一、微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBHI)的纤维素结合结构域及其链结区非水解性破坏纤维素结晶区结构(英文)（论文文献综述）
王明[1]（2021）在《内蒙古草原纤维素分解菌的筛选及秸秆乙醇发酵》文中提出绿色开发利用纤维素是解决能源短缺问题的有效途径。纤维素的生物转化已成为能源、环境和化工工业等领域的研究热点。利用纤维素酶高效环保地降解纤维素,生成所需的生物燃料等其他物资,是生物分解利用纤维素的主要方式,因此寻找高效降解纤维素的纤维素酶为当今的主要研究方向。本实验利用羧甲基纤维素钠选择培养基从内蒙古土样中进行菌株初筛,对筛选出的菌株利用刚果红染色和不同温度下培养进行酶活力测定,共获得19株具有纤维素分解能力的菌株。选定低温下具有较高纤维素酶活力的菌株S5,通过形态学观察、生理生化验证和16S rDNA基因序列同源性分析,鉴定该菌株为耐寒短杆菌（Brevibacterium frigoritolerans）。为优化该菌株的产酶条件,分别对产酶培养基的碳源、氮源、无机盐、接种量、温度和pH进行单因素优化实验,同时通过响应面对上述各因素进行优化,结果发现该菌株在各种条件下均产生一定的酶量,但最佳产酶条件为玉米秸秆3%、胰蛋白胨0.5%、硫酸亚铁0.51%、pH 6.0、接种量2%、发酵温度30℃,此时菌株纤维素酶活力达到24.78 U·mL-1,与响应面预期值接近,相对于优化前粗酶液酶活力13.8 U·mL-1,酶活力提高到179%。温度和pH被认为是影响酶活力的最重要因素,本实验设计20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃等 7 个酶反应温度梯度,pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 等6个pH反应梯度,进行酶活力测定。结果表明,在50℃和pH 4.0的反应条件下,S5菌株纤维素酶具有最高的酶活力。在45℃和pH4.0的条件下,纤维素酶具有最佳的稳定性。应用上述优化的发酵条件,将农业废弃物玉米秸秆粉作为生物乙醇的生产原料,利用耐寒短杆菌-S5将玉米秸降解成还原糖,然后利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741将产生的糖转化为生物乙醇,产生的乙醇浓度最大值达到0.47 g·L-1。综上所述,本研究从内蒙古土壤中发现一株具有降解纤维素能力的菌株—耐寒短杆菌Brevibacterium frigoritolerans S5,该菌在较低温度下具有较高的纤维素酶活性,发酵条件优化后其酶活力达到24.78 U·mL-1;玉米秸秆粉在该菌降解后,在酿酒酵母的作用下,可被转化为生物乙醇。因此,该菌株具有广阔的市场前景,本研究为纤维素的开发利用奠定了一定基础。
郑春娟[2]（2020）在《RNA干扰嗜热毁丝霉Mtdnmt1及mtlae基因对纤维素酶活性及相关基因表达的影响》文中研究表明嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）是一种具有降解木质纤维素能力的嗜热真菌,其最适生长温度是45℃。目前,嗜热毁丝霉基因组已于2011年测序完成并公布。来自嗜热毁丝霉的一些降解酶在70℃-80℃的高温条件下仍可保持稳定活性。因而,嗜热毁丝霉被认为是一个潜在的中高温酶库。表观遗传是指在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,使基因表达发生可遗传变化的现象。表观遗传机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑以及非编码RNA的调控等。表观遗传修饰虽然不会引起DNA序列的改变但是它可以影响基因的表达,对器官的发育和个体的生长具有重要的影响。DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰方式之一,主要通过DNA甲基转移酶使DNA发生甲基化。在动物细胞中DNA的甲基化可发生在启动子、转座子、增强子、沉默子和基因本体等多个部位;DNA甲基转移酶DNMT1是细胞中最重要的甲基转移酶,具有从头和维持甲基化的功能,有研究表明干扰该基因的表达将会降低一些基因的甲基化状态从而增加部分基因的表达量。而在植物和丝状真菌中,DNA甲基转移酶使基因组的转座子和重复序列发生甲基化。此外,在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）发现的蛋白甲基转移酶LaeA是一种广泛的调节因子,有修饰异染色质结构的作用,并以此调节多种基因的表达。本文主要利用RNAi技术分别干扰嗜热毁丝霉Mtdnmtl及Mtlae基因的表达,以探究真菌表观遗传机制对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响及对相关纤维素酶基因的表达调控作用。本论文主要研究内容及结果如下:（1）RNA干扰嗜热毁丝霉Mtdnmtl基因方面:Mtdnmtl基因的编码蛋白在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中同源性最高的同源蛋白是胞嘧啶C5位点的DNA甲基转移酶。本研究构建了Mtdnmtl基因干扰表达载体pUC19-siRNA-Mtdnmtl,通过嗜热毁丝霉原生质体转化法,将pUC19-siRNA-Mtdnmtl与pAN7-1共同导入嗜热毁丝霉受体细胞中,在含潮霉素B的抗性平板上筛选,再通过RT-qPCR技术筛选,获得一个干扰效率达75%的转化子D1进行后续实验。对转化子D1在不同碳源诱导条件下的滤纸酶（FPA）、内切酶（CMC）、纤维二糖水解酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BG）活性进行测定,发现在2%微晶纤维素诱导条件下,滤纸酶活和CMC酶活均在第五天达到最高值,分别是野生型（WT）的1.17倍和1.04倍,BG酶活和CBH酶活均在第六天达到最高,分别是是野生型的1.13倍和1.16倍;在5%α-乳糖诱导条件下,CMC酶活相比2%微晶纤维素诱导下表现相对较强的活性,在第三天达到最高值,转化子D1酶活是野生型的1.18倍,而CBH酶活活性极低。通过实时荧光定量PCR技术对主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1、egl3、bgl1及相关调控基因xyr1和cre1分析发现,在2%微晶纤维素诱导条件下,xyr1、碳代谢阻遏因子cre1表达量均低于野生型,而主要纤维素酶基因表达量均不同程度高于野生型,而在5%α-乳糖诱导条件下,转化子D1的主要纤维素酶基因及相关因子表达量均高于野生型。（2）RNA干扰嗜热毁丝霉Mtlae基因方面:Mtlae基因编码蛋白在里氏木霉（Trire2:41617）以及构巢曲霉中得到最高同源性的蛋白分别是蛋白甲基转移酶LAE1和LAEA。同样,构建Mtlae基因干扰表达载体pUC19-siRNA-Mtlae,利用原生质体转化法将pUC 19-siRNA-Mtlae与pAN7-1共同导入嗜热毁丝霉受体细胞中,经潮霉素B抗性平板筛选,得到一个干扰效率为73%的转化子S33进行后续实验。分别测定转化子S33在2%微晶纤维素和5%α-乳糖两种不同碳源诱导条件下的滤纸酶（FPA）、内切酶（CMC）、纤维二糖水解酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BG）活性进行测定。