卡氏肺孢子虫实验室诊断研究现状

一、卡氏肺孢子虫病的实验诊断研究现状（论文文献综述）

王啸晨^[1]（2020）在《基于二代测序技术平台检测器官移植术后病原微生物的应用研究》文中进行了进一步梳理实体器官移植（Solid Organ Transplantation,SOT）是治疗多种终末期器官疾病的有效手段,术后排斥及感染等并发症是影响患者术后生存期的主要因素。移植受者术后需要长期服用免疫抑制剂以降低术后排斥发生的风险,但由于免疫抑制剂的使用,患者术后感染风险相对增加,威胁了患者术后的生存。目前临床感染诊断依赖医生对患者临床体征进行初诊,再通过临床标本采集进行进一步检测。临床对多种病原微生物的检测缺乏统一的金标准,且临床常规检测或检测周期长、特异性弱、灵敏度低等缺陷,无法快速有效检出器官移植术后病原微生物。二代测序技术（Next-Generation Sequencing,NGS）技术通量大、周期短、高灵敏、强特异,可同步检测各种病原微生物,对于器官移植术后免疫抑制,临床体征微弱、滞后的患者体内病原微生物检测有十分广阔的应用前景。因此,本文建立应用二代测序技术平台,检测器官移植术后感染患者病原微生物的方法,检测出器官移植术后主要病原微生物并验证。建立BKV DNA巢式PCR检测方法,肾移植患者术后外周血中BKV DNA的分布情况进行探究。（1）使用二代测序技术平台WGS及杂交捕获测序技术检测来自国内6个器官移植中心于2017-2019年揽收的136例器官移植患者的474例样本。所有样本均成功检出样本内病原微生物DNA,且检测特异性强,具体可精确至具体分型及菌株,检测灵敏度高,最低可检出1条病原微生物DNA。（2）根据揽收样本器官移植术后感染风险相关临床提示（不明原因肌酐升高、发热或炎症反应等）,将患者分为提示组与无提示组,对两组患者样本的测序结果进行分析。结果显示,临床提示组中病原微生物拷贝数显着高于无提示组,该结果与临床初诊结果一致。此外,于无提示组样本中亦检出病原微生物拷贝,造成此结果的原因可能为此部分患者体内存在病原微生物潜伏,但未发生大规模复制,尚未引发感染。该结果表明,二代测序技术不仅可以辅助临床医生进行感染诊断,亦可提示潜在病原微生物感染风险。（3）本研究筛选8种器官移植术后主要病原微生物（BKV、EBV、CMV、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌及卡氏肺孢子虫）,我们对入组样本中上述病原微生物的检测效果进行研究。通过多重PCR后测序,成功于样本检出上述病原微生物,且经验证,所设计引物特异性强,灵敏度高。多重PCR结合二代测序,实验周期短,成本低,该方法有望广泛应用于临床患者样本中病原微生物DNA乃至耐药基因及毒力基因等功能基因的检测。（4）使用巢式PCR,对肾移植患者术后外周血中BKV DNA的分布情况进行探究。结果显示,患者术后发生BKV病毒血症时,BKV于外周血中高水平复制。伴随感染程度升级,并发BKVN时,患者外周血中BKV逐渐感染患者外周血白细胞,随着病情从BKVN A期行进至B期乃至C期,白细胞中的BKV载量进一步提升,引发严重的相关疾病,此时的BKV已难以从患者体内清除。综上所述,二代测序技术于器官移植术后病原微生物检测乃至常规临床患者感染检测中应用前景广阔。该技术可有效检出引发的病原微生物,乃至提示存在潜在感染风险的病原微生物。可有效帮助临床医生监控患者体内菌群,并及时调整治疗方案,有利于患者的长期生存。

陈敬捷,何晗,苏凌松,秦松树,唐柳生,李世立,胡宏波,李勇^[2]（2011）在《艾滋病合并肺孢子虫肺炎的实验室诊断方法进展》文中指出肺孢子虫肺炎（PCP）是艾滋病常见的一种严重的至死性肺炎。由于其临床表现不具特异性,易被误诊,因此实验室诊断更显重要。该文主要介绍PCP的实验室诊断方法,包括痰液、BALF、肺组织检查形态学诊断、分子学诊断、PC培养以及免疫学诊断等。

