一、乳酸菌制备CLA的研究（论文文献综述）
陈洋[1]（2021）在《产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎的缓解作用及机制研究》文中研究指明炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病;主要特点是肠黏膜炎症,临床反应严重且复发频繁。但长期使用传统药物（布尼奈德、5-氨基水杨酸和氢化可的松）可能引起骨质疏松、糖尿病、高血压等副作用,从而影响治疗效果。新的治疗方法如单克隆抗TNF-α、益生菌、益生元、不饱和脂肪酸等代替传统药物治疗炎症性肠病,可以调节肠道微生物,干扰宿主免疫反应。尽管益生菌调节肠道屏障、缓解结肠炎的作用已被大量研究证实,但是关于益生菌缓解结肠炎的物质基础、量效关系、调节机制和临床效果的研究十分有限。基于此背景,本文研究了产共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）双歧杆菌对溃疡性结肠炎的缓解作用,研究了效果最佳的双歧杆菌缓解结肠炎的物质基础和作用靶点,并从肠道免疫和机械屏障方面探究其缓解结肠炎机制及量效关系。主要研究结果如下:首先,研究了不同产CLA双歧杆菌缓解结肠炎的差异及CLA与缓解结肠炎效果之间的关系。利用DSS构建结肠炎小鼠模型,通过灌胃短双歧杆菌、长双歧杆菌和假小链双歧杆菌3个种共15株产CLA双歧杆菌,以小鼠病理特征为指标筛选有效的菌株,比较差异以分析缓解结肠炎和产CLA的关联性。结果显示,短双歧杆菌CCFM683、短双歧杆菌BJCP1M6、长双歧杆菌CCFM681、假小链双歧杆菌MY40C和假小链双歧杆菌CCFM680均可显着抑制肠炎小鼠的DAI指数升高,阻止结肠缩短,改善病理评分,缓解结肠炎;而其余10株产CLA双歧杆菌则无明显的改善作用。进一步分析发现,结肠CLA浓度与缓解结肠炎的效果呈极显着正相关,表明CLA可能是这些菌缓解结肠炎的重要物质。其次,以短双歧杆菌CCFM683为例,探究了产CLA双歧杆菌缓解结肠炎的物质基础和作用靶点。通过死菌与活菌、基因敲除和回补菌研究了产CLA双歧杆菌缓解结肠炎的物质基础。结果发现,短双歧杆菌CCFM683死菌干预对结肠炎无缓解效果;产CLA的亚油酸异构酶基因敲除菌CCFM683Δbbi对结肠炎无显着改善,而该基因的回补菌CCFM683Δbbi:bbi与原始短双歧杆菌CCFM683相似,对结肠炎小鼠具有显着的缓解作用,表明CLA是短双歧杆菌CCFM683缓解结肠炎的关键物质。此外,PPAR-γ抑制剂作用于短双歧杆菌CCFM683干预的结肠炎小鼠后,缓解结肠炎效果显着降低,表明PPAR-γ是短双歧杆菌CCFM683缓解结肠炎的重要靶点。进一步通过细胞、分子和免疫等手段,从肠道免疫屏障和机械屏障探究了产CLA短双歧杆菌CCFM683缓解结肠炎机制。结果表明,短双歧杆菌CFM683通过产CLA上调PPAR-γ,抑制NF-κB信号通路,下调促炎细胞因子TNF-α和IL-6,从而调节肠道免疫屏障;同时激活GPR40-ERK-MEK信号通路,上调结肠紧密连接蛋白,调节凋亡关键蛋白Bad和Bcl-2,缓解结肠上皮细胞凋亡和改善结肠上皮屏障;此外,还可通过关键物质CLA促进杯状细胞分泌MUC2,保护肠道黏液层,阻止肠腔微生物向结肠上皮迁移。因此,短双歧杆菌CCFM683通过关键物质CLA激活受体GPR40,上调PPAR-γ后抑制NF-κB信号通路,同时激活ERK-MEK信号通路,分别达到调节肠道免疫和机械屏障,而缓解结肠炎。进一步利用不同浓度的关键物质CLA和短双歧杆菌CCFM683作用于结肠炎小鼠,研究其量效关系。结果表明,关键物质CLA以剂量依赖的方式通过抑制促炎细胞因子、改善肠道屏障缓解结肠炎。进一步研究短双歧杆菌CCFM683的量效,结果表明1010CFU/天和109 CFU/天的短双歧杆菌CCFM683干预对小鼠结肠炎均有显着缓解作用,而剂量低于108 CFU/天时,无显着缓解效果。此外,短双歧杆菌CCFM683灌胃剂量与结肠炎缓解效果显着正相关,呈现出明显的S型量效曲线,灌胃剂量超过108.65CFU/天时对结肠炎具有显着的缓解效果。
黄周群[2]（2021）在《含共轭脂肪酸的发酵核桃乳的研究》文中研究指明随着人们生活质量的日益改善和食品行业的迅猛发展,人们的饮食消费喜好逐渐趋向绿色健康、保健营养的功能性食品,富含功能性共轭脂肪酸的发酵核桃乳正好符合人们的需求。目前核桃乳饮料的研究仅限于改良产品配方和优化加工工艺,其对生物活性的探究及具体营养功能的开发较少,没有充分发挥出核桃的资源优势和营养保健功效。而且发酵核桃乳的风味、稳定性和营养功能的问题,也给产品开发带来了一定的挑战。本研究旨在研发一款富含共轭脂肪酸的稳定性及风味良好的功能性发酵核桃乳。（1）首先研究不同菌株在不同料水比的核桃乳中的生长特性,将七株在MRS上具有较高共轭脂肪酸转换能力的益生菌分别接种到不同料水比的核桃乳中,根据p H值以及活菌数,初步筛选出植物乳杆菌ZS2058、干酪乳杆菌FZSSZ3-L1、鼠李糖乳杆菌JSWX-3L-2和短双歧杆菌CCFM683这四株菌进行核桃乳的发酵,并确定料水比为1:5。通过研究不同的酶解条件、发酵时间以及游离脂肪酸含量对发酵核桃乳中共轭脂肪酸含量的影响,发现只有短双歧杆菌CCFM683发酵的核桃乳中产生了共轭脂肪酸,且当脂肪酶添加量为60 U/m L,37℃水解3 h,巴氏杀菌后接种CCFM683,发酵20 h左右,此时共轭脂肪酸含量最高达到2.30 mg/m L,其中CLA约1.29 mg/m L,而CLNA约1.01 mg/m L。（2）以乳化稳定系数和离心沉淀率为指标,由单因素实验得到果胶、结冷胶和CMC对核桃乳体系有一定的稳定作用。通过正交试验得到,在CMC添加量0.6%,果胶添加量0.04%,结冷胶添加量0.02%的优化条件下,乳化稳定系数和离心沉淀率分别是以前的1.13倍和0.91倍,发酵核桃乳的稳定性较好。（3）通过挥发性风味物质及其脂肪酸组成的测定,分析添加不同的质量分数和不同种类抗氧化剂发酵核桃乳在贮藏过程中的风味品质变化。添加0.016%的维生素E作为抗氧化剂,能够抑制油酸的氧化,而且亚油酸、亚麻酸氧化产生的挥发性凤风味物质的含量,相对于其他抗氧化剂,也明显降低,发酵核桃乳饮料的脂肪氧化问题有所改善。（4）结合表观喜好度、气味喜好度、滋味喜好度和质地喜好度这4个感官属性进行感官评价,添加0.075%的核桃香精和10%白砂糖的发酵核桃乳的总体喜好度最高,达到5.8分,此时的产品呈灰白色,质地均匀,酸甜可口,兼具核桃香味和发酵风味。（5）通过加速实验,测定发酵核桃乳在不同贮藏温度下的感官、粘度、粒径和离心沉淀率,离心沉淀率与感官评分的相关系数相对较高,从而建立离心沉淀率为指标的发酵核桃乳货架期预测模型,推算出本成品在常温贮藏下的货架期为186 d。
李秀清[3]（2021）在《重组酵母菌生物合成共轭亚油酸单体的研究》文中指出共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是一组具有共轭双键的十八碳二烯酸的统称,其中最具生理活性的两种同分异构体为c9,t11-CLA和t10,c12-CLA,且两种同分异构体分别具有不同的生理功能。目前化学合成的CLA多为多种同分异构体的混合物,随着对共轭亚油酸单体的研究逐渐深入,近年来CLA单一异构体的生物合成受到广泛关注。生物合成法中原始菌发酵产量较低且培养条件严格,而利用基因工程将CLA合成相关基因进行异源表达可以解决原始菌发酵存在的一些问题。来源于短双歧杆菌CCFM 683的亚油酸异构酶（Bifidobacterium breve isomerase,BBI）是目前报道的细菌中唯一序列已知的能够通过单酶催化合成c9,t11-CLA的亚油酸异构酶,BBI在异源表达过程中存在表达量过低的问题,为解决上述问题,本文将构建不同的BBI重组菌,探究了BBI表达的宿主菌及表达形式,为生物法合成c9,t11-CLA单体提供了研究基础。来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶（Propionibactereium acnes isomerase,PAI）能够通过单酶催化合成t10,c12-CLA,PAI在异源表达过程中主要存在易形成包涵体、表达量低的问题,本文将构建PAI分泌表达重组菌及可溶性表达重组菌,这为实现PAI的高效表达提供了新的方向。本文的主要研究结果如下:1.为实现BBI的高效表达,分别构建BBI酿酒酵母重组菌及毕赤酵母重组菌。分析各重组菌的蛋白表达水平及酶活水平,确定了BBI最适宿主菌及最适His-tag位置,探究了其静息细胞合成c9,t11-CLA的能力及BBI的粗酶酶学特性。首先,以酿酒酵母为宿主菌,构建了酿酒酵母BBI重组菌,对重组菌进行蛋白表达水平分析,未检测到特异性条带,对重组菌进行活性检测,检测到底物转化率仅为5.12%。说明BBI在酿酒酵母中实现异源表达且具有催化活性,但蛋白表达量极低。其次,以毕赤酵母为宿主菌,成功构建了三株不同形式的毕赤酵母BBI重组菌,分析不同重组菌的蛋白表达水平及酶活水平,发现毕赤酵母适合BBI异源表达,其中C端带有His-tag的重组菌目的蛋白表达量最高且酶活性最高。以毕赤酵母BBI重组菌静息细胞作为催化剂,添加25g/L的亚油酸（Linoleic acid,LA）、反应3 h后,c9,t11-CLA的产量为15.88 g/L,转化率可达63.50%,这是目前研究报道利用静息细胞产c9,t11-CLA单体的最高产量。对毕赤酵母BBI重组菌的粗酶酶学特性进行研究,结果表明BBI的最适反应温度为37℃,最适p H为8.0,而不同温度条件下,酶稳定性有明显差异;且多数金属离子对酶活存在不同程度的抑制作用。2.为实现PAI的高效表达,以毕赤酵母为宿主菌,分别构建了PAI分泌表达重组菌及可溶性表达重组菌。分析了重组菌蛋白表达水平及酶活水平,得到了一株可溶性表达PAI的重组菌,并进一步优化其蛋白表达水平,探究了重组菌静息细胞催化生成t10,c12-CLA能力。首先,构建了带有α因子信号肽的PAI毕赤酵母分泌表达重组菌株。对重组菌的蛋白表达水平进行分析,发现PAI重组蛋白未表达,对重组菌的蛋白活性进行检测,并未检测到t10,c12-CLA的生成,结果表明PAI未实现在毕赤酵母中的分泌表达。其次,构建了PAI胞内可溶性表达毕赤酵母重组菌,对重组蛋白表达水平及活性进行分析,发现PAI实现了异源表达且具有活性。进一步对重组菌进行蛋白表达水平的优化,得到最佳诱导时间为24 h、最佳诱导剂甲醇体积分数为2%,以重组菌静息细胞作为全细胞催化剂,添加25 g/L的LA、反应40 h后,t10,c12-CLA的产量为8.39 g/L,转化率可达33.56%。