在2%微晶纤维素诱导条件下,转化子S33滤纸酶活和CMC酶活同样在第五天达到最高值,分别是野生型（WT）的1.33倍和1.15倍,BG和CBH酶活在第六天达到最高,分别是野生型的1.17倍和1.20倍;而在5%α-乳糖诱导条件下,转化子S33酶活均比野生型低,滤纸酶活从第2天开始下降到第5天几乎没有酶活,第二天转化子酶活是野生型的80%。同样,CMC酶活在α-乳糖诱导下表现相对较强的活性,但转化子CMC酶活从第二天开始呈下降趋势,在第三天野生型达到最高值,转化子酶活是野生型的64%。通过实时荧光定量PCR技术对S33主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1、egl3、bgl1及相关调控基因xyr1和cre1分析发现,在2%微晶纤维素诱导条件下,除xyr1表达量稍低于野生型外,cbh1、cbh2、egl1、egl3、bgl1及碳代谢阻遏因子cre1表达量均高于野生型,而在5%α-乳糖诱导条件下,第2天转化子S33的主要纤维素酶基因cbh2、egl1、egl3、bgl1表达量均比野生型低,而xyr1、碳代谢阻遏因子cre1则稍高于野生型,纤维素酶基因表达与酶活结果表现基本一致。综上所述,不同诱导物对嗜热毁丝霉纤维素酶活性作用有较大区别。尽管xyr1被证实在多种丝状真菌中充当纤维素酶转录激活因子,但其对嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达基本不起作用。对嗜热毁丝霉Mtdnmtl基因进行干扰后,无论是2%微晶纤维素诱导还是5%α-乳糖诱导,转化子D1各纤维素酶活性均表现出明显高于野生型,纤维素酶基因表达也呈相应趋势。这表明DNA甲基化是影响纤维素酶基因表达的重要因素,通过干扰DNA甲基化可在一定程度上提高纤维素酶的活性。对嗜热毁丝霉Mtlae基因进行干扰则发现,在2%微晶纤维素诱导条件下,转化子S33四种纤维素酶活性均高于野生型,而在5%α-乳糖诱导条件下则呈相反结果,这表明蛋白甲基转移酶对纤维素酶活性的调节作用受不同诱导物的影响。
郭高杰[3]（2019）在《纤维水解辅助蛋白SwoⅠ的结构域功能及应用》文中提出木质纤维素是地球上含量最丰富,最有潜力的可再生资源之一,但其复杂的网状结构阻碍了它的高效酶解与利用,因此,提高木质纤维素酶解糖化效率是降低木质纤维降解转化成本的首要任务,而辅助蛋白可以提高降解木质纤维素过程中的酶解效率。本研究针对可降低纤维素结晶度的里氏木霉来源的辅助蛋白Swollenin,对其结构域功能及其与纤维素酶的融合蛋白的应用进行探究研讨。经生物信息学方法分析,辅助蛋白SwoⅠ由纤维素结合模块（CBM）、Linker区域、类似糖苷水解酶45家族的结构域（Expansin-like-GH45）和类似花粉过敏源A-区域的结构域（Expansin-like-pollen-A）四个部分组成。通过RT-PCR方法获得Expansin-like-GH45 编码基因（swob）、Expansin-like-pollen-A 编码基因（swoc）、SwoⅠ去除CBM和Linker区域后的编码基因（swobc）以及去除信号肽的SwoⅠ编码基因（swo/）。经密码子优化后,在毕赤酵母内异源表达SwoB、SwoC、SwoBC和SwoⅠ蛋白。水解实验表明,SwoⅠ全长及其结构域,对滤纸纤维结构有不同程度的疏松和崩解;当SwoB、SwoC、SwoBC和SwoⅠ蛋白协助纤维素酶水解羧甲基纤维素钠时,还原糖产量分别提高了 13%,5%,25%和33%。分析EG Ⅱ与SwoⅠ结构域的蛋白结构,将EG Ⅱ与SwoⅠ结构域设计成融合蛋白,以（GGGGS）2柔性连接肽连接。通过重叠延伸PCR,将egⅡ与swoI结构域基因融合成目的基因e-b、e-c、e-bc、e-s,并成功在毕赤酵母内异源表达融合蛋白E-B、E-C、E-BC、E-S。研究表明,融合蛋白的酶学性质与融合前相似,水解CMC时,融合蛋白E-B、E-BC与E-S产生的水解活性比融合前分别提高了约13%、18%和25%,其中E-C中的内切纤维素酶活性几乎不变,可能是折叠时活性位点被覆盖。
吴秋玉[4]（2019）在《芒果炭疽病菌两个葡聚糖酶基因的表达分析及CgCBH1致病相关功能鉴定》文中研究指明芒果（Mangifera indica L.）是世界五大着名的热带水果之一,气味香甜口感好,具有较高的保健功效。芒果炭疽病是芒果生产上发生最普遍、为害最严重的一种病害,在世界芒果种植区内广泛发生,也是贮藏期的重要病害之一,发病重的果园造成减产达60%～70%。胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.&Sacc）是引起芒果炭疽病的主要病原菌,侵染寄主后会造成落叶、果实腐烂等症状。木实验通过测定芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶活性,确定芒果炭疽病菌产葡聚糖酶的能力,并分析了农药氟啶胺对该菌产葡聚糖酶能力的影响;同源克隆获得了外切葡聚糖酶CgCBH1基因和内切葡聚糖酶基因CgEG1B,用qRT-PCR方法分析了和CgEG1B在芒果炭疽病菌侵染寄主过程中的表达情况,初步确定其与芒果炭疽病菌致病力的关系。通过插入gfp::hygB替换靶标基因的原理构建成功了CgCBH1基因的敲除载体,通过转化原生质体、含hygB的PDS平板筛选、特异性引物PCR验证及qRT-PCR分析确定获得了 CgCBH1基因敲除突变体△CgCBH1,通过表达分析和表型测定,初步确定了其功能,这对揭示C.的致病机理具有重要的学术价值,也为后续寻求防治该病害的新靶标打下良好的理论基础。主要结果如下:1.芒果炭疽病菌在PD培养液中随着培养时间的延长,胞外外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶活性均先升高后降低,第6天时达到最高,分别为56.62 U/mL和48.42 U/mL,说明芒果炭疽病菌能产生和分泌外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶,且产生的外切葡聚糖酶总体比内切葡聚糖酶多。芒果炭疽病菌对氟啶胺的敏感性较高,EC50为0.1536 mg/L、斜率值为3.4890,用于防治芒果炭疽病的潜力较大。酶活分析显示氟啶胺能有效抑制芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的分泌。2.本研究在芒果炭疽病菌中克隆获得了外切葡聚糖酶基因CgCBH1（MH497159.1）,DNA全长1746 bp,编码区的CDS全长1584 bp,编码527个氨基酸,分子量约为55.32kD,等电点（PI）为5.55,含1个纤维素酶保守结构域,不存在跨膜结构,存在1个信号肽,属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占15.37%,延伸链占18.03%,β-转角占4.55%,无规则卷曲占62.05%,与Cgloeosporioides Nara gc5外切葡聚糖酶基因的氨基酸序列（XP-007283944.1）相似性达89%。用同样的方法,获得了内切葡聚糖酶基因CgEG1B（KU871064.1）,DNA全长1077 bp,编码区的CDS全长1020bp,编码339个氨基酸,分子量约为37.13 kDa,等电点PI为5.11,含1个纤维素酶保守结构域,不存在跨膜结构,存在1个信号肽,属于分泌型蛋白;其二级结构中a-螺旋占27.14%,延伸链占21.83%,β-转角占1.77%,无规则卷曲占49.26%,与鳄梨炭疽菌（C.gloeosporioides）（EQB54542.1）的内切葡聚糖酶基因相似性为95%以上。