谷俊朝,刘建,俞巍^[3]（2009）在《卡氏肺孢子虫肺炎动物模型建立的现状》文中认为

董莹,张再兴^[4]（2009）在《云南省人体寄生虫病流行概况》文中研究表明云南省立体气候特征明显,雨量充沛,四季温差不明显的自然条件和特有的经济社会与人文因素,造成这一地区寄生虫虫种多和寄生虫病流行的广泛性。本文在整理云南省已记载人体寄生虫病病种的基础上,分病种将血吸虫病、带绦虫病、膜壳绦虫病、囊虫病、包虫病、土源性线虫病、旋毛虫病、广州管圆线虫病、阿米巴病、疟疾和机会性寄生虫病等作了简要介绍,并对存在的问题提出了改进建议。

杨霞霞^[5]（2009）在《大鼠卡氏肺孢子虫DHFR和DHPS基因序列的测定与分析》文中研究说明目的分析我国卡氏肺孢子虫遵义分离株的二氢叶酸还原酶（DHFR）和二氢叶酸合成酶（DHPS）基因的序列特性,应用PCR限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术分析DHPS基因的变异。方法（1）用地塞米松磷酸钠注射液腹股沟皮下注射的方法,用SD大鼠建立肺孢子虫肺炎动物模型。（2）实验分组:正常对照组（正常大鼠）,阴性对照组（给磺胺药的正常大鼠）,阳性对照组（建立Pc模型未给磺胺药的大鼠）和实验组（建立Pc模型并用磺胺药治疗的大鼠）。（3）肺组织印片六亚甲基四胺银染色观察卡氏肺孢子虫（Pneumocystis carinii,Pc）包囊,肺组织切片苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察其病理变化。（4）收集大鼠的肺组织,提取DNA,用PCR方法扩增卡氏肺孢子虫的DHFR和DHPS基因,纯化扩增产物后测序。检索基因文库（Gene bank,gb）,进行同源性分析。（5）用AccⅠ和HaeⅢ两种酶对DHPS基因的PCR扩增产物进行酶切,并应用PCR-RFLP技术对其进行分析。结果（1）实验组和阳性对照组大鼠全部感染Pc,正常对照组和阴性对照组未发现Pc。（2）实验组和阳性对照组的Pc DHFR和DHPS基因PCR扩增均呈阳性,阴性对照组和正常对照组无扩增。实验组和阳性对照组Pc DHFR有832个碱基,与gb[M26495]（Pcf.sp.rat）序列比较,同源性均为99%,与gb[AF322061]（Pc f.sp.rat）序列比较,同源性均为100%。实验组大鼠DHPS基因有816个碱基,与gb[U66283]（Pc f.sp.muris）序列比较同源性为94%,与gb[U66282]（Pc f.sp.hominis）相似性为83%。阳性对照组SD大鼠的卡氏肺孢子虫DHPS基因序列有839个碱基,与gb[U66283]序列比较同源性为95%,与gb[U66282]相似性为84%。（3）通过限制性内切酶AccⅠ和HaeⅢ酶切电泳,应用PCR-RFLP技术分析实验组和阳性对照组大鼠Pc DHPS基因并未发现Ala55/Ser57位点的突变。结论（1）地塞米松磷酸钠皮下注射法是一种建立SD大鼠肺孢子虫肺炎动物模型的良好方法。（2）实验组和阳性对照组Pc DHFR和DHPS基因的PCR扩增均呈阳性,两个基因与Gene bank内相应大鼠源肺孢子的基因序列同源性较高。（3）PCR具有灵敏性好、分辨率高、重复性好、操作简便、快速等优点,适用于肺孢子虫肺炎的分子生物学诊断。（4）进行PCR-RFLP分析后发现我国卡氏肺孢子虫遵义分离株的DHPS基因为野生型。