侯艳茹[4]（2021）在《饲养方式对苏尼特羊肌纤维特性和肉品质的影响及其机理研究》文中提出本试验以放牧和圈养两种饲养方式下的苏尼特羊为研究对象,分析了其屠宰性能、肉品质指标和基本营养成分的差异性,并利用ATPase染色法、实时荧光定量和TMT差异蛋白组学技术对肌纤维特性及其影响机制进行了研究,最后通过在日粮中添加亚麻籽、乳酸菌或增加运动量三种方式对圈养苏尼特羊的肌纤维特性进行调控,结果如下:对不同饲养方式下苏尼特羊屠宰性能、肉品质和基本营养成分进行测定,结果显示,放牧组的胴体深显着高于圈养组（P<0.05）,胴体重、胴体长、屠宰率、净肉率、胴体肉骨比显着低于圈养组（P<0.05）。放牧组背最长肌和股二头肌的p H24和剪切力值、背最长肌的L*和粗脂肪含量、股二头肌的灰分含量均显着低于圈养组（P<0.05）,股二头肌的a*和b*显着高于圈养组（P<0.05）。这说明放牧羊的嫩度和色泽优于圈养羊,屠宰性能低于圈养羊。对肌纤维特性进行测定,发现放牧组背最长肌和股二头肌中MyHCⅠ和MyHCⅡx m RNA表达量、MDH和SDH的酶活力均显着高于圈养组（P<0.05）,背最长肌的肌纤维密度、ⅡA型肌纤维的数量比例和面积比例以及股二头肌中Ⅰ型肌纤维的数量比例和面积比例均显着高于圈养组（P<0.05）,背最长肌的LDH酶活力和股二头肌中ⅡB型肌纤维的数量比例显着低于圈养组（P<0.05）。这说明,放牧组氧化型肌纤维比例高,酵解型肌纤维比例低,肌肉的有氧代谢能力强。探究不同饲养方式下苏尼特羊肌纤维特性存在差异的原因,结果发现,放牧组背最长肌和股二头肌中AMPKα2、Sirt1、MEF2C和COXⅣm RNA表达量显着高于圈养组（P<0.05）。TMT差异蛋白组学分析显示,两种饲养方式下背最长肌和股二头肌中共鉴定到123个差异蛋白,其中61个差异蛋白上调,62个差异蛋白下调。放牧组中,与慢肌纤维（氧化型肌纤维）相关的MYL3、MYH7、TNNC1、TNNI1、TNNT1蛋白表达量显着上调;与氧化代谢相关的NDUFB8和SDHB蛋白表达量显着上调;与糖酵解代谢相关的ALDOB和ALDOC蛋白表达量显着下调;与肌纤维类型转化相关的Ca N蛋白在Ca2+信号途径中显着上调。以上试验结果说明,饲养方式主要通过氧化磷酸化途径、糖酵解/糖异生途径影响肌肉的代谢类型,通过Ca2+信号途径影响肌纤维的结构和收缩等功能特性,通过Ca2+信号途径和AMPK信号途径影响肌纤维类型的转化。对改善圈养苏尼特羊肉用品质的技术进行研究,结果显示,日粮添加亚麻籽和乳酸菌都可以提高圈养苏尼特羊背最长肌中氧化型肌纤维的比例,增强肌肉的有氧代谢能力,提高肌肉的嫩度;增加圈养苏尼特羊的运动量,提高了I型肌纤维的直径和横截面积,降低了肉的色泽和嫩度,延缓了p H的下降速率。以上结果说明,日粮营养对肌纤维特性的改变以及肉品质的提高更加有效,可以通过在圈养羊的日粮中添加亚麻籽或乳酸菌来改善圈养羊肉品质。
王磊[5]（2021）在《酸乳用乳酸菌的筛选与应用研究》文中研究指明目前随着人们对生活水平要求的提高,对发酵乳制品的消费水平逐年提高,发酵乳制品的产量以25%年平均增量快速上升。在此背景下,市场对酸乳发酵剂的需求量也将大幅度增加。我国90%以上的酸乳发酵剂来自于国外,国外发酵剂生产企业都建立了自己的乳酸菌资源库,但我国拥有自主知识产权的酸乳发酵剂很少,因此,筛选出优良的酸乳用乳酸菌,并研制具有自主知识产权的酸乳发酵剂,具有重要的经济和社会价值。本论文针对酸乳发酵剂需求,以嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种等重要酸乳用乳酸菌为研究对象,建立乳酸菌菌株发酵相关特性数据库,为行业生产提供基础数据参考,同时开发出具有自主知识产权的酸乳发酵剂,为国内酸乳发酵剂生产提供指导和菌种资源。对筛选得到乳酸菌安全性进行初步评估,为国内乳酸菌安全性评估方法制定提供一些数据参考。主要研究如下:（1）酸乳用乳酸菌的分离与鉴定及部分安全性评价。从传统发酵制品中共分离得到268株菌株,通过16S rDNA测序共鉴定出3个属8个种,其中嗜热链球菌65株、德氏乳杆菌保加利亚亚种24株、植物乳杆菌13株、鼠李糖乳杆菌19株、瑞士乳杆菌2株、罗伊氏乳杆菌1株、嗜酸乳杆菌4株、副干酪乳杆菌4株;以分离得到的65株嗜热链球菌和24株德氏乳杆菌保加利亚亚种作为供试菌株进行初步的安全性评价。试验结果表明:89株供试菌株对临床使用率较高的12种抗生素均呈现不同程度的耐药性,其中,青霉素33.71%、复方新诺明31.46%、链霉素28.09%、氨苄西林28.09%、环丙沙星21.35%,同时49.44%（44/89）的菌株具有多重耐药性,其中嗜热链球菌对12种抗生素的多重耐药性（30.23%）显着低于德氏乳杆菌保加利亚亚种（100%）;89株供试菌株的氨基酸脱羧酶、硝基还原酶、偶氮还原酶、溶血活性的检测均为阴性,均未检测到不良代谢产物。（2）具有优良加工特性酸乳用乳酸菌的筛选。以分离得到的65株嗜热链球菌和24株德氏乳杆菌保加利亚亚种作为供试菌株进行加工特性测试。试验结果表明:89株供试菌株发酵乳产酸速率有所不同。65株嗜热链球菌发酵乳发酵完成时的酸度在32.13-83.08°T之间,其中酸度大于80°T的有2株,酸度在70-80°T的有16株,有20株嗜热链球菌菌株后酸化小于10°T。发酵时间在3.18-8.33 h之间。黏度在134.73-33277.77 mPa.s之间,其中黏度高于5000 mPa.s有10株,具有较好的产黏能力。持水力在30.75-100.00%之间,其中持水力高于90%有7株,持水力在75-90%之间的有8株,具有较好的组织稳定性。双乙酰和乙醛含量分别在2.84-15.71 mg/L、7.04-53.90mg/L之间。大多数嗜热链球菌发酵16 h后pH值最低接近4.0,酸度在100°T左右且保持相对稳定;德氏乳杆菌保加利亚亚种的产酸能力普遍高于嗜热链球菌,其中菌株KDB-1、HDS-12、DDB-14、HDS-18发酵48 h后酸度可达到200°T以上,具有较好的产酸能力;24株德氏乳杆菌保加利亚亚种的酸度在43.59-76.34°T之间,发酵时间在6.28-17.34 h之间,有5株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株发酵时间超过了 10h,发酵时间普遍高于嗜热链球菌。黏度和持水力分别在100.01-1466.67 mPa.s、19.82-52.72%之间,产黏能力较弱,产黏能力普遍低于嗜热链球菌。双乙酰和乙醛含量分别在1.82-5.69 mg/L、15.95-49.50 mg/L之间,具有较好的产香能力;89株供试菌株对6种致病菌均有一定的抑制能力,其中对革兰氏阴致病菌的抑制能力整体高于革兰氏阳性致病菌,德氏乳杆菌保加利亚亚种对6种致病菌的抑制能力普遍高于嗜热链球菌,有3株嗜热链球菌和16株德氏乳杆菌保加利亚亚种对6种致病菌均具有抑制能力,说明这些供试菌株对细菌具有广谱抑菌特性。（3）复合乳酸菌发酵酸乳贮藏期稳定性及其风味物质的研究。通过测定不同发酵特性嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种单菌株及复合菌株发酵酸乳的发酵性能、贮藏期间酸度、黏度、持水力及其风味物质变化,探究复合菌株发酵酸乳贮藏期稳定性。结果显示:嗜热链球菌HST-6、HST-9和德氏乳杆菌保加利亚亚种KDB-1复合发酵酸乳时产酸速率快,贮藏期14 d内,酸度、黏度和持水力分别为98.10°T、9498.33 mPa.s和98.51%,稳定性显着高于其它菌株（p<0.05）,同时产品感官评分最佳;通过SPME-GC-MS分析发现,3菌株复合发酵酸乳在贮藏期间主要挥发性风味化合物与单菌株发酵酸乳种类和数量存在一定差异。酸乳中共检测出108种挥发性化合物,主要包括醛类、酮类、酸类、酯类、醇类、芳香族、烷烃类等化合物,其中2-壬酮、2-庚酮、辛酸、乙偶姻、叔十六硫醇等风味物质在酸乳中最为丰富。3菌株复合发酵剂作为酸乳发酵剂具有潜在的工业应用前景。
陈科学,王欣,夏嘉祎,沈慧敏,嵇熠彬,张灏,杨波,陈卫[6]（2021）在《以葵花籽油为底物生物转化共轭亚油酸双歧杆菌的筛选》文中认为运用快速扫描法,筛选了10株可利用游离态亚油酸为底物高产共轭亚油酸的双歧杆菌菌株;然后以富含非游离态亚油酸的葵花籽油为底物,与初筛得到的高产菌株共培养后检测反应体系中共轭亚油酸的含量。结果表明,部分短双歧杆菌可将葵花籽油转化为共轭亚油酸,其中短双歧杆菌FFJND12M6的转化率最高,可达14.35%。
高鹤[7]（2020）在《双歧杆菌生物转化共轭亚油酸的机制研究》文中指出共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）因为具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效而对人体的健康具有重要作用。目前人们主要从乳制品和肉制品中获取CLA,但乳制品和肉制品中CLA的含量非常低,无法满足人们的营养健康需求。微生物被报道可以大量转化生成CLA,且微生物转化生成的CLA具有异构体单一、周期短等特点,可成为未来大量获取CLA的一个重要的途径,其中具备生物转化CLA能力的双歧杆菌由于其可以有效的促进宿主健康而备受关注。虽然已有大量文献证实了双歧杆菌具备生物转化CLA的能力,但双歧杆菌生物转化生成CLA的具体转化路径、功能基因及其调控机制却一直未被解析。为了阐述双歧杆菌生物转化CLA的路径及调控机制,本研究通过转录组学、基因外源表达、基因敲除等手段对其进行了系统的研究,旨在为高产CLA双歧杆菌的工业化应用提供理论依据和技术支持。本文首先对169株双歧杆菌生物转化CLA以及10-羟基-顺12-十八碳烯酸（10-HOE）的转化率进行了检测和比较,分析并总结了双歧杆菌生物转化CLA和10-HOE的种属规律,筛选得到了生物转化CLA产率最高的短双歧杆菌CCFM683。接着通过同位素13C标记法明确了双歧杆菌CCFM683生成CLA的具体转化途径。进一步通过转录组学、加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA）以及其他分子生物学技术确认了菌株生物转化CLA过程中的关键基因,并探究了该酶在菌株应对亚油酸胁迫过程中的具体作用形式。最后通过基因沉默等分子生物学技术明确了调控该过程关键基因转录的调控蛋白及其调控机制。本研究主要结果如下:（1）明确了双歧杆菌生物转化CLA及10-HOE的种属规律,并且确认了LA转化生成CLA和10-HOE的基本转化路径。首先通过比较169株来源于人体粪便的双歧杆菌生物转化生成CLA及10-HOE的转化率,结果显示短双歧杆菌生物转化CLA的能力最强,其次为假小链双歧杆菌、长双歧杆菌以及齿双歧杆菌,其中短双歧杆菌CCFM683的转化率最高（90.30%）。而两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、角双歧杆菌中未分离出具备生物转化CLA能力的菌株。