3.qRT-PCR分析发现,外切葡聚糖酶CgCBH1基因和内切葡聚糖酶基因CgEG1B在整个侵染过程中均持续高效表达,表明两个酶与芒果炭疽病菌的侵染过程相关。突变体△CgCBH1产孢量明显下降,孢子萌发不形成附着胞,菌落颜色由灰黑色变为白色,菌丝生长速率下降了约20%,菌丝颜色变浅、胞内黑色素含量下降了25.6%,菌丝致死温度下降为50℃ 10 min,对偏酸环境适应性更强,对碳氮源的利用有所改变;对高渗胁迫环境比野生型更加敏感,对H2O2的抗性更明显,菌丝外切葡聚糖酶活性下降了22%,用菌饼接种芒果叶片和成熟的果皮表面,刺伤时致病力下降了10.26～42.42%,不刺伤则基本完全不能致病。实时荧光定量分析表明CgEG1B和Cgpel3对CgCBH1的缺失有互补作用,CgCBH1与其余附着胞形成、黑色素合成、细胞壁降解酶相关基因表达有正相关关系;但不调控病菌的适宜温度范围的需求。可见外切葡聚糖酶基因CgCBH1在芒果炭疽病菌对于菌丝的生长、分化、黑色素的沉着,分生孢子和附着胞的形成,胞壁水解酶的活性,对逆境的适应性、对氟啶胺的敏感性以及对寄主的致病力等方面起着重要的调控作用。
韩菲[5]（2018）在《纤维素酶Cbh9A中关键残基功能及过程模式的分子动力学研究》文中指出随着石油资源的枯竭和人类对能源增长的需求,寻找廉价,清洁的可再生能源已成为全球研究人员的共同目标。同时,纤维素作为植物细胞壁高度稳定的聚合物成分,是地球上碳和能量最丰富的可再生资源。因此,纤维素生物质的利用和转化是解决环境污染和能源危机的一个非常重要的课题。纤维素是由数百个到数千个β-（1,4）-D-葡萄糖单元聚合形成的多糖,并且可以通过糖苷水解酶（GH）将其降解成小的纤维糊精或葡萄糖。GH现在分为135个家族,这些家族被编入碳水化合物-活性酶数据库（http://www.cazy.org）。纤维素酶是一种GH,具有很高的多样性。它能高效地将纤维素生物质水解成碳水化合物,碳水化合物将进一步转化为生物基燃料,化学品和材料。9家族的糖苷水解酶（GH9）作为GH的一个家族,含有170多个成员。该家族的酶有两种特征:（α/α）6桶状折叠结构和反转型催化水解机制。在反转型催化水解机制中,谷氨酸作为羧酸性残基向糖苷氧贡献质子,而天冬氨酸则作为碱性残基则激活亲核性水分子攻击异头碳。来自热纤维梭菌的纤维素酶纤维二糖水解酶A（Cbh9A）,是糖苷水解酶（GH）家族9中的一种进行性纤维素酶。早期已有实验在其活性裂缝中观察到从非还原末端到还原末端的-2至+2糖4个结合亚位点,而裂解位置在-1和+1亚位点之间。Asp383,Asp386和Glu795保守于-1和+1亚位点周围,其中,Glu795充当酸性残基,而Asp383或Asp386则充当碱性残基。一些活性位点附近的其他残基,如Tyr555何Trp678,也被认为发挥着重要的作用。但其具体功能至今仍不清楚。同时,Cbh9A的过程模式也尚未描述。在这项工作中,我们深入探究了Tyr555和Trp678对Cbh9A的持续水解能力的影响。模拟结果分析表明,Y555S和W678G突变体中活性裂缝变宽,并且底物和WT-Cbh9A之间的结合自由能低于Y555S和W678G突变体的结合自由能。残基自由能分解分析表明,在两个突变体中,底物与Asp383,Gly548,Trp616和Asp789残基之间的相互作用几乎消失。此外,与WT-Cbh9A相比,在SMD模拟期间,Y555S和W678G突变体中的拉力和能垒显着降低,这说明底物与Y555S和W678G突变体具有较弱的相互作用。因此,Tyr555和Trp678可能通过控制底物与酶的结合来影响Cbh9A的持续水解能力。同时,在Cbh9A的过程模式中,Asp383,Asp386,Glu795,Tyr555,Trp678,Trp791,Asp789和Trp616均为水解过程中的关键残基,在Cbh9A的过程模式中发挥着至关重要的作用。而且Cbh9A选择性水解机制,我们认为可能是归因于Glc（-1）的不同取向和Trp678与Glc（-2）之间的相互作用。这项工作为纤维素酶修饰或突变提供了一定的理论信息,对提供新型纤维素酶模拟物的设计方案和工业化应用途径具有理论指导意义。
郑春娟,邓婷婷,来亚鹏,刘刚,王娟[6]（2018）在《真菌纤维素酶表观遗传修饰的研究进展》文中进行了进一步梳理组蛋白乙酰化酶编码基因gcn5、蛋白甲基转移酶LaeA及其同源物Lae1、VeA等可通过作用于调节纤维素酶基因及其表达调控因子的表达,进而在转录水平上影响纤维素酶基因的表达。简述了真菌纤维素酶的种类与结构和真菌纤维素酶基因的表达调控机制,重点从DNA甲基化、蛋白甲基化和乙酰化以及非编码RNA等的角度,综述几种主要表观遗传修饰对真菌纤维素酶基因表达作用的研究进展。
万靖[7]（2018）在《纤维素酶的热保护及其固定化技术研究》文中研究表明作为广泛应用的酶之一,由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成的复合纤维素酶在食品、造纸、纺织、动物饲料等诸多行业起着重要作用。然而,游离的纤维素酶易受外界环境作用导致酶活性损失,以及难于回收等特点造成了酶的使用成本过高,限制了其大规模的工业化应用。通过酶活性保护作用可以解决目前所面临的这些应用难题。纤维素是地球上含量最为丰富的可再生资源之一,却没有得到有效利用,甚至其废弃物对环境造成了一定的破坏。利用纤维素酶降解纤维素得到葡萄糖,再进一步发酵可制得生物燃料乙醇,能够有效地缓解人类目前面临的能源危机。实验以大分子聚乙二醇单甲醚为基础,合成亲水性的大分子单体PEG-MA,再进一步与单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）合成聚合度为46的共聚物PEG-g-PDMAEMA。在中性条件下,加入4 mg/mL的带正电荷的共聚物与0.5mg/mL的活性区域带负电荷氨基酸的纤维素酶通过静电作用相结合,共聚物覆盖在酶的活性区域,从而屏蔽外界环境等不利因素。常温条件下加入20 mg/mL带负电荷的聚丙烯酸,与PEG-g-PDMAEMA形成更强有力的静电作用,纤维素酶得以解吸,从而酶活性几乎全部恢复。此两步法人工分子伴侣PEG-g-PDMAEMA/PAAc体系的构建在对酶活力的“开/关”调控基础上对纤维素酶具有热保护作用。将PEG-g-PDMAEMA/纤维素酶复合物在90℃下保持20min,仍有58%的相对酶活力得以恢复。通过两种单体甲基丙烯酰胺（MAA）和丙烯酸（AAc）合成可溶-不溶性UCST型共聚物PMAAc。50℃下,40μg/mL的戊二醛活化载体氨基5 h,随后共价作用“柔性”固定化纤维素酶,其UCST为19℃。对固定化条件进行了优化,35℃下,4 mg/mL的纤维素酶在pH=5.0缓冲溶液中固定化4 h,酶的固载量达到46.6mg/g的最佳值。固定化后的纤维素酶拓宽了pH和温度作用范围,且稳定性有了显着提高。由于β-葡萄糖苷酶在复合纤维素酶中的含量较低,而β-葡萄糖苷酶是各组分酶水解协同作用的最后关键一步,因此以β-葡萄糖苷酶为补充酶,与2.5倍量的纤维素酶共同固定化后进行水解,其在24 h后达到平衡的糖化率是单独的固定化纤维素酶水解的近3倍,且重复水解反应8次后,依然有61%的糖化率。β-葡萄糖苷酶在聚合物PVP保护作用下,与乙酸铜和对氨基苯甲酸（PABA）混合液共沉淀合成基于金属有机框架Cu（PABA）的固定化酶β-G@Cu（PABA）。优化后的乙酸铜和对氨基苯甲酸的浓度分别为50 mM和12.5 mM,共沉淀在pH为7.0的乙酸钠-乙酸缓冲液中进行,酶浓度选择为2 mg/mL,固定化8h后的固载量及保留酶活力达到最佳值,分别为162.95 mg/g和81.89%。Cu（PABA）骨架的三维孔道结构为β-葡萄糖苷酶提供了刚性屏蔽环境,显着提高了其稳定性及有机溶剂耐受性。将β-G@Cu（PABA）和PMAAc-纤维素酶共同催化CMC,并与单独PMAAc-纤维素酶水解进行对比。水解12 h后达到平衡,在纤维素酶等量条件下,两种固定化酶共同水解的糖化率较单独固定化PMAAc-纤维素酶提高近一倍,水解循环8次后,得到超过70%的糖化率。