韩晶^[6]（2008）在《耶氏肺孢子虫肺炎实验及临床诊断研究》文中指出目的:采用瑞氏-吉姆萨染色法、巢式PCR法检测耶氏肺孢子虫,比较这两种方法在耶氏肺孢子虫肺炎诊断中的敏感性和稳定性,并结合病人的临床表现探讨肺孢子虫肺炎的临床诊断方法。方法:收集艾滋病、肾移植、肺癌、支气管炎等患者的痰液、气管分泌物、支气管肺泡灌洗液（BLA）或肺组织标本,采用瑞氏-吉姆萨染色法检测痰、BALF涂片和肺印片等标本中的耶氏肺孢子虫;以Pc-ITS为引物,对肺组织、BALF和痰标本,采用巢式PCR法检测耶氏肺孢子虫DNA。通过文献检索统计国内PCP发病情况:性别及年龄比例、发病特点、地区分布等,结合本研究发现的PCP病人资料,分析总结耶氏肺孢子虫肺炎的临床诊断方法。结果:瑞氏-吉姆萨染色法对该虫的检出率为32.39%,巢氏PCR法对该虫DNA的检出率为61.97%,二者检出率比较,x2=11.30,p＜0.01,有显着意义。文献检索发现2001～2007年国内PCP病例,以AIDS并发PCP为主（82.10%）;男性多于女性;死亡率13.08%,死亡病人中AIDS并发PCP病人占97.37%;PCP发病地区主要在河南、广西、湖南、广东等地;本研究确诊耶氏肺孢子虫肺炎6例,男5例,女1例,治疗后均好转出院。结论:瑞氏-吉姆萨染色法,操作简便,但敏感性偏低。巢式PCR法检测耶氏肺孢子虫敏感性高于瑞氏-吉姆萨染色法,其特异性和敏感性也优于普通的单一引物PCR法,本研究首次在青岛地区采用巢氏PCR法检出AIDS病人并发耶氏肺孢子虫,所用引物PC-ITS对耶氏肺孢子虫高度敏感,适用于临床病人的检测,结果准确快捷,值得推广。我国目前PCP发病人群以AIDS并发PCP为主,根据国内外资料综述及我们在本研究中对PCP阳性病人的分析,符合以下标准可诊断为AIDS并发PCP:①HIV感染;②CD4+小于200/μl;③有发热、咳嗽,咳痰,伴呼吸急促、进行性呼吸困难、紫绀,血氧饱和度下降;④胸片示间质性肺炎改变,或/及CT肺部示毛玻璃状改变;⑤复方新诺明治疗有效。