此外,以上8个种的双歧杆菌均具备生物转化生成10-HOE的能力,其中以假小链双歧杆菌CCFM749的10-HOE转化能力最高（39.09%）。此外,本研究还发现LA及10-HOE均可作为短双歧杆菌CCFM683生物转化生成CLA的底物,其中LA可以直接转化生成CLA,而10-HOE需先经过亚油酸水合酶（MCRA）作用转化生成LA,LA再进一步转化生成CLA。（2）确认了短双歧杆菌CCFM683中催化CLA转化的关键基因为亚油酸异构酶基因。本文首先以稳定同位素13C标记的LA作为底物,并通过GC-MS对最终含有13C标记的生成物进行检测以进一步对其转化途径进行分析,研究结果发现CCFM683将LA转化生成CLA的过程中并未检测到其他中间产物,由此可确认LA转化生成CLA为单步反应。转录组学数据显示CCFM683转化LA生成CLA过程中基因的转录水平发生显着变化（p<0.05）;WGCNA结果显示编号为CCFM683GM001103,CCFM683GM001531的两个未知功能的基因可能是编码亚油酸异构酶的基因。而基因外源表达以及酶学实验结果显示编号为CCFM683GM001103的基因编码的蛋白（命名为短双歧杆菌亚油酸异构酶（Bifidobacterium breve isomerase,BBI））具有催化LA生成CLA的活性。BBI蛋白含有9个跨膜结构,该酶的功能是首次被报道,并且是目前细菌中唯一被报道的能够单酶催化LA生成cis9,trans11-CLA单体的亚油酸异构酶。此外,BBI蛋白只能利用游离态的LA作为底物转化生成CLA,而不能催化非游离态的LA生成CLA;并且该酶更倾向于利用诸如含有至少两个双键的LA、亚麻酸（Linolenic acid）等作为底物,而不能利用诸如油酸（Oleic acid,OA）、硬脂酸（Stearic acid,SA）等只含一个或不含双键的底物,且各底物的转化效率高低依次为α-亚麻酸（alpha-linolenic acid,ALA）>LA>γ-亚麻酸（gamma-linolenic acid,GLA）。（3）短双歧杆菌CCFM683中亚油酸异构酶（BBI）与亚油酸水合酶（MCRA）对于菌株耐受游离态LA的胁迫具有非常重要的作用。研究结果显示敲除亚油酸异构酶基因bbi会导致CCFM683在含LA（0.5 mg/m L）培养基中的生长受到明显抑制,而回补bbi基因会使菌株耐受LA的能力得以恢复。此外,沉默亚油酸水合酶基因mcra也会使菌株耐受LA的能力下降,以上结果表明亚油酸异构酶（BBI）及亚油酸水合酶（MCRA）在短双歧杆菌CCFM683应对游离LA胁迫过程中起到非常关键的作用。进一步我们通过差速离心获得不同部位的蛋白并结合免疫印迹法（western blot）证实了BBI蛋白存在于细胞质膜上,MCRA蛋白存在于细胞质中。通过分析短双歧杆菌CCFM683胞内外LA、CLA和10-HOE的动态变化,推测出亚油酸异构酶的催化过程可能是直接将胞外的LA转化生成CLA,而MCRA则可能是将渗入至细胞质内的LA转化生成了10-HOE。（4）短双歧杆菌CCFM683中转录调控蛋白Clg R同时调控亚油酸异构酶基因bbi以及亚油酸水合酶基因mcra的转录过程。研究结果显示过表达clgr基因可以同时提高短双歧杆菌CCFM683中bbi和mcra基因的转录水平,并提高菌株耐受游离态LA胁迫的能力。干扰clgr基因的转录会同时降低bbi以及mcra基因的转录水平,并降低菌株耐受游离态LA胁迫的能力。凝胶迁移实验（Electtrophoretic mobility shift assay,EMSA）结果进一步显示Clg R蛋白可以特异性结合bbi以及mcra上游调控序列,由此可见Clg R蛋白可以同时调控bbi以及mcra基因的转录。蛋白质二级结构分析显示Clg R蛋白共含有5个α螺旋,其中第4个α螺旋（N端至C端方向）负责与bbi和mcra基因上游序列的结合。bbi基因上游调控区域与Clg R蛋白结合的位点为G（7）--G---GCG-----TAG--CG--C（32）,而mcra基因上游调控区域与Clg R蛋白结合的位点为G（7）--G------GCACA------TAT----CG（34）。综上可知,转录调控蛋白Clg R可以直接调控短双歧杆菌CCFM683中中bbi以及mcra基因的转录以应对游离态LA对菌株的胁迫。（5）亚油酸异构酶（BBI）和亚油酸水合酶（MCRA）分别与双歧杆菌生物转化CLA和10-HOE能力之间存在关联性。生物信息学分析表明,能够生物转化CLA的短双歧杆菌、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、齿双歧杆菌中均存在BBI蛋白,但是含有BBI蛋白的菌株不一定都具备生物转化CLA的能力,比如短双歧杆菌AHWH9M5等;而不具备生物转化CLA能力的两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌及角双歧杆菌中均不存在BBI蛋白。同样的,双歧杆菌中MCRA蛋白与菌株生物转化10-HOE的能力存在关联性,生物信息学数据表明具备生物转化10-HOE能力的双歧杆菌中均存在MCRA蛋白,但是含有MCRA蛋白的菌株不一定具备生物转化10-HOE的能力。
张雁[8]（2020）在《短乳杆菌组成型表达载体的构建及其初步应用研究》文中研究指明短乳杆菌（Lactobacillus brevis）是乳杆菌属中的重要一员,是被公认为安全（generally recognized as safe,GRAS）的食品级微生物,已广泛应用于食品、医疗和养殖等行业。有关短乳杆菌功能和应用上的研究受到许多研究者们的关注,但是由于短乳杆菌的电转化效率很低、外源基因表达难度大以及可供选择的表达载体不多,有关它的基因改造鲜有报道。如果能构建合适的短乳杆菌表达载体,利用基因工程方法对其进行改造,将有利于充分发挥短乳杆菌的应用价值。本研究在乳酸乳球菌胞内蛋白表达载体p MG36e的基础上,以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因作为报告基因,从该载体自身启动子P32以及短乳杆菌CICC6239内源基因启动子Pslp A、Pslp、Pldha、Pgntk、Ppyk中筛选出可在短乳杆菌CICC6239中启动GFP表达的内源基因启动子,丙酮酸激酶基因的启动子(Ppyk),构建了短乳杆菌组成型表达载体p MG36B-Ppyk。在此基础上,本研究将来源于酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶基因（Sc GPD1和Sc GPD2）以及3-磷酸甘油酯酶基因（Sc GPP1和Sc GPP2）克隆至p MG36B-Ppyk载体中,初步探究4个单基因在短乳杆菌中的表达情况。结果显示,p MG36B-Ppyk-Sc GPD2和p MG36B-Ppyk-Sc GPP2成功转入,但仅有GPD2成功表达,酶活为19.8 m U/m L;而GPP2未测到酶活。此外,本研究以p MAD载体为基本骨架,将p MG36B-Ppyk载体的Ppyk表达盒克隆进p MAD骨架上,构建了p MAD-Ppyk-GFP、p MAD-Ppyk-Sc GPD1和p MAD-Ppyk-Sc GPP2质粒。但新构建的p MAD-Ppyk系列质粒未能成功电转化进入短乳杆菌细胞中。
王丹[9]（2020）在《LA诱导和醇胁迫对植物乳杆菌p-8 CLA转化率的影响及机制初探》文中进行了进一步梳理共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是多种含共轭双键的十八碳二烯酸类物质的总称,具有多种益于生物体的生理功效。研究发现,乳酸菌可以将亚油酸（linoleic acid,LA）转化并生成CLA。在该转化过程中,需要脂肪酸水合酶（Fatty acid hydratase,CLA-HY）、羟基脂肪酸脱氢酶（Hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH）、乙酰乙酸脱羧酶（Acetoacetate decarboxylase,CLA-DC）参与,还与烯酮还原酶（Enone reductase,CLA-ER）和烯醇化酶（Enolase,Eno）有关。本实验完成了 LA诱导和醇胁迫对植物乳杆菌p-8菌株CLA转化率的影响及机制初探的研究,为阐明植物乳杆菌p-8菌株产CLA的分子机制和寻找有效提高CLA生成的调控手段奠定了基础。实验得到以下结果和结论:1.植物乳杆菌p-8菌株具有较低的转化LA为CLA的能力,生成的CLA主要分布在发酵液中,有c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA三种异构体形式。但菌体中只有很少的t10,c12-CLA。2.LA浓度在0.01mg/mL～0.05mg/mL范围内,随LA浓度增加,发酵液中CLA三种异构体的转化率也增加,与CLA合成相关的五个酶基因cla-hy、cla-dh、cla-dc、cla-er和cla-eno的mRNA水平也增加。说明CLA的合成与CLA合成相关酶基因转录水平正相关。3.在培养基中添加LA的浓度为0.05mg/mL并分别用不同浓度甲醇和乙醇进行胁迫,在低于0.5%浓度胁迫时,均为随着浓度的增加,CLA的三种异构体转化率增加,但高于0.5%浓度,随着醇浓度的增加,CLA的三种异构体转化率却降低。CLA合成相关的5个酶基因的mRNA水平也均增加,但是在0.5%浓度胁迫是增加最多。说明一定浓度范围内的醇胁迫可以促进CLA的转化,也促进CLA合成相关酶基因的转录水平。