张丹[8]（2017）在《纤维素酶的研究进展及其展望》文中研究指明本文综述了纤维素酶的分类,结构（催化域、结合域和连接部分）,作用机理,协同作用假说,和纤维素酶在工厂应用时遇到的障碍及其解决方案。
李珊珊[9]（2016）在《粗糙脉孢菌三种CBH基因突变菌株的构建及表达》文中指出纤维素是自然界里分布广泛、含量丰富的一种生物能源,其分子结构复杂很难被自然分解。利用微生物纤维素酶水解纤维素后再利用,对废物纤维素是一种有效,环保的解决方式。纤维素酶降解纤维素的过程广泛被认可的是外切葡聚糖酶（CBH）、内切葡聚糖酶（EG）和β-葡萄苷酶（BG）三种组分之间的协同作用,外切纤维素酶起到非常重要的作用,粗糙脉孢菌是能产纤维素酶的一种重要模式微生物,存在十几种CBH基因,这些基因在纤维素降解过程中起到不同的作用,同时它们之间存在着相互协同的作用。本实验通过构建三种CBH基因缺失突变菌株和三种基因的过表达菌株了解三种基因在纤维素降解过程中的作用及几种基因之间的相互作用关系。本实验在已有粗糙脉孢菌cbh-1（NCU07340）、cbh-2（NCU09680）、gh6-3（NCU07190）三种基因缺失突变菌株的基础上,采用孢子杂交的方法成功构建得到它们的双基因和三基因缺失突变菌株;根据Neurospora crassa Database设计引物对三个基因进行克隆,并与qa-5myc.6His载体进行连接,成功构建载体qa-5myc.6His-NCU07340、qa-5myc.6His-NCU09680、qa-5myc.6His-NCU07190。通过电转化方法将载体转入组氨酸缺陷型菌株4200his-中,Western杂交检验,得到cbh-1、cbh-2、gh6-3过表达克隆子,其表达蛋白大小分别约为90KDa、70KDa、65KDa。进一步对获得的基因缺失菌株和基因过表达菌株的生长表型进行观察,发现cbh-2基因缺失会使菌丝的生长速度变慢,菌丝变细,分枝变多,这一点在cbh-2单基因缺失、cbh-1与cbh-2双基因、cbh-2与gh6-3双基因及三基因缺失菌株都有发现。它们的产孢形态也发生了不同程度的变化,基因缺失造成孢子数量减少。这些观察结果说明CBH基因缺失对菌株的生长发育存在着不同程度的影响。研究表明3种CBH基因缺失对CBH酶活性均有不同程度的影响。cbh-2基因缺失后CBH酶活性降低最显着,约降低59%,cbh-2与cbh-1,cbh-2与gh6-3双缺失和3基因缺失酶活变化与cbh-2单基因缺失相似;cbh-1基因缺失造成CBH酶活性降低约48%,gh6-3基因缺失降低约22%。但是cbh-1与gh6-3双基因缺失的酶活要高于cbh-1和gh6-3单基因缺失,纤维素酶系统组成和表达复杂性可能解释这一现象,但还需进一步从转录水平进行研究。对另外两种纤维素酶活检测结果表明,CBH基因缺失会降低内切纤维素酶活性,但β-葡萄糖苷酶活性未发现明显变化,CBH过表达对内切纤维素酶活性及β-葡萄糖苷酶活性均无明显影响。几种过表达菌株在不同碳源培养基中CBH酶活不同,天然纤维素诱导产酶效果更好,与野生型相比几种过表达菌株CBH酶活有不同程度的提高。
陈笑笑[10]（2013）在《纤维二糖水解酶Ⅰ的系统进化分析》文中提出纤维素是广泛存在于自然界的可再生多糖化合物,纤维素水解能产生大量的小分子单糖,是重要的生物资源。相对于纤维素的工业降解,生物降解纤维素具有清洁、快速、反应条件低、转化率高的优点,是近年来生物研究的一个重要课题。纤维二糖水解酶I （CBHI）是生物降解纤维素的一种重要的外切酶。它作用于纤维素分子末端,水解p-1,4-糖苷键。纤维二糖水解酶由3个部分组成：具有催化活性的催化结构域,作用为锚定纤维素的纤维素结合域以及连接这两个结构域的一段短肽。已知催化结构域属于糖基水解酶家族7（GH7）,而纤维素结合域属于糖类结合域家族1（CBM1）。目前GenBank等数据库中与CBHI有关的蛋白质和氨基酸序列很多,为CBHI的研究提供了很多详实可靠的数据。本研究收集了所有有分类学位置的CBHI编码基因数据并据此构建系统发育树。研究结果表明,收集到的基因序列长度为1446-3032bp不等,平均长度1776bp, G+C含量49.44-65.65%,表明其变异度比较大。平均转换颠换比为0.71,颠换频率高于转换频率,表明CBHI编码基因是一个相对活跃的基因。序列间的遗传距离从0.003到0.697不等,说明一些物种间的CBHI编码序列相似性较低。目前CBHI编码基因作为纤维素降解酶只发现在真菌中存在,主要存在于粪壳菌纲,散囊菌纲和伞菌纲的真菌中,在其他生物类群中没有发现。CBHI编码基因的进化与物种的进化有着密切的关系。
二、微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBHI)的纤维素结合结构域及其链结区非水解性破坏纤维素结晶区结构(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBHI)的纤维素结合结构域及其链结区非水解性破坏纤维素结晶区结构(英文)（论文提纲范文）
（1）内蒙古草原纤维素分解菌的筛选及秸秆乙醇发酵（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 纤维素的研究现状 |
| 1.1.1 纤维素的利用 |
| 1.1.2 物理方法利用纤维素 |
| 1.1.3 化学方法利用纤维素 |
| 1.1.4 生物方法利用纤维素 |
| 1.1.5 纤维素利用存在的问题 |
| 1.2 纤维素分解菌的研究 |
| 1.2.1 纤维素分解菌的研究进展 |
| 1.3 纤维素酶 |
| 1.3.1 纤维素酶的组成 |
| 1.3.2 影响纤维素酶活力的因素 |
| 1.4 纤维素酶的应用 |
| 1.5 生物燃料的研究 |
| 1.6 本研究的目的、意义及技术路线 |
| 1.6.1 研究目的与意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 主要仪器及设备 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验溶液配制 |
| 2.4 供试培养基 |
| 2.5 土样采集 |
| 2.6 土壤纤维素酶活测定 |
| 2.7 土壤纤维素分解菌的筛选 |
| 2.7.1 纤维素分解菌的初筛 |
| 2.7.2 纤维素分解菌的复筛 |
| 2.8 菌株鉴定 |
| 2.8.1 形态学鉴定 |
| 2.8.2 分子生物学鉴定 |
| 2.9 生长曲线 |
| 2.10 产酶培养基条件优化 |
| 2.10.1 单因素优化 |
| 2.10.2 响应面优化 |
| 2.11 纤维素酶酶学性质研究 |
| 2.11.1 纤维素酶反应最适温度测定 |
| 2.11.2 纤维素酶的热稳定性测定 |
| 2.11.3 纤维素酶最适反应pH测定 |
| 2.11.4 纤维素酶的pH稳定性测定 |