刘德纯^[7]（2007）在《艾滋病相关的人兽共患病》文中进行了进一步梳理

常志尚^[8]（2006）在《卡氏肺孢子虫肺炎动物模型实验诊断的研究》文中进行了进一步梳理卡氏肺孢子虫是一种机会性致病的病原体,该虫可在免疫功能低下的人群中诱发致命性的卡氏肺孢子虫肺炎,尤其是CD4+ T细胞功能缺陷者。随着艾滋病病人在我国不断的增加,以及为数众多的恶性肿瘤化疗、器官移植及接受免疫抑制剂治疗的患者,而我国目前对卡氏肺孢子虫实验室诊断大都依赖病原学常规染色,其敏感性和特异性易受不同的操作人员影响波动较大,并且其敏感性总体偏低,因此,急需建立一套简便、稳定、敏感性和特异性均高的诊断体系。本研究拟探讨改良的常规染色法和分子生物学方法在卡氏肺孢子虫实验诊断中的应用。 目的:采用瑞氏-吉姆萨染色法、寡核苷酸探针RNA原位杂交（RNA in situ hybridization）技术和巢式PCR法检测卡氏肺孢子虫,并探讨这三种方法在卡氏肺孢子虫诊断中的应用。 方法:Wistar雌性大鼠皮下注射地塞米松建立卡氏肺孢子虫肺炎动物模型。采用改进的病原学染色法瑞氏-吉姆萨染色法检测肺印片和BALF涂片。采用小亚单位RNA位点来源的寡核苷酸探针一条,地高辛加尾标记,对肺组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交。采用Pc-ITS-PCR引物,对肺组织、BALF和血清标本进行巢式PCR法检测。 结果:共检测了43只实验组大鼠,经瑞氏-吉姆萨染色后,在肺组织中查到的滋养体和/或包囊的阳性率为74.42%（32/43）,BALF涂片阳性率为67.44%（29/43）。寡核苷酸探针RNA原位杂交法成功检测到肺组织内的虫体,实验组大鼠在第3周即检测到虫体,7～8周时检测到大量包囊,9～10周时滋养体大量出现,而空包囊多出现在8～9周,虫体分布于肺泡腔、肺泡壁及血管壁。大鼠实验组肺组织切片阳性率为88.37%（38/43）。巢式PCR方法电泳结果出现550bp条带清晰,无非特异条带出现,实验组肺组织、BALF和血阳性率分别为86.05%（37/43）、83.72%（36/43）和76.74%（33/43）。上述三种方法,对照组阳性率均为0%（0/16）。经统计学分析处理,原位杂交对该虫的检出率高于瑞氏-吉姆萨染色法,差别有显着统计学意义（p<0.01）,原位杂交法与PCR法比较差别无统计学意义（p>0.05）,PCR法对该虫的检出率高于瑞氏-吉姆萨染色法,差别有显着统计学意义（p<0.01）。 结论:寡核苷酸探针RNA原位杂交法显示组织内虫体清晰,准确,在形态学

刘文彬,汤雪晴,郑淑梅,刘华君,许红波^[9]（2004）在《脑囊虫病患儿细胞免疫功能研究》文中指出

郑玉强^[10]（2003）在《卡氏肺孢子虫体外无细胞培养体系的建立与瑞香素抗卡氏肺孢子虫的初步研究》文中研究指明本研究通过对卡氏肺孢子虫（Pneumocystis carinii,Pc）体外无细胞系培养体系摸索，建立了Pc体外无细胞培养方法，并运用该培养体系研究了瑞香素在体外抗Pc的作用，获得如下结果和结论。1. 建立了较为稳定的Pc体外无细胞培养方法。通过对YPAD 、YEA、NPG、RPMI1640及IMDM多种基础培养基的筛选并反复摸索Pc培养条件，发现添加50μg/ml s-腺苷甲硫氨酸（SAM）、100mg/L N-乙酰氨基葡萄糖苷、80mg/L腐胺 、50mg/L L-半胱胺酸 、50mg/L L—谷胺酰胺、5×10-5mol/L2-巯基乙醇及15%新生小牛血清的IMDM培养基可支持Pc生长并可传代。在37℃，pH 8.0，5%CO2、95%O2条件下，接种新鲜分离的Pc包囊，培养10天，包囊可增殖8～9倍，滋养体可增殖11～12倍，在培养的前3天包囊生长较快，以后滋养体生长较快。经传代培养，包囊可稳定增殖5～6倍，滋养体可增殖8～9倍。冻存2月的Pc包囊，原代培养生长较差，传2 ～3倍代后与新鲜分离的Pc传代培养生长趋势相近。培养21天的Pc滋养体扫描电镜图象显示其表面有皱折，透射电镜图像显示其内部含有丰富的线粒体、内质网以及大量高密度颗粒。2. 应用以上培养体系，建立了筛选抗Pc药物的方法。运用建立的Pc体外无细胞培养方法，选用抗Pc的常用药物喷他脒1.0μg/ml、抗真菌的制霉菌素50μg/ml、抗细菌的庆大霉素400<WP=6>μg/ml处理培养的Pc，检测它们对Pc生长的抑制率从而评估上述培养方法用于药物筛选的可行性。实验结果显示，喷他脒对包囊的抑制率为55.9%，对滋养体的抑制率为64.7%，与空白对照组比较有显着性差异（p<0.01）；而制霉菌素、庆大霉素对包囊的抑制率分别为8.1%、7.7%，对滋养体的抑制率为9.3%、5.6%，二者与空白对照组相比无显着性差异。实验结果与文献报道相符，说明用以上建立的培养方法筛选抗Pc的药物是可行的。3. 应用以上培养体系、药物筛选方法，初步研究了瑞香素体外对Pc生长的抑制作用。瑞香素抗Pc作用效应在1～20μmol/L浓度范围呈剂量依赖关系，10μmol/L瑞香素与1.0μg/ml喷他脒对Pc生长影响效果相当，它们对Pc包囊的抑制率分别为59.3%、56.7%，对滋养体抑制率分别为65.9%、62.3%。若预先将瑞香素与FeSO4按2：1比例混合后，瑞香素对Pc的生长抑制作用大大减弱；而预先与MgSO4以2：1混合后，瑞香素对Pc的生长抑制作用则不减弱，此结果说明瑞香素对Pc的抑制作用与其螯合了Pc生长代谢密切相关的铁离子有关。透射电镜观察，发现经10μmol/L瑞香素作用48h的虫体出现线粒体、内质网肿胀，核膜断裂，胞浆稀薄、空泡、溶解等超微结构改变，这些改变程度随药物剂量增加、时间延长而加重。结 论 建立了Pc体外无细胞培养体系和药物筛选方法。瑞香素对Pc生长有一定抑制作用。