赵微[10]（2020）在《植物乳杆菌p-8合成CLA及CLA-HY和CLA-DH结构和功能关系的研究》文中研究表明共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸的位置和几何异构体的统称,具有抗癌、抗动脉粥样硬化和降脂等生理功效。利用生物法合成的CLA生物活性强且食用安全,是合成CLA的最佳选择。乳酸菌可以通过体内的共轭亚油酸水合酶（Conjugated linoleic hydratase,CLA-HY）、羟基脂肪酸脱氢酶（Hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH）和共轭亚油酸乙酰乙酸脱羧酶（CLA acetoacetate decarboxylase,CLA-DC）组成的亚油酸异构酶系将亚油酸（Linoleic acid,LA）转化为CLA,并且具有易于大规模培养和安全性高等优势。因此,开发可合成CLA的乳酸菌、研究其合成CLA的途径、探明亚油酸异构酶系的结构与功能的关系以及寻找提高CLA产率的途径对于实现生物法合成CLA工业化具有重要意义。植物乳杆菌p-8是内蒙古自治区特有的分离于传统发酵酸奶中的一株益生菌,其可以将LA异构化为CLA。本研究首先采用气相色谱法对植物乳杆菌p-8体内发酵催化LA及其天然酶和重组酶体外催化LA的产物进行分析,研究了该菌株合成CLA的能力、途径和异构体组成。其次,结合同源建模法、分子对接技术和氨基酸残基突变技术,分别对异源表达的植物乳杆菌p-8亚油酸异构酶系中的CLA-HY和CLA-DH的结构与功能的关系进行研究。论文的主要研究结果如下:（1）植物乳杆菌p-8在含有LA的MRS中培养后,分析发酵上清液以及菌体破碎液体外再催化LA后的脂肪酸,结果发现都有少量的3种CLA异构体出现,分别为 cis9,trans11-CLA（c9,t11-CLA）、trans10,cis12-CLA（t10,c12-CLA）和 trans9,trans11-CLA（t9,t11-CLA）;对发酵后的菌体进行脂肪酸分析,只发现极少量的t10,c12-CLA。利用大肠杆菌分别异源表达CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC后,将三个重组酶用于混合和分步体外催化LA,对各步反应产物中的脂肪酸组成进行分析,结果表明只有三个重组酶都存在且有黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin denine dinucleotide,FAD）、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen,NADH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）的辅助作用下,才可完成LA转化为3种CLA异构体;分步催化时,首先加入CLA-HY和FAD催化后产物中出现少量的10-羟基-顺12-十八碳烯酸（10-hydroxy-cis-12-octadecarenoic acid,10-HOE）和 t10,c12-CLA,再加入 CLA-DH和NAD+催化后产物出现了 10-氧代-顺12-十八碳烯酸,再加入CLA-DC和NADH催化后产物中出现了 c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA,最后再依次分步加入CLA-DH和CLA-HY进行催化,依然出现CLA的3种异构体,推断出该菌转化LA生成CLA的途径与植物乳杆菌AKU1009a一致。（2）以红串红球菌的油酸水合酶（Rhodococcus erythropolis oleate hydratase,OhyRe）的晶体结构为模板,同源建模分析CLA-HY的三维结构,发现CLA-HY属于肌球蛋白交叉反应抗原（Myosin cross reactive antigen,MCRA）蛋白超家族,其三维结构中包含三个结构域,N端是与FAD结合的Rossman折叠,对应于氨基酸序列GAGLSN（X）23D（10-45）。分析CLA-HY和植物乳杆菌ATCC8014的共轭亚油酸水合酶（Lactobacillus plantarum hydratase,LPH）分别与LA分子对接的结果,发现有2个位点共20个氨基酸残基与LA互作,有28个氨基酸残基与FAD结合有关。据此,用基因工程手段获得重组CLA-HY及其22个点突变体和2个缺失突变体,其中有4个突变体是包涵体形式,说明这4个突变位点Met 201、Leu 144、Ile 148和Met 149与CLA-HY的可溶性有关。重组CLA-HY可以将LA转化为10-HOE,其最适反应温度为35℃,最适反应缓冲体系是KPB缓冲液（20 mM,pH 6.0）。经酶活力分析发现CLA-HY-Y82F、△TGYVARGG和△SBS完全失去活力,说明Tyr 82是催化基团,并且这两段肽段对CLA-HY发挥活性至关重要。结合动力学参数、三维结构和分子对接的结果,进一步对CLA-HY和剩余的17个点突变体进行分析,结果表明Met204、Gly 74、Arg 75、Met76、Thr 185、Phe 186、His 399、His 403 和Trp 415与LA的结合密切相关,Gly 74与FAD的结合有关,Met 76与FAD的结合和LA的固定都有关。此外,CLA-HY-M204A可显着提高催化效率。（3）以瘤状伯克霍尔德菌的SDR蛋白晶体结构为模板,同源建模获得CLA-DH的三维结构,发现CLA-DH属于一个短链脱氢/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductase,SDR）蛋白超家族,CLA-DH单体的N端有该家族中高度保守的与NAD+/NADH结合的Rossman折叠,C端是特异的底物通道入口,同时具有该家族高度保守的催化四联体。将10-HOE和蓖麻油酸分别与CLA-DH进行分子对接并分析,结果显示,有一个由26个氨基酸残基组成的与10-HOE互作的位点,有一个由27个氨基酸残基组成的与蓖麻油酸互作的位点。据此,用基因工程手段获得重组CLA-DH及其28个点突变体,其中13个突变体是包涵体形式,说明CLA-DH的这 13 个突变位点 Pro 188、Thr 12、Gly 13、His 16、Phe 18、Asp 37、Asp 63、Ala 91、Gly 92、Ile 113、Val 141、Lys 160 和 Phe 190 与 CLA-DH 的可溶性有关。以蓖麻油酸为底物时,重组CLA-DH的最适反应温度为45℃,最适反应缓冲体系是KPB缓冲液（20 mM,pH 6.0）。结合动力学参数、三维结构和分子对接的结果,进一步对CLA-DH和剩余的15个点突变体进行分析,结果表明CLA-DH的Ser 143是与CLA-DH 催化相关的氨基酸残基,CLA-DH 的Ile 38、Asn 90、Ile 93、Thr 193 和 Val 229是与蓖麻油酸的结合相关的氨基酸残基,Tyr 156与底物的结合和酶的催化均有关。CLA-DH-N90G、CLA-DH-I93S、CLA-DH-Y156G、CLA-DH-T193A 和CLA-DH-V229D 5个突变体的催化效率显着提升,而CLA-DH-I38S和CLA-DH-S143A催化效率和酶的比活力显着下降。
二、乳酸菌制备CLA的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳酸菌制备CLA的研究（论文提纲范文）
（1）产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎的缓解作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 炎症性肠病概述 |
| 1.1.1 炎症性肠病的分类及典型症状 |
| 1.1.2 炎症性肠病的发病机制 |
| 1.1.3 炎症性肠病的干预及治疗 |
| 1.1.4 炎症性肠病与肠道屏障 |
| 1.2 益生菌对肠道屏障的调节作用 |
| 1.2.1 益生菌调节肠道机械屏障缓解结肠炎 |
| 1.2.2 益生菌调节肠道免疫屏障缓解结肠炎 |
| 1.2.3 益生菌调节肠道生物屏障缓解结肠炎 |
| 1.3 共轭亚油酸及产共轭亚油酸乳酸菌对炎症性肠病的作用 |
| 1.3.1 共轭亚油酸对炎症性肠病的调节作用 |
| 1.3.2 产共轭亚油酸乳酸菌对炎症性肠病的调节作用 |
| 1.4 立题背景及依据 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎的缓解作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器及设备 |
| 2.2.3 实验动物及饲料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 双歧杆菌菌液制备 |
| 2.3.2 动物实验设计 |
| 2.3.3 体重、DAI指数和结肠长度的测定 |
| 2.3.4 H&E染色及病理评分 |
| 2.3.5 结肠组织PAS染色 |
| 2.3.6 结肠组织阿利新蓝染色 |
| 2.3.7 Hoechst细胞凋亡染色 |
| 2.3.8 结肠组织免疫组化染色实验 |
| 2.3.9 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.3.10 脂肪酸测定 |
| 2.3.11 16S rDNA扩增子测序 |
| 2.3.12 数据统计与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎小鼠病理指标的影响 |
| 2.4.2 产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎小鼠结肠病理症状的影响 |
| 2.4.3 产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎小鼠结肠黏液层的影响 |
| 2.4.4 产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎小鼠结肠上皮细胞层的影响 |
| 2.4.5 产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎小鼠血液、肝脏、结内脂肪酸的影响 |
| 2.4.6 产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎小鼠免疫指标的影响 |
| 2.4.7 产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎小鼠肠道菌群的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 短双歧杆菌CCFM683缓解结肠炎的关键物质及作用靶点 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.2.3 实验动物及饲料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 短双歧杆菌CCFM683的死菌和活菌制备 |
| 3.3.2 短双歧杆菌亚油酸异构酶基因敲除及回补菌株制备 |
| 3.3.3 动物实验设计 |
| 3.3.4 体外产CLA能力研究 |
| 3.3.5 体重、DAI指数和结肠长度的测定 |
| 3.3.6 H&E染色及病理评分 |
| 3.3.7 脂肪酸测定 |
| 3.3.8 数据统计及分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 短双歧杆菌CCFM683的死菌和活菌对结肠炎小鼠的影响 |