| 2.12 农业秸秆粉转化为生物乙醇测定 |
| 2.13 数据处理 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 土壤纤维素酶活力 |
| 3.2 纤维素分解菌分离初筛 |
| 3.3 纤维素分解菌的复筛 |
| 3.4 产纤维素酶菌株鉴定 |
| 3.4.1 产纤维素酶菌株的形态学和生化特征 |
| 3.4.2 产纤维素酶菌株的分子生物学鉴定 |
| 3.5 生长曲线 |
| 3.6 发酵条件的优化 |
| 3.6.1 单因素优化 |
| 3.6.2 响应面优化 |
| 3.7 纤维素酶的酶学性质 |
| 3.7.1 纤维素酶的最适温度 |
| 3.7.2 纤维素酶的温度稳定性 |
| 3.7.3 纤维素酶的最适pH |
| 3.7.4 纤维素酶的pH稳定性 |
| 3.8 玉米秸秆粉转化为生物乙醇 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 纤维素分解菌的研究 |
| 4.2 纤维素分解菌的分离与鉴定 |
| 4.3 不同条件下纤维素酶酶活力变化 |
| 4.4 纤维素酶酶学性质研究 |
| 4.5 生物乙醇的研究 |
| 第5章 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）RNA干扰嗜热毁丝霉Mtdnmt1及mtlae基因对纤维素酶活性及相关基因表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 真菌纤维素酶概述 |
| 1.1.1 真菌纤维素酶的种类与结构 |
| 1.1.2 真菌纤维素酶基因的表达调控机制 |
| 1.2 表观遗传概述 |
| 1.3 表观遗传修饰在真菌纤维素酶基因调控中的作用 |
| 1.3.1 DNA甲基化对纤维素酶表达的影响 |
| 1.3.2 蛋白甲基转移酶对纤维素酶表达的影响 |
| 1.3.3 组蛋白乙酰化、甲基化对纤维素酶表达的影响 |
| 1.3.4 非编码RNA对纤维素酶表达的影响 |
| 1.3.4.1 siRNA |
| 1.3.4.2 长链非编码RNA |
| 1.4 本论文研究的主要内容及意义 |
| 第2章 RNA干扰嗜热毁丝霉Mtdnmt1基因对纤维素酶活性及相关基因表达的影响 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.1.2 试剂及培养基 |
| 2.1.1.3 相关仪器和设备 |
| 2.1.1.4 寡核苷酸引物 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 SiRNA-Mtdnmt1寡核苷酸片段的设计、合成 |
| 2.1.2.2 SiRNA-Mtdnmt1寡核苷酸片段的退火反应 |
| 2.1.2.3 pUC19-MtPpdc-MtTpdc质粒的提取及酶切 |
| 2.1.2.4 Mtdnmt1基因干扰表达载体pUC19-siRNA-Mtdnmt1的构建 |
| 2.1.2.5 嗜热毁丝霉原生质体制备与转化 |
| 2.1.2.6 干扰转化子基因组DNA的快速提取及验证 |
| 2.1.2.7 嗜热毁丝霉总RNA提取 |
| 2.1.2.8 RT-qPCR分析 |
| 2.1.3 纤维素酶活性的测定 |
| 2.1.3.1 FPA酶活的测定 |
| 2.1.3.2 CMC酶活的测定 |
| 2.1.3.3 PNP法测定BG和CBH酶活 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 干扰表达载体pUC19-siRNA-Mtdnmt1的构建 |
| 2.2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化及干扰转化子的筛选鉴定 |
| 2.2.3 2%微晶纤维素诱导培养后主要纤维素酶活性分析 |
| 2.2.4 2%微晶纤维素诱导后主要纤维素酶基因荧光定量分析 |
| 2.2.5 5% α-乳糖诱导培养后主要纤维素酶活性分析 |
| 2.2.6 5% α-乳糖诱导培养后主要纤维素酶基因荧光定量分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 RNA干扰嗜热毁丝霉Mtlae基因对纤维素酶活性及相关基因表达的影响 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 菌种 |
| 3.1.1.2 试剂及培养基 |
| 3.1.1.3 仪器设备 |
| 3.1.1.4 寡核苷酸引物 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 Mtlae寡核苷酸片段的设计与合成 |
| 3.1.2.2 SiRNA-Mtlae寡核苷酸片段的退火反应 |
| 3.1.2.3 pUC19-MtPpdc-MtTpdc质粒的提取及酶切 |
| 3.1.2.4 Mtlae基因干扰表达载体pUC19-siRNA-Mtlae的构建 |
| 3.1.2.5 嗜热毁丝霉原生质体制备与转化 |
| 3.1.2.6 干扰转化子基因组DNA提取及验证 |
| 3.1.2.7 嗜热毁丝霉总RNA提取 |
| 3.1.2.8 RT-qPCR分析 |
| 3.1.3 纤维素酶活性的测定 |
| 3.1.3.1 FPA酶活的测定 |
| 3.1.3.2 CMC酶活的测定 |
| 3.1.3.3 PNP法测定BG和CBH酶活 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 干扰表达载体pUC19-siRNA-Mtlae的构建 |
| 3.2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化及干扰转化子的筛选鉴定 |
| 3.2.3 2%微晶纤维素诱导培养后纤维素酶活性分析 |
| 3.2.4 2%微晶纤维素诱导后主要纤维素酶基因的荧光定量分析 |
| 3.2.5 5% α-乳糖诱导培养后纤维素酶活性分析 |
| 3.2.6 5% α-乳糖诱导培养后主要纤维素酶基因的荧光定量分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 指导教师对研究生学位论文的学术评语 |
| 答辩委员会决议书 |
（3）纤维水解辅助蛋白SwoⅠ的结构域功能及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 木质纤维素 |
| 1.1.1 纤维素 |
| 1.1.2 半纤维素 |
| 1.1.3 木质素 |
| 1.2 木质纤维素降解酶类 |
| 1.2.1 纤维素酶 |
| 1.2.2 半纤维素酶 |
| 1.2.3 木质素酶 |
| 1.3 纤维素降解辅助蛋白 |
| 1.3.1 碳水化合物结合模块(CBM) |
| 1.3.2 裂解性多糖单加氧酶(LPMO) |
| 1.3.3 植物扩张蛋白(Expansins) |
| 1.3.4 膨胀素(Swollenin) |
| 1.4 SwoⅠ结构域功能及应用 |
| 1.4.1 SwoⅠ结构域的研究 |
| 1.4.2 SwoⅠ结构域的应用 |
| 1.5 课题的立题背景和研究内容 |
| 1.5.1 立题背景 |
| 1.5.2 研究内容及技术路线图 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 菌株和质粒 |
