4.4.5 埃博霉素衍生物抑制MMP2的活性及其mRNA的表达 |
| 4.4.6 埃博霉素衍生物对VEGF表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 埃博霉素衍生物对Rho GTPases相关通路的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验材料及主要试剂实验设备 |
| 5.2.2 实验设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 信号分子磷酸化水平及表达量检测 |
| 5.3.2 细胞培养 |
| 5.3.3 MTT检测细胞增殖 |
| 5.3.4 细胞迁移实验 |
| 5.3.5 转录活性检测 |
| 5.3.6 Focus formation assay测定集落形成 |
| 5.3.7 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 负显性抑制Racl增强埃博霉素衍生物对乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制 |
| 5.4.2 埃博霉素衍生物抑制下游效应因子PAK1的活性 |
| 5.4.3 埃博霉素衍生物对MAPK信号通路的影响 |
| 5.4.4 埃博霉素衍生物对Akt信号通路的影响 |
| 5.4.5 埃博霉素衍生物对Wnt信号通路的影响 |
| 5.4.6 埃博霉素衍生物对转录因子活性的影响 |
| 5.4.7 埃博霉素衍生物对细胞周期相关蛋白的影响 |
| 5.4.8 埃博霉素衍生物抑制Rac和Raf激酶的协同效应 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 埃博霉素衍生物对乳腺癌多药耐药细胞株生长的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与设备 |
| 6.2.1 实验材料及主要试剂 |
| 6.2.2 实验设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 细胞培养 |
| 6.3.2 细胞增殖检测 |
| 6.3.3 细胞凋亡检测 |
| 6.3.4 Western blot检测信号蛋白表达 |
| 6.3.5 流式细胞仪检测细胞内Bax蛋白构象 |
| 6.3.6 统计学分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 MCF-7/ADR细胞的耐药性 |
| 6.4.2 Paclitaxel对MCF-7和MCF-7/ADR细胞存活率的影响 |
| 6.4.3 埃博霉素衍生物对MCF-7和MCF-7/ADR细胞存活率的影响 |
| 6.4.4 埃博霉素衍生物诱导MCF-7/ADR细胞凋亡 |
| 6.4.5 埃博霉素衍生物对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 |
| 6.4.6 埃博霉素衍生物对MCF-7/ADR细胞Bax蛋白构象的影响 |
| 6.4.7 埃博霉素衍生物对caspase级联通路的影响 |
| 6.4.8 埃博霉素衍生物对MCF-7/ADR细胞蛋白激酶Akt磷酸化的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 论文的特色和创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 附录内容名称 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控急性髓性白血病多药耐药性的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. 耐药细胞株鉴定 |
| 2. MiRNA芯片筛选结果 |
| 3. TaqMan探针Real-time RT-PCR方法验证芯片结果 |
| 4. MiR-29b分子在AML患者及对照组骨髓标本中的表达 |
| 5. MiR-29b在AML耐药中的作用 |
| 6. 确定miR-29b的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的机制 |
| 7. AF1q在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 8. CD44在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 9. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控作用研究 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiR-181b在急性髓性白血病多药耐药中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. miR-181b表达水平检测 |
| 2. 过表达miR-181b可逆转AML耐药细胞株耐药 |
| 3. miR-181b相关下游靶基因预测及验证 |
| 4. HMGB1在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 5. HMGB1对Mcl-1表达的影响 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 一. MicroRNA生物学特性 |
| 二. MicroRNA调控肿瘤耐药相关蛋白 |
| 三. MicroRNA改变药物靶点 |
| 四. MicroRNA和细胞凋亡逃逸 |
| 五. MicroRNA和细胞周期调控 |
| 六. MicroRNA与肿瘤干细胞 |
| 七. MicroRNA转运 |
| 八. 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 文章创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English articles Ⅰ |
| English articles Ⅱ |
四、FG020326通过增加泰素帝介导caspase-8和3激活的敏感性克服多药耐药细胞MCF-7/ADR的凋亡抗性（论文参考文献）
- [1]苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究[D]. 张玺. 华中科技大学, 2020(01)
- [2]基于肿瘤微环境设计多功能纳米前药用于逆转肿瘤多药耐药性[D]. 程旭. 安徽大学, 2020(07)
- [3]PFTα/大豆苷元协同拓扑替康对乳腺癌抑制作用及机理研究[D]. 郭建丽. 大连理工大学, 2019(08)
- [4]基于多靶点策略的松香二萜和五环三萜类衍生物的设计合成及抗肿瘤活性研究[D]. 黄日镇. 东南大学, 2019(05)
- [5]MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义[D]. 陈丹妮. 浙江大学, 2019(03)
- [6]小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究[D]. 马乾章. 中国医科大学, 2018(03)
- [7]浙贝黄芩汤通过调控Wip1对白血病模型化疗效果的影响[D]. 张坤. 北京中医药大学, 2018(01)
- [8]miR-205靶向VEGFA与FGF2调控乳腺癌化疗耐药性[D]. 刘晶晶. 天津医科大学, 2016(07)
- [9]埃博霉素衍生物抗肿瘤作用的研究[D]. 张洪. 大连理工大学, 2014(07)
- [10]急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究[D]. 卢菲. 山东大学, 2014(12)