| 3.4.2 短双歧杆菌CCFM683的亚油酸异构酶基因敲除和回补菌株对结肠炎小鼠的影响 |
| 3.4.3 PPAR-γ抑制剂对结肠炎小鼠的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 短双歧杆菌CCFM683缓解结肠炎的机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器及设备 |
| 4.2.3 实验动物及饲料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌株培养 |
| 4.3.2 动物实验设计 |
| 4.3.3 结肠组织免疫荧光染色 |
| 4.3.4 结肠组织PAS染色 |
| 4.3.5 结肠组织荧光原位杂交 |
| 4.3.6 结肠组织透射电镜分析 |
| 4.3.7 结肠组织Tunnel染色 |
| 4.3.8 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 4.3.9 蛋白质印迹实验 |
| 4.3.10 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 短双歧杆菌CCFM683对结肠炎小鼠机械屏障的调节机制 |
| 4.4.2 短双歧杆菌CCFM683对结肠炎小鼠免疫屏障的调节机制 |
| 4.4.3 短双歧杆菌CCFM683对NF-κB信号通路的影响 |
| 4.4.4 短双歧杆菌CCFM683对GPR40-ERK-MEK信号通路的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 短双歧杆菌CCFM683缓解结肠炎量效关系研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.2.2 实验仪器与设备 |
| 5.2.3 实验动物及饲料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 菌株培养 |
| 5.3.2 动物实验设计 |
| 5.3.3 体重、结肠长度和DAI指数的测定 |
| 5.3.4 H&E染色及病理评分 |
| 5.3.5 PAS染色 |
| 5.3.6 阿利新蓝染色 |
| 5.3.7 Hoechst细胞凋亡染色 |
| 5.3.8 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 5.3.9 脂肪酸测定 |
| 5.3.10 16S rDNA扩增子测序 |
| 5.3.11 数据统计及分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 共轭亚油酸缓解结肠炎的量效关系 |
| 5.4.2 短双歧杆菌CCFM683缓解结肠炎量效关系 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士期间取得的成果 |
（2）含共轭脂肪酸的发酵核桃乳的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 核桃概述 |
| 1.1.1 脂类 |
| 1.1.2 蛋白质 |
| 1.2 共轭脂肪酸概述 |
| 1.2.1 共轭脂肪酸的结构及主要的生理功能 |
| 1.2.2 共轭脂肪酸的来源及合成 |
| 1.3 发酵核桃乳产品开发存在的问题 |
| 1.4 发酵核桃乳的研究现状 |
| 1.5 立题意义与研究内容 |
| 1.5.1 立题意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基制备 |
| 2.1.5 主要的仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株的活化与培养 |
| 2.2.2 核桃乳的制备 |
| 2.2.3 发酵核桃乳的制备 |
| 2.2.4 p H值的测定 |
| 2.2.5 乳酸菌活菌数的测定 |
| 2.2.6 脂肪酸分析 |
| 2.2.7 乳化稳定系数的测定 |
| 2.2.8 离心沉淀率的测定 |
| 2.2.9 粘度的测定 |
| 2.2.10 粒径及粒度分布分析 |
| 2.2.11 挥发性风味物质的分析 |
| 2.2.12 喜好度评价 |
| 2.2.13 贮藏期内产品稳定性的研究 |
| 2.2.14 数据统计分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 菌株在核桃乳中转化共轭脂肪酸的研究 |
| 3.1.1 料水比对不同菌株在核桃乳中的生长特性的影响 |
| 3.1.2 核桃乳中亚油酸、亚麻酸的转化情况 |
| 3.1.3 发酵核桃乳中共轭脂肪酸转化条件的研究 |
| 3.2 含共轭脂肪酸的发酵核桃乳的稳定性研究 |
| 3.2.1 抗氧化剂的筛选 |
| 3.2.2 乳化剂和增稠剂的复配和筛选 |
| 3.2.3 发酵核桃乳的产品配方及喜好度评价 |
| 3.2.4 发酵核桃乳的贮藏稳定性 |
| 3.2.5 发酵核桃乳的货架期预测 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）重组酵母菌生物合成共轭亚油酸单体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 共轭亚油酸及其生理功能 |
| 1.1.1 共轭亚油酸概述 |
| 1.1.2 c9,t11-CLA、t10,c12-CLA的生理功能 |
| 1.2 c9,t11-CLA的合成机理及研究进展 |
| 1.2.1 单酶催化亚油酸异构酶BBI |
| 1.2.2 多酶催化 |
| 1.2.3 c9,t11-CLA的生物合成研究进展 |
| 1.3 t10,c12-CLA的合成机理及研究进展 |
| 1.3.1 单酶催化亚油酸异构酶PAI |
| 1.3.2 t10,c12-CLA的生物合成研究进展 |
| 1.4 酵母表达系统 |
| 1.4.1 酿酒酵母表达系统 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.5 立题依据及主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂及配制 |
| 2.1.4 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 亚油酸异构酶BBI的蛋白结构预测 |
| 2.2.2 不同亚油酸异构酶表达载体的构建 |
| 2.2.3 酿酒酵母感受态细胞制备及化学转化 |
| 2.2.4 毕赤酵母感受态细胞制备及电转化 |
| 2.2.5 重组菌的筛选鉴定 |
| 2.2.6 重组菌的诱导表达 |
| 2.2.7 重组菌中异源蛋白表达水平测定 |
| 2.2.8 酶活检测 |
| 2.2.9 静息细胞催化剂制备及催化 |
| 2.2.10 数据处理及分析方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 亚油酸异构酶BBI重组菌的构建及催化合成c9,t11-CLA的研究 |
| 3.1.1 亚油酸异构酶BBI蛋白结构分析 |
| 3.1.2 酿酒酵母BBI重组菌的构建和筛选验证 |
| 3.1.3 酿酒酵母重组菌蛋白表达水平及酶活水平分析 |
| 3.1.4 毕赤酵母重组菌的构建和筛选验证 |
| 3.1.5 毕赤酵母重组菌蛋白表达水平及酶活水平分析 |
| 3.1.6 His-tag对BBI表达水平及酶活的影响 |
| 3.1.7 不同表达系统中BBI表达水平及酶活的情况比较 |
| 3.1.8 毕赤酵母重组菌静息细胞催化合成c9,t11-CLA的研究 |
| 3.1.9 BBI粗酶酶学特性的研究 |
| 3.2 亚油酸异构酶PAI重组菌的构建及催化合成t10,c12-CLA的研究 |
| 3.2.1 PAI毕赤酵母分泌表达重组菌的构建和筛选验证 |
| 3.2.2 毕赤酵母分泌表达重组菌蛋白表达水平及酶活水平分析 |
| 3.2.3 PAI毕赤酵母胞内可溶性表达重组菌的构建和筛选验证 |
| 3.2.4 毕赤酵母胞内可溶性表达重组菌蛋白表达水平及酶活水平分析 |
| 3.2.5 毕赤酵母胞内可溶性表达重组菌蛋白表达水平优化 |
| 3.2.6 毕赤酵母重组菌静息细胞催化合成t10,c12-CLA的研究 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录Ⅱ:部分气相色谱峰图 |
（4）饲养方式对苏尼特羊肌纤维特性和肉品质的影响及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 国内外羊产业发展现状 |
| 1.1.1 国内外羊产业发展概况 |
| 1.1.2 饲养方式对羊肉品质影响的研究进展 |
| 1.2 羊肉品质及其影响因素 |
| 1.2.1 色泽 |
| 1.2.2 嫩度 |
| 1.2.3 风味 |
| 1.2.4 保水性 |
| 1.2.5 pH值 |
| 1.3 骨骼肌纤维概况 |
| 1.3.1 骨骼肌纤维的结构 |
| 1.3.2 骨骼肌纤维的分类及其鉴定 |
| 1.3.3 影响骨骼肌纤维组成的因素 |
| 1.4 骨骼肌纤维与肉品质的关系 |
| 1.4.1 骨骼肌纤维对肌肉色泽的影响 |
| 1.4.2 骨骼肌纤维对肌肉嫩度的影响 |
| 1.4.3 骨骼肌纤维对肌肉风味的影响 |
| 1.4.4 骨骼肌纤维对肌肉保水性的影响 |
| 1.4.5 骨骼肌纤维对肌肉宰后p H值的影响 |
| 1.5 调控骨骼肌纤维类型转化的分子机制 |
| 1.5.1 Ca~(2+)信号途径 |
| 1.5.2 AMPK信号途径 |
| 1.5.3 PPARβ/δ信号途径 |
| 1.6 蛋白组学在肉品质和肌纤维特性研究中的应用 |
| 1.7 骨骼肌纤维特性的调控方式 |
| 1.7.1 不饱和脂肪酸对骨骼肌纤维转化的调控 |
| 1.7.2 乳酸菌对骨骼肌纤维转化的调控 |
| 1.7.3 运动训练对骨骼肌纤维转化的调控 |
| 1.8 研究内容、目的、意义以及技术路线 |
| 1.8.1 研究内容 |
| 1.8.2 研究目的与意义 |
| 1.8.3 技术路线 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂及来源 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验设计 |
| 2.2.1 不同饲养方式下苏尼特羊肉用品质的差异性研究 |
| 2.2.2 不同饲养方式下苏尼特羊肉肌纤维特性的差异性研究 |