| 2.1.4 主要培养基 |
| 2.1.5 主要溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学方法分析蛋白 |
| 2.2.2 目的基因的获取 |
| 2.2.3 重组质粒的构建 |
| 2.2.4 毕赤酵母表达菌株的筛选 |
| 2.2.5 蛋白的纯化与透析 |
| 2.2.6 SwoⅠ结构域的作用及协同性研究 |
| 2.2.7 融合蛋白的酶学性质及水解特性 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 SDS-PAGE分析 |
| 2.3.2 蛋白质浓度测定 |
| 2.3.3 DNS法测定还原糖 |
| 2.3.4 内切纤维素酶酶活测定 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 蛋白生物信息学分析 |
| 3.1.1 SwoⅠ编码基因密码子优化 |
| 3.1.2 SwoⅠ结构分析与预测 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 SwoⅠ结构域克隆表达及协同活性分析 |
| 3.2.1 里氏木霉总RNA的提取 |
| 3.2.2 SwoⅠ结构域与内切纤维素酶编码基因的克隆 |
| 3.2.3 SwoⅠ结构域与内切纤维素酶重组载体的构建与验证 |
| 3.2.4 SwoⅠ结构域与内切纤维素酶酵母转化子的转化与验证 |
| 3.2.5 SwoⅠ结构域与内切纤维素酶的诱导表达及分析 |
| 3.2.6 SwoⅠ结构域蛋白功能研究 |
| 3.2.7 小结 |
| 3.3 融合蛋白克隆表达及活性分析 |
| 3.3.1 融合基因的获取 |
| 3.3.2 融合蛋白重组载体的构建与验证 |
| 3.3.3 融合蛋白毕赤酵母的转化与验证 |
| 3.3.4 融合蛋白的诱导表达及表达产物分析纯化 |
| 3.3.5 融合蛋白酶学性质及水解特性 |
| 3.3.6 小结 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 硕士在读期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
| 附录 |
（4）芒果炭疽病菌两个葡聚糖酶基因的表达分析及CgCBH1致病相关功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 我国芒果产业现状 |
| 1.2 芒果炭疽病研究概况 |
| 1.2.1 症状特点 |
| 1.2.2 病原菌 |
| 1.2.3 病害侵染途径 |
| 1.2.4 防治 |
| 1.3 胶胞炭疽菌分子生物学研究概况 |
| 1.4 纤维素酶(cellulase)研究进展 |
| 1.4.1 外切葡聚糖酶基因 |
| 1.4.2 内切葡聚糖酶基因基因 |
| 1.5 杀菌剂氟啶胺的研究进展 |
| 1.6 本研究目的意义、主要研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 目的意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 供试药剂及试剂 |
| 2.1.2 供试品种与病原菌 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶活性和内切葡聚糖胞外酶活性测定 |
| 2.2.2 芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶活和内切葡聚糖酶与农药氟啶胺的关系 |
| 2.2.3 芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶基因CgCBH1和内切葡聚糖酶基因CgEG1B克隆分析 |
| 2.2.4 芒果炭疽病病原菌外切葡聚糖酶基因CgCBH1和内切葡聚糖酶基因CgEG1B全长序列扩增 |
| 2.2.5 CgCBH1和CgEG1B基因的序列分析 |
| 2.3 实时荧光定量分析CgCBH1和CgEG1B基因在芒果炭疽病菌侵染寄主过程中的表达情况 |
| 2.4 敲除鉴定外切葡聚糖酶基因CgCBH1的功能 |
| 2.4.1 CgCBH1基因敲除载体的构建 |
| 2.4.2 敲除突变体△CgCBH1的获得 |
| 2.5 突变体△CgCBH1中与侵染相关基因的表达分析 |
| 2.6 敲除突变体△CgCBH1的表型测定 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶活性和内切葡聚糖酶活性测定 |
| 3.2 芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶活性和内切葡聚糖酶活性与农药氟啶胺的关系 |
| 3.3 芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶基因克隆分析 |
| 3.3.1 芒果炭疽病菌A3菌株基因组DNA和RNA的提取 |
| 3.3.2 CgCBH1基因和CgEG1B基因的扩增 |
| 3.3.3 CgCBH1和CgEG1B基因序列分析 |
| 3.4 CgCBH1和CgEG1B在芒果炭疽病菌侵染台农芒嫩叶过程的表达分析 |
| 3.5 CgCBH1敲除突变体的获得及表型测定 |
| 3.5.1 CgCBH1基因敲除载体构建 |
| 3.5.2 敲除突变体△CgCBH1的获得 |
| 3.6 突变体△CgCBH1中致病相关基因表达分析 |
| 3.7 外切葡聚糖酶△CgCBH1突变体△CgCBH1表型测定 |
| 3.7.1 突变体△CgCBH1对潮霉素抗性的遗传稳定性检测 |
| 3.7.2 突变体△CgCBH1菌落、菌丝形态观察和生长速率测定 |
| 3.7.3 突变体△CgCBH1产孢量测定及孢子萌发观察 |
| 3.7.4 突变体△CgCBH1生长温度范围的测定 |
| 3.7.5 突变体△CgCBH1菌丝致死温度的测定 |
| 3.7.6 突变体△CgCBH1对pH条件的敏感性测定 |
| 3.7.7 碳源和氮源对突变体△CgCBH1菌丝生长的影响 |
| 3.7.8 突变体△CgCBH1对高渗胁迫条件敏感性的测定 |
| 3.7.9 突变体△CgCBH1抗氧化能力测定 |
| 3.7.10 突变体△CgCBH1黑色素含量测定结果 |
| 3.7.11 突变体△CgCBH1外切葡聚糖酶含量活性测定 |
| 3.7.12 突变体△CgCBH1对氟啶胺敏感性的测定 |
| 3.7.13 突变体△CgCBH1致病力测定 |
| 4. 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 外切葡聚糖酶基因CgCBH1和内切葡聚糖酶基因CgEG1B序列特征 |
| 4.1.2 外切葡聚糖酶基因CgCBH1致病相关功能 |
| 4.1.3 氟啶胺对芒果炭疽菌及其外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的影响 |
| 4.2 结论 |
| 4.2.1 确定芒果炭疽菌能产生外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶且受农药氟啶胺影响 |
| 4.2.2 芒果炭疽菌外切葡聚糖酶基因CgCBH1和内切葡聚糖酶基因CgEG1B的生物信息学和表达分析 |