二、卡氏肺孢子虫病的实验诊断研究现状（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、卡氏肺孢子虫病的实验诊断研究现状（论文提纲范文）

（1）基于二代测序技术平台检测器官移植术后病原微生物的应用研究（论文提纲范文）

（3）卡氏肺孢子虫肺炎动物模型建立的现状（论文提纲范文）

（4）云南省人体寄生虫病流行概况（论文提纲范文）

（5）大鼠卡氏肺孢子虫DHFR和DHPS基因序列的测定与分析（论文提纲范文）

（6）耶氏肺孢子虫肺炎实验及临床诊断研究（论文提纲范文）

（7）艾滋病相关的人兽共患病（论文提纲范文）

（8）卡氏肺孢子虫肺炎动物模型实验诊断的研究（论文提纲范文）

（10）卡氏肺孢子虫体外无细胞培养体系的建立与瑞香素抗卡氏肺孢子虫的初步研究（论文提纲范文）

四、卡氏肺孢子虫病的实验诊断研究现状（论文参考文献）

• [1]基于二代测序技术平台检测器官移植术后病原微生物的应用研究[D]. 王啸晨. 江苏大学, 2020(02)
• [2]艾滋病合并肺孢子虫肺炎的实验室诊断方法进展[J]. 陈敬捷,何晗,苏凌松,秦松树,唐柳生,李世立,胡宏波,李勇. 中国临床新医学, 2011(06)
• [3]卡氏肺孢子虫肺炎动物模型建立的现状[J]. 谷俊朝,刘建,俞巍. 首都医科大学学报, 2009(05)
• [4]云南省人体寄生虫病流行概况[J]. 董莹,张再兴. 中国病原生物学杂志, 2009(08)
• [5]大鼠卡氏肺孢子虫DHFR和DHPS基因序列的测定与分析[D]. 杨霞霞. 遵义医学院, 2009(07)
• [6]耶氏肺孢子虫肺炎实验及临床诊断研究[D]. 韩晶. 青岛大学, 2008(07)
• [7]艾滋病相关的人兽共患病[J]. 刘德纯. 中国人兽共患病学报, 2007(08)
• [8]卡氏肺孢子虫肺炎动物模型实验诊断的研究[D]. 常志尚. 青岛大学, 2006(09)
• [9]脑囊虫病患儿细胞免疫功能研究[J]. 刘文彬,汤雪晴,郑淑梅,刘华君,许红波. 中国人兽共患病杂志, 2004(12)
• [10]卡氏肺孢子虫体外无细胞培养体系的建立与瑞香素抗卡氏肺孢子虫的初步研究[D]. 郑玉强. 重庆医科大学, 2003(01)

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