| 2.2.3 饲养方式对苏尼特羊肌纤维特性影响机制的研究 |
| 2.2.4 改善圈养苏尼特羊肉用品质的技术研究 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 苏尼特羊肉用品质的测定 |
| 2.3.2 苏尼特羊肌纤维特性的测定 |
| 2.3.3 肌纤维特性相关基因表达量的测定 |
| 2.3.4 差异蛋白组学的测定 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 饲养方式对苏尼特羊肉用品质的影响 |
| 3.1.1 饲养方式对苏尼特羊屠宰性能的影响 |
| 3.1.2 饲养方式对苏尼特羊肉品质指标的影响 |
| 3.1.3 饲养方式对苏尼特羊营养成分的影响 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 饲养方式对苏尼特羊肌纤维特性的影响 |
| 3.2.1 不同饲养方式下苏尼特羊ATPase染色结果 |
| 3.2.2 饲养方式对苏尼特羊My HC m RNA表达量的影响 |
| 3.2.3 饲养方式对苏尼特羊相关代谢酶活力的影响 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 饲养方式对苏尼特羊肌纤维特性影响机制的研究 |
| 3.3.1 饲养方式对肌纤维特性相关调控基因表达量的影响 |
| 3.3.2 不同饲养方式下肌纤维特性相关差异蛋白的分析 |
| 3.4 改善圈养苏尼特羊肉用品质的技术研究 |
| 3.4.1 日粮添加亚麻籽对苏尼特羊肌纤维特性和肉品质的影响 |
| 3.4.2 日粮添加乳酸菌对苏尼特羊肌纤维特性和肉品质的影响 |
| 3.4.3 增加运动量对苏尼特羊肌纤维特性和肉品质的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）酸乳用乳酸菌的筛选与应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 乳酸菌发酵剂 |
| 1.1.1 乳酸菌发酵剂的概述 |
| 1.1.2 乳酸菌发酵剂的研究现状 |
| 1.2 乳酸菌 |
| 1.2.1 乳酸菌的概述 |
| 1.2.2 酸乳生产中常见的乳酸菌 |
| 1.2.3 酸乳用乳酸菌的筛选 |
| 1.3 乳酸菌安全性概述 |
| 1.4 立题意义及研究内容 |
| 1.4.1 立题意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 酸乳用乳酸菌的分离与鉴定及部分安全性评价 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 主要培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株的分离与纯化 |
| 2.2.2 乳酸菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 扩增乳酸菌16S rDNA基因序列 |
| 2.2.4 PCR产物检测与测序 |
| 2.2.5 抗生素耐药性敏感实验 |
| 2.2.6 乳酸菌有害代谢产物的检测 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 乳酸菌的分离与纯化 |
| 2.3.2 乳酸菌形态及染色结果 |
| 2.3.3 乳酸菌的鉴定 |
| 2.3.4 抗生素耐药性的测定 |
| 2.3.5 有害代谢产物的检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 具有优良加工特性酸乳用乳酸菌的筛选 |
| 3.1 试验材料与设备 |
| 3.1.1 试验菌株 |
| 3.1.2 试验材料 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.4 主要培养基 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌株活化 |
| 3.2.2 全脂乳的制备 |
| 3.2.3 样品的制备 |
| 3.2.4 发酵时间的测定 |
| 3.2.5 滴定酸度的测定 |
| 3.2.6 pH值的测定 |
| 3.2.7 黏度的测定 |
| 3.2.8 持水力的测定 |
| 3.2.9 香气成分的测定 |
| 3.2.10 抑菌能力的测定 |
| 3.2.11 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 单菌株发酵性能初筛 |
| 3.3.2 抑菌能力的测定 |
| 3.3.3 发酵乳贮藏期稳定性的研究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 复合乳酸菌发酵酸乳贮藏期稳定性及其风味物质的研究 |
| 4.1 试验材料与设备 |
| 4.1.1 试验菌株 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.1.3 仪器与设备 |
| 4.1.4 主要培养基 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 菌株的活化 |
| 4.2.2 全脂乳的制备 |
| 4.2.3 样品的制备 |
| 4.2.4 发酵时间的确定 |
| 4.2.5 活菌数的测定 |
| 4.2.6 滴定酸度的测定 |
| 4.2.7 pH的测定 |
| 4.2.8 黏度的测定 |
| 4.2.9 持水力的测定 |
| 4.2.10 挥发性风味物质的测定 |
| 4.2.11 感官评价 |
| 4.2.12 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 酸乳酸化曲线的测定 |
| 4.3.2 酸乳发酵时间的确定 |
| 4.3.3 酸乳的贮藏期稳定性测定 |
| 4.3.4 酸乳感官评价 |
| 4.3.5 酸乳风味物质的分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）以葵花籽油为底物生物转化共轭亚油酸双歧杆菌的筛选（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验菌种及培养基 |
| 1.1.2 实验原料 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 菌株活化 |
| 1.2.2 亚油酸样品处理及菌株培养 |
| 1.2.3 脂肪酸快速扫描 |
| 1.2.4 葵花籽油样品处理及菌株培养 |
| 1.2.5 脂肪酸组成分析 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 以游离态亚油酸为底物转化CLA的双歧杆菌筛选 |
| 2.2 以葵花籽油为底物筛选产CLA的双歧杆菌 |
| 3结论 |
（7）双歧杆菌生物转化共轭亚油酸的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略符号 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 共轭亚油酸概述 |
| 1.2 共轭亚油酸的生物转化 |
| 1.2.1 生物转化cis9,trans11-CLA异构体菌株 |
| 1.2.2 生物转化trans10,cis12-CLA异构体菌株 |
| 1.3 共轭亚油酸生物转化的机制研究 |
| 1.3.1 瘤胃菌生物转化共轭亚油酸 |
| 1.3.2 乳杆菌生物转化共轭亚油酸 |
| 1.3.3 梭状芽孢杆菌生物转化共轭亚油酸 |
| 1.3.4 丙酸杆菌生物转化共轭亚油酸 |
| 1.3.5 双歧杆菌生物转化共轭亚油酸 |
| 1.4 细菌对亚油酸胁迫作用的应对策略 |
| 1.4.1 亚油酸对细菌的胁迫作用 |
| 1.4.2 双歧杆菌应对亚油酸胁迫的调控机制 |
| 1.5 立题意义与研究内容 |
| 1.5.1 立题意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 双歧杆菌生物转化共轭亚油酸的种属规律 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 主要实验设备 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌株的活化与培养 |
| 2.3.2 10-HOE的提取及分离纯化 |
| 2.3.3 乳酸菌基因组的提取、mcra基因片段的扩增及表达载体的构建 |
| 2.3.4 重组蛋白的诱导表达及活性验证 |
| 2.3.5 发酵液中脂肪酸的提取、甲酯化以及GC-MS检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 双歧杆菌以亚油酸为底物生物转化共轭亚油酸的规律 |
| 2.4.2 双歧杆菌以10-HOE为底物生物转化共轭亚油酸的规律 |
| 2.4.3 双歧杆菌中亚油酸、共轭亚油酸以及10-HOE相互转化的规律 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 短双歧杆菌CCFM683生物转化共轭亚油酸的功能基因挖掘 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 工具酶和试剂 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌株的活化及培养 |
| 3.3.2 短双歧杆菌CCFM683全基因组测序 |
| 3.3.3 转录组学的测定方法以及下机数据分析 |
| 3.3.4 基于稳定同位素标记底物示踪亚油酸转化路径 |
| 3.3.5 基于WGCNA对短双歧杆菌中亚油酸异构酶的预测 |
| 3.3.6 大肠杆菌相关表达载体的构建 |
| 3.3.7 双歧杆菌相关载体的构建 |
| 3.3.8 RNA提取及实时定量PCR |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 短双歧杆菌CCFM683中亚油酸异构酶基因的预测 |
| 3.4.2 基于稳定同位素标记技术示踪亚油酸的生物转化 |
| 3.4.3 基于转录组学分析亚油酸对短双歧杆菌基因表达的影响 |
| 3.4.4 基于WGCNA预测参与共轭亚油酸生物转化的功能基因 |
| 3.4.5 短双歧杆菌亚油酸异构酶基因的功能验证 |