| 4.2.3 获得芒果炭疽病菌外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除载体和敲除突变体 |
| 4.2.4 突变体△CgCBH1的表型表明外切葡聚糖酶基因CgCBH1有调控芒果炭疽病菌多个致病相关功能的作用 |
| 4.3 本研究创新点 |
| 4.4 后续研究 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 攻读硕士期间论文发表情况和受资助项目 |
| 致谢 |
（5）纤维素酶Cbh9A中关键残基功能及过程模式的分子动力学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 纤维素酶的结构功能简介 |
| 1.2 过程性外切酶的特点及功能简介 |
| 1.3 Cbh9A过程模式的四个阶段 |
| 1.4 主要的研究内容 |
| 第2章 理论基础和计算方法 |
| 2.1 分子对接 |
| 2.2 分子动力学模拟 |
| 2.3 拉伸分子动力学模拟 |
| 2.4 结合自由能计算 |
| 第3章 Tyr555和Trp678对Cbh9A持续水解能力影响的探究 |
| 3.1 热纤维梭菌纤维二糖水解酶简介 |
| 3.2 模拟体系的确立以及实验处理 |
| 3.2.1 初始结构的获得及处理 |
| 3.2.2 分子对接参数设置 |
| 3.2.3 常规分子动力学参数设置 |
| 3.2.4 拉伸分子动力学参数设置 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 对接结果验证 |
| 3.3.2 结构稳定性和构象分析 |
| 3.3.3 结合自由能计算结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 Cbh9A的拉伸分子动力学研究 |
| 4.1 模拟结构的获得与实验操作 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 拉伸劲度系数和拉伸速度的确定 |
| 4.2.2 拉伸分子动力学取样 |
| 4.3 本章小结 |
| 第5章 对Cbh9A的过程模式的探究 |
| 5.1 模拟结构的获得与实验操作 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.3 本章小结 |
| 参考文献 |
| 个人简介及科研成果 |
| 致谢 |
（6）真菌纤维素酶表观遗传修饰的研究进展（论文提纲范文）
| 1 真菌纤维素酶的种类与结构 |
| 2 真菌纤维素酶基因的表达调控机制 |
| 3 表观遗传修饰在真菌纤维素酶基因调控中的作用 |
| 3.1 DNA甲基化对纤维素酶表达的影响 |
| 3.2 蛋白甲基转移酶对纤维素酶表达的影响 |
| 3.3 组蛋白乙酰化、甲基化对纤维素酶表达的影响 |
| 3.4 非编码RNA研究 |
| 3.4.1 si RNA |
| 3.4.2 长链非编码RNA研究 |
| 4 展望 |
（7）纤维素酶的热保护及其固定化技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 纤维素 |
| 1.1.1 纤维素简介 |
| 1.1.2 纤维素结构 |
| 1.2 纤维素酶 |
| 1.2.1 纤维素酶简介 |
| 1.2.2 纤维素酶的组成 |
| 1.2.3 纤维素酶的结构 |
| 1.2.4 纤维素酶的作用机理 |
| 1.2.5 纤维素酶的应用 |
| 1.3 酶活性保护技术 |
| 1.3.1 化学修饰 |
| 1.3.2 蛋白质工程 |
| 1.3.3 酶的固定化 |
| 1.3.4 人工分子伴侣 |
| 1.4 固定化酶技术 |
| 1.4.1 固定化酶的方法 |
| 1.4.2 固定化酶的材料 |
| 1.5 选题目的及意义,课题主要内容 |
| 1.5.1 选题目的及意义 |
| 1.5.2 课题主要内容 |
| 第二章 人工分子伴侣PEG-g-PDMAEMA/PAAc体系的构建及其对纤维素酶活性的“开/关”调控和热保护作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.2 实验主要设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PEG-MA大分子单体的制备 |
| 2.3.2 聚合物PEG-g-PDMAEMA的制备 |
| 2.3.3 纤维素酶酶活力的测定 |
| 2.3.4 纤维素酶酶活力“开/关”调控 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 纤维素酶酶活力“开/关”系统的构建机制 |
| 2.4.2 聚合物PEG-g-PDMAEMA的表征 |
| 2.4.3 PEG-g-PDMAEMA/PAAc体系对酶活力的“开/关”调控 |
| 2.4.4 PEG-g-PDMAEMA/PAAc体系对纤维素酶的热保护作用 |
| 2.4.5 圆二色谱分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 UCST型聚合物PMAAc的制备及其“柔性”固定化纤维素酶的应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料及试剂 |
| 3.2.2 实验主要设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 UCST型聚合物PMAAc的制备 |
| 3.3.2 UCST型聚合物PMAAc浊点的测定 |
| 3.3.3 固定化纤维素酶的制备 |
| 3.3.4 纤维素酶固载量的测定 |
| 3.3.5 纤维素酶活力的测定 |
| 3.3.6 纤维素酶的固定化及应用 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 固定化纤维素酶的制备 |
| 3.4.2 UCST型共聚物PMAAc及其固定化纤维素酶的表征 |
| 3.4.3 纤维素酶固定化条件的优化 |
| 3.4.4 固定化纤维素酶酶学性质研究 |
| 3.4.5 游离及其固定化纤维素酶催化水解应用研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 金属有机框架材料Cu(PABA)的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶的应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料及试剂 |
| 4.2.2 实验主要设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 金属有机框架材料(Cu(PABA))的制备 |
| 4.3.2 固定化酶β-G@Cu(PABA)的制备 |
| 4.3.3 酶的固载量测定 |
| 4.3.4 β-葡萄糖苷酶活力的测定 |
| 4.3.5 固定化酶β-G@Cu(PABA)催化水解应用 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 固定化酶β-G@Cu(PABA)的制备 |
| 4.4.2 金属有机框架材料(Cu(PABA))及其固定化酶β-G@Cu(PABA)性质的表征 |
| 4.4.3 β-葡萄糖苷酶的固定化条件优化 |