| 3.4.6 短双歧杆菌亚油酸异构酶及亚油酸水合酶的底物特异性分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 亚油酸异构酶和亚油酸水合酶在短双歧杆菌CCFM683应对亚油酸胁迫过程中的作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 主要材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌株的培养以及活化 |
| 4.3.2 亚油酸对菌株生长的影响 |
| 4.3.3 亚油酸异构酶与亚油酸水合酶的定位 |
| 4.3.4 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.3.5 重组亚油酸异构酶与亚油酸水合酶对底物的竞争性 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 亚油酸对短双歧杆菌CCFM683生长的影响 |
| 4.4.2 亚油酸异构酶与亚油酸水合酶在短双歧杆菌应对亚油酸胁迫过程中的作用 |
| 4.4.3 短双歧杆菌CCFM683中亚油酸异构酶与亚油酸水合酶的定位分析 |
| 4.4.4 短双歧杆菌CCFM683中LA、CLA以及10-HOE的分布 |
| 4.4.5 短双歧杆菌亚油酸异构酶与亚油酸水合酶对底物LA的竞争性分析 |
| 4.4.6 短双歧杆菌CCFM683中LA、CLA以及10-HOE转移路径推测 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 短双歧杆菌CCFM683生物转化共轭亚油酸转录调控机制的解析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料及仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 clgr基因过表达及干扰质粒的构建 |
| 5.3.2 RNA提取及实时定量PCR分析 |
| 5.3.3 大肠杆菌体系质粒的构建和重组蛋白表达 |
| 5.3.4 蛋白质的纯化 |
| 5.3.5 凝胶迁移实验 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 转录调控蛋白ClgR对短双歧杆菌CCFM683 生物转化CLA、10-HOE的影响 |
| 5.4.2 短双歧杆菌CCFM683 转录调控蛋白ClgR的异源表达和纯化 |
| 5.4.3 转录调控蛋白ClgR与 bbi以及mcra基因上游调控区域的相互作用 |
| 5.4.4 转录调控蛋白ClgR调控bbi以及mcra基因转录的功能区域 |
| 5.4.5 bbi以及mcra基因上游调控区域与转录调控蛋白ClgR的结合位点 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 亚油酸异构酶、亚油酸水合酶与双歧杆菌生物转化CLA及10-HOE能力之间的关联性分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 主要材料 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 系统进化树的构建 |
| 6.3.2 亚油酸异构酶、亚油酸水合酶与双歧杆菌生物转化CLA及10-HOE能力之间的关联性分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 亚油酸异构酶系统进化发育树的构建及氨基酸序列比对 |
| 6.4.2 亚油酸异构酶与双歧杆菌生物转化CLA能力之间的关联性分析 |
| 6.4.3 亚油酸水合酶与双歧杆菌生物转化10-HOE能力之间的关联性分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）短乳杆菌组成型表达载体的构建及其初步应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 短乳杆菌 |
| 1.1.1 短乳杆菌概述 |
| 1.1.2 短乳杆菌的功能及应用研究 |
| 1.2 乳酸菌外源基因表达系统 |
| 1.2.1 乳酸菌外源基因表达概况 |
| 1.2.2 乳酸菌表达载体的类型 |
| 1.2.3 乳杆菌表达系统特点 |
| 1.3 甘油合成关键酶基因 |
| 1.4 研究目的、意义和内容 |
| 1.4.1 研究目的及意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 短乳杆菌组成型表达载体的构建及GFP的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验菌株与质粒 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 需配试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 通用方法 |
| 2.3.2 基于P32启动子短乳杆菌GFP表达载体的构建和验证 |
| 2.3.2.1 p MG36e-GFP的构建和验证 |
| 2.3.2.2 p MG36B-GFP的构建和验证 |
| 2.3.3 基于内源启动子的短乳杆菌GFP表达载体的构建和验证 |
| 2.3.3.1 短乳杆菌几种不同内源基因启动子的克隆 |
| 2.3.3.2 几种不同内源基因启动子对应的GFP编码区的克隆 |
| 2.3.3.3 三片段的连接、转化及鉴定 |
| 2.3.4 重组GFP质粒转化短乳杆菌 |
| 2.3.5 GFP表达菌株的筛选 |
| 2.3.5.1 荧光分光光度计检测GFP的表达 |
| 2.3.5.2 紫外灯和荧光显微镜观察GFP的表达 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 p MG36e-GFP载体 |
| 2.4.1.1 p MG36e-GFP载体的构建流程 |
| 2.4.1.2 短乳杆菌GFP表达载体p MG36e-GFP的转化及鉴定 |
| 2.4.2 p MG36B-GFP载体 |
| 2.4.2.1 p MG36B-GFP载体的构建流程 |
| 2.4.2.2 短乳杆菌GFP表达载体p MG36B-GFP的转化及鉴定 |
| 2.4.3 p MG36e-Px-GFP载体 |
| 2.4.3.1 短乳杆菌内源基因启动子的筛选 |
| 2.4.3.2 p MG36B-Px-GFP载体的构建流程 |
| 2.4.3.3 短乳杆菌GFP表达载体p MG36B-Px-GFP的转化及鉴定 |
| 2.4.4 重组GFP载体在短乳杆菌中的转化及表达情况 |
| 2.4.4.1 重组GFP载体转化短乳杆菌的鉴定 |
| 2.4.4.2 重组GFP载体在短乳杆菌中的表达情况 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 甘油合成途径相关基因在短乳杆菌中的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.2.5 需配试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 4 个甘油合成酶单基因表达载体的构建和验证 |
| 3.3.1.1 Ppyk启动子片段的获取 |
| 3.3.1.2 4 个甘油合成酶单基因编码区的克隆 |
| 3.3.1.3 三片段的连接、转化及鉴定 |
| 3.3.2 重组甘油合成酶基因质粒转化短乳杆菌 |
| 3.3.3 重组酶Sc GPD和 Sc GPP粗酶液的制备 |
| 3.3.4 重组酶Sc GPD和 Sc GPP的酶活测定 |
| 3.3.4.1 3 -磷酸甘油脱氢酶酶活的测定 |
| 3.3.4.2 3 -磷酸甘油酯酶酶活的测定 |
| 3.3.5 重组酶Sc GPD和 Sc GPP的 SDS-PAGE分析 |
| 3.3.5.1 BCA法测定粗酶液蛋白含量 |
| 3.3.5.2 SDS-PAGE分析 |
| 3.3.6 RT-PCR检测Sc GPP2 基因表达 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 单基因表达载体的构建 |
| 3.4.1.1 p MG36B-Ppyk-X载体的构建流程 |
| 3.4.1.2 p MG36B-Ppyk-X载体的转化和鉴定 |
| 3.4.2 p MG36B-Ppyk-X载体转化短乳杆菌 |
| 3.4.3 3 -磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酯酶酶活的测定 |
| 3.4.3.1 3 -磷酸甘油脱氢酶酶活的测定 |
| 3.4.3.2 3 -磷酸甘油酯酶酶活的测定 |
| 3.4.4 重组蛋白SDS-PAGE分析 |
| 3.4.5 RT-PCR检测Sc GPP2 转录情况 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 p MAD-Ppyk表达系统的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.2.5 需配试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 p MAD-Ppyk-GFP的构建和验证 |
| 4.3.1.1 Ppyk-GFP表达盒片段的获取 |
| 4.3.1.2 无缝连接、转化及鉴定 |
| 4.3.2 p MAD-Ppyk-Sc GPD1/Sc GPP2 的构建和验证 |
| 4.3.3 转化短乳杆菌及表达情况鉴定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 p MAD-Ppyk-GFP载体 |
| 4.4.1.1 p MAD-Ppyk-GFP载体的构建流程 |
| 4.4.1.2 p MAD-Ppyk-GFP载体的转化和鉴定 |
| 4.4.2 p MAD-Ppyk-Sc GPD1/Sc GPP2 载体 |
| 4.4.2.1 p MAD-Ppyk-Sc GPD1/Sc GPP2 载体的构建流程 |
| 4.4.2.2 p MAD-Ppyk-Sc GPD1/Sc GPP2 载体的转化和鉴定 |
| 4.4.3 p MAD-Ppyk系列载体转化短乳杆菌 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 引物序列 |
| 附录二 启动子及基因序列 |