| 4.4.4 固定化酶β-G@Cu(PABA)的酶学性质 |
| 4.4.5 游离β-G及固定化酶β-G@Cu(PABA)的催化水解应用研究 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 课题总结及展望 |
| 5.1 课题研究总结 |
| 5.2 课题研究创新点 |
| 5.3 课题研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间学术论文发表情况 |
（8）纤维素酶的研究进展及其展望（论文提纲范文）
| 1 纤维素酶的分类 |
| 2 纤维素酶的结构 |
| 2.1 CBD的结构[4] |
| 2.2 CD的结构[6] |
| 2.3 Linker的结构 |
| 3 纤维素酶的作用机理 |
| 3.1 C1-Cx假说[9] |
| 3.2 顺序作用假说[10] |
| 3.3 协同作用假说[11] |
| 3.4 对作用机理的讨论 |
| 3.4.1 CBH是纤维素酶的主要成分 |
| 3.4.2 EG是纤维素酶的主要成分[14] |
| 3.4.3 EG和CBH必须合作才能完成功能 |
| 4 纤维素酶在生物燃料上的应用的障碍及克服 |
| 4.1 耐盐性 |
| 4.2 水解木聚糖 |
| 4.3 纤维素酶更易获得且更便宜 |
| 4.4 减少纤维素酶的使用量 |
| 5 展望 |
（9）粗糙脉孢菌三种CBH基因突变菌株的构建及表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 粗糙脉孢菌 |
| 1.2 纤维素酶的来源及研究进展 |
| 1.2.1 细菌纤维素酶 |
| 1.2.2 放线菌纤维素酶 |
| 1.2.3 真菌纤维素酶 |
| 1.3 纤维素酶的结构及作用机制 |
| 1.3.1 纤维素酶的结构 |
| 1.3.2 纤维素酶的组成及作用机制 |
| 1.4 外切纤维素酶及其研究进展 |
| 1.4.1 外切纤维素酶 |
| 1.4.2 粗糙脉孢菌外切纤维素酶 |
| 1.5 课题研究的目的意义及技术路线 |
| 1.5.1 课题研究的目的与意义 |
| 1.5.2 本研究技术路线图 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株及载体 |
| 2.1.2 主要药品及试剂 |
| 2.1.3 培养基及常用试剂的配制 |
| 2.1.4 仪器和设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 粗糙脉孢菌基因组 DNA 的提取 |
| 2.2.2 双基因缺失菌株的构建 |
| 2.2.3 三基因缺失菌株的构建 |
| 2.2.4 目的基因的获得 |
| 2.2.5 无缝克隆构建载体 |
| 2.2.6 电穿孔转化粗糙脉孢菌4200 his~-缺失菌株 |
| 2.2.7 外切葡聚糖酶的Western blotting检测 |
| 2.2.8 基因突变菌株生长表型 |
| 2.2.9 基因突变菌株纤维素酶活性比较 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 双基因缺失菌株的构建 |
| 3.1.1 cbh-1和cbh-2 双基因缺失菌株的构建 |
| 3.1.2 cbh-1和gh6-3 双基因缺失菌株的构建 |
| 3.1.3 cbh-2和gh6-3 双基因缺失菌株的构建 |
| 3.2 三基因缺失菌株的构建 |
| 3.2.1 PCR鉴定cbh-1与cbh-2 双基因缺失菌株接合型 |
| 3.2.2 cbh-1、cbh-2和gh6-3 三基因缺失菌株的PCR鉴定 |
| 3.3 三种CBH基因过表达载体的构建及表达 |
| 3.3.1 载体线性化 |
| 3.3.2 三种CBH基因基因片段的获得 |
| 3.3.3 三种CBH基因阳性克隆子的酶切鉴定 |
| 3.3.4 粗糙脉孢菌CBH的基因载体 |
| 3.3.5 粗糙脉孢菌三种CBH蛋白Western blotting结果 |
| 3.4 基因突变菌株生长表型及酶活性分析 |
| 3.4.1 基因突变菌株生长表型 |
| 3.4.2 基因突变菌株纤维素酶活性 |
| 第4章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）纤维二糖水解酶Ⅰ的系统进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 纤维素 |
| 1.1.1 纤维素的结构 |
| 1.1.2 纤维素的降解 |
| 1.2 纤维素酶 |
| 1.2.1 纤维素酶的分类 |
| 1.2.2 纤维素酶的作用机制 |
| 1.3 纤维二糖水解酶Ⅰ |
| 1.3.1 纤维二糖水解酶Ⅰ的催化结构域 |
| 1.3.2 纤维二糖水解酶Ⅰ的纤维素结合域 |
| 1.3.3 纤维二糖水解酶Ⅰ的连接桥 |
| 1.4 CBHI编码基因的进化分析 |
| 1.4.1 基因的发生和进化 |
| 1.4.2 基因进化的研究方法 |
| 1.5 研究背景、目的和意义 |
| 第二章 数据来源与研究方法 |
| 2.1 数据来源 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 分离鉴定CBHI编码基因 |
| 2.2.2 CBHI编码基因比对分析和构建系统进化树 |
| 第三章 研究结果和讨论 |
| 3.1 研究结果 |
| 3.1.1 CBHI编码基因的筛选 |
| 3.1.2 CBHI编码基因比对及序列位点分析 |
| 3.1.3 CBHI编码基因序列最优替代模型 |
| 3.1.4 系统发育树构建 |
| 3.1.5 GH7-CBMl-CBHI编码基因的替代速率 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 CBHI编码基因特征序列的选择 |
| 3.2.2 数据与系统进化树分析 |
| 3.2.3 CBHI在自然界的分布 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBHI)的纤维素结合结构域及其链结区非水解性破坏纤维素结晶区结构(英文)（论文参考文献）
- [1]内蒙古草原纤维素分解菌的筛选及秸秆乙醇发酵[D]. 王明. 扬州大学, 2021(08)
- [2]RNA干扰嗜热毁丝霉Mtdnmt1及mtlae基因对纤维素酶活性及相关基因表达的影响[D]. 郑春娟. 深圳大学, 2020(10)
- [3]纤维水解辅助蛋白SwoⅠ的结构域功能及应用[D]. 郭高杰. 天津科技大学, 2019(07)
- [4]芒果炭疽病菌两个葡聚糖酶基因的表达分析及CgCBH1致病相关功能鉴定[D]. 吴秋玉. 海南大学, 2019
- [5]纤维素酶Cbh9A中关键残基功能及过程模式的分子动力学研究[D]. 韩菲. 吉林大学, 2018(04)
- [6]真菌纤维素酶表观遗传修饰的研究进展[J]. 郑春娟,邓婷婷,来亚鹏,刘刚,王娟. 纤维素科学与技术, 2018(03)
- [7]纤维素酶的热保护及其固定化技术研究[D]. 万靖. 江苏大学, 2018(03)
- [8]纤维素酶的研究进展及其展望[J]. 张丹. 青海畜牧兽医杂志, 2017(03)
- [9]粗糙脉孢菌三种CBH基因突变菌株的构建及表达[D]. 李珊珊. 黑龙江大学, 2016(05)
- [10]纤维二糖水解酶Ⅰ的系统进化分析[D]. 陈笑笑. 南京大学, 2013(07)