| 附录三 通用方法 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）LA诱导和醇胁迫对植物乳杆菌p-8 CLA转化率的影响及机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 共轭亚油酸的生理功能 |
| 1.1.1 预防及抑制癌症 |
| 1.1.2 减少体内脂肪积累 |
| 1.1.3 提高身体免疫力 |
| 1.1.4 清除血管垃圾 |
| 1.1.5 提高骨骼密度 |
| 1.2 共轭亚油酸的合成方式 |
| 1.2.1 化学合成 |
| 1.2.2 生物合成 |
| 1.3 微生物转化共轭亚油酸机制 |
| 1.3.1 瘤胃微生物 |
| 1.3.2 丙酸杆菌 |
| 1.3.3 乳酸菌 |
| 1.4 与CLA合成相关的酶 |
| 1.4.1 亚油酸异构酶 |
| 1.4.2 脂肪酸水合酶 |
| 1.4.3 羟基脂肪酸脱氢酶 |
| 1.4.4 乙酰乙酸脱羧酶 |
| 1.4.5 烯酮还原酶 |
| 1.4.6 烯醇化酶 |
| 1.5 LA对细胞影响 |
| 1.6 影响CLA产生的因素 |
| 1.7 亚油酸异构酶基因的转录调控研究 |
| 1.8 植物乳杆菌P-8菌株 |
| 1.9 研究意义与内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 试剂盆 |
| 2.1.5 生化试剂 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 L.plantarum P-8菌株培养 |
| 2.2.2 不同底物浓度对植物乳杆菌p-8菌株培养 |
| 2.2.3 不同浓度的甲醇胁迫下植物乳杆菌p-8菌株的培养 |
| 2.2.4 不同浓度的乙醇胁迫对植物乳杆菌p-8菌株的培养 |
| 2.2.5 CLA的检测 |
| 2.2.6 产CLA相关酶转录水平分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌种活化及生长曲线测定 |
| 3.2 标准样品和待测样品色谱图 |
| 3.3 不同底物浓度对植物乳杆菌p-8菌株CLA转化率 |
| 3.4 不同底物浓度诱导下植物乳杆菌p-8菌株CLA合成相关酶基因转录水平 |
| 3.4.1 不同底物浓度诱导下植物乳杆菌p-8菌株RNA提取结果 |
| 3.4.2 不同底物浓度诱导下植物乳杆菌p-8菌株CLA合成相关酶基因及内参基因的转录水平 |
| 3.5 不同浓度甲醇胁迫下植物乳杆菌p-8菌株CLA的转化率 |
| 3.6 不同甲醇浓度胁迫下植物乳杆菌p-8菌株CLA合成相关酶基因的转录水平 |
| 3.6.1 不同甲醇浓度胁迫下植物乳杆菌p-8菌株RNA提取结果 |
| 3.6.2 不同甲醇浓度胁迫下植物乳杆菌p-8菌株CLA合成相关酶基因的转录水平 |
| 3.7 不同乙醇浓度胁迫下植物乳杆菌p-8菌株CLA的转化率 |
| 3.8 不同乙醇浓度胁迫下植物乳杆菌p-8菌株CLA生成相关酶基因的转录水平 |
| 3.8.1 醇胁迫对植物乳杆菌p-8菌株CLA合成相关酶基因转录水平的影响 |
| 3.8.2 不同乙醇浓度胁迫下植物乳杆菌p-8菌株CLA合成相关酶基因的转录水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）植物乳杆菌p-8合成CLA及CLA-HY和CLA-DH结构和功能关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 共轭亚油酸研究进展 |
| 1.1.1 共轭亚油酸的生理功能 |
| 1.1.2 共轭亚油酸的来源 |
| 1.2 微生物合成共轭亚油酸途径的研究 |
| 1.2.1 瘤胃细菌合成共轭亚油酸途径的研究 |
| 1.2.2 丙酸杆菌合成共轭亚油酸途径的研究 |
| 1.2.3 乳酸菌合成共轭亚油酸途径的研究 |
| 1.3 亚油酸异构酶系研究进展 |
| 1.3.1 亚油酸异构酶 |
| 1.3.2 共轭亚油酸水合酶 |
| 1.3.3 羟基脂肪酸脱氢酶 |
| 1.3.4 共轭亚油酸乙酰乙酸脱羧酶 |
| 1.4 生物信息学研究进展 |
| 1.4.1 序列分析 |
| 1.4.2 系统发育分析 |
| 1.4.3 蛋白质的分析 |
| 1.5 蛋白质结构与功能的研究 |
| 1.5.1 蛋白质的结构 |
| 1.5.2 蛋白质的功能 |
| 1.5.3 蛋白质结构和功能关系的研究方法 |
| 1.6 植物乳杆菌p-8研究进展 |
| 1.7 研究意义和内容 |
| 2 植物乳杆菌p-8生物合成共轭亚油酸的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 培养基配制 |
| 2.1.4 主要溶液 |
| 2.2 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC粗酶的制备 |
| 2.3.2 植物乳杆菌p-8菌体发酵催化LA转化CLA |
| 2.3.3 植物乳杆菌p-8天然酶催化LA转化CLA |
| 2.3.4 重组CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC一步法催化LA转化CLA |
| 2.3.5 重组CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC分步法催化LA转化CLA |
| 2.3.6 样品中脂肪酸提取、甲酯化及检测 |
| 2.3.7 催化产物的GC-MS分析 |
| 2.3.8 数据处理 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 植物乳杆菌p-8发酵可催化LA转化CLA |
| 2.4.2 植物乳杆菌p-8的天然酶可催化LA合成CLA |
| 2.4.3 重组蛋白CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC诱导表达及鉴定 |
| 2.4.4 重组CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC一步法催化LA转化CLA |
| 2.4.5 重组CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC分步法催化LA转化CLA |
| 2.5 小结 |
| 3 植物乳杆菌p-8的共轭亚油酸水合酶的结构与功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 实验试剂及试剂盒 |
| 3.1.3 培养基配制 |
| 3.1.4 主要溶液 |
| 3.2 实验仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组CLA-HY及其突变体同源建模 |
| 3.3.2 重组CLA-HY与LA分子对接 |
| 3.3.3 点突变体质粒构建 |
| 3.3.4 缺失突变体质粒构建 |
| 3.3.5 重组CLA-HY及其突变体的诱导表达 |
| 3.3.6 蛋白质含量检测 |
| 3.3.7 重组CLA-HY及其突变体的酶学分析 |
| 3.3.8 数据处理 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 重组CLA-HY同源建模分析 |
| 3.4.2 重组CLA-HY与LA的分子对接研究 |
| 3.4.3 重组CLA-HY点突变体质粒的构建 |
| 3.4.4 重组CLA-HY缺失突变体质粒的构建 |
| 3.4.5 重组CLA-HY及其突变体的纯化 |
| 3.4.6 重组CLA-HY及其突变体的蛋白含量分析 |
| 3.4.7 重组CLA-HY及其突变体的酶学分析 |
| 3.4.8 重组CLA-HY突变体同源建模分析 |
| 3.5 小结 |
| 4 植物乳杆菌p-8的羟基脂肪酸脱氢酶的结构与功能研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 实验试剂及试剂盒 |
| 4.1.3 培养基配制 |
| 4.1.4 主要溶液 |
| 4.2 实验仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组CLA-DH及其突变体的同源建模 |
| 4.3.2 重组CLA-DH与底物的分子对接 |
| 4.3.3 点突变体质粒构建 |
| 4.3.4 重组CLA-DH及其突变体的诱导表达 |
| 4.3.5 蛋白质含量检测 |
| 4.3.6 重组CLA-DH及其突变体的酶学分析 |
| 4.3.7 数据处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 重组CLA-DH同源建模分析 |
| 4.4.2 重组CLA-DH与底物的分子对接分析 |
| 4.4.3 重组CLA-DH点突变体质粒的构建 |
| 4.4.4 重组CLA-DH及其突变体的纯化 |
| 4.4.5 重组CLA-DH及其突变体蛋白质含量测定 |
| 4.4.6 重组CLA-DH及其突变体的酶学分析 |
| 4.4.7 重组CLA-DH突变体同源建模分析 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
四、乳酸菌制备CLA的研究（论文参考文献）
- [1]产共轭亚油酸双歧杆菌对结肠炎的缓解作用及机制研究[D]. 陈洋. 江南大学, 2021(01)
- [2]含共轭脂肪酸的发酵核桃乳的研究[D]. 黄周群. 江南大学, 2021(01)
- [3]重组酵母菌生物合成共轭亚油酸单体的研究[D]. 李秀清. 江南大学, 2021(01)
- [4]饲养方式对苏尼特羊肌纤维特性和肉品质的影响及其机理研究[D]. 侯艳茹. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [5]酸乳用乳酸菌的筛选与应用研究[D]. 王磊. 扬州大学, 2021(08)
- [6]以葵花籽油为底物生物转化共轭亚油酸双歧杆菌的筛选[J]. 陈科学,王欣,夏嘉祎,沈慧敏,嵇熠彬,张灏,杨波,陈卫. 中国油脂, 2021(01)
- [7]双歧杆菌生物转化共轭亚油酸的机制研究[D]. 高鹤. 江南大学, 2020(03)
- [8]短乳杆菌组成型表达载体的构建及其初步应用研究[D]. 张雁. 暨南大学, 2020(03)
- [9]LA诱导和醇胁迫对植物乳杆菌p-8 CLA转化率的影响及机制初探[D]. 王丹. 内蒙古农业大学, 2020
- [10]植物乳杆菌p-8合成CLA及CLA-HY和CLA-DH结构和功能关系的研究[D]. 赵微. 内蒙古农业大学, 2020