一、成体干细胞的研究及潜在应用（论文文献综述）
刘能青[1]（2021）在《不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究》文中研究说明背景:从各种人体组织和器官中可以分离出被称为间充质基质/干细胞（Mesenchymal stromal/stem cells,MSCs）的多能祖细胞,近10年其研究发展迅速,为细胞治疗和再生医学领域的发展提供了源源不断的动力。研究最广泛的MSCs来源包括骨髓、脂肪、脐带和胎盘等。国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therapy,ISCT）对MSCs制定了最低标准,包括细胞能够粘附在塑料皿上,并表达相应的分化簇（CD）标记（例如CD73、CD90和CD105标记）,并且可以在体外进行成脂,成软骨和成骨分化。MSCs的细胞治疗效能主要体现在分化潜能和免疫调剂能力上,特别是免疫调节能力让其在全身多个系统的炎性疾病中都显示出不俗的疗效。羊水中也能分离出与MSCs生物学特性高度一致的细胞,通常被定义为羊水间充质干细胞（Amniotic fluid mesenchymal stem cells,AFMSCs）或羊水来源干细胞（Amniotic fluid stem cells,AFSCs）。一般认为AFSCs介于胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和MSCs之间的中间阶段细胞,比起传统的MSCs具有更多良好的生物学特,如相比骨髓和脂肪来源的MSCs有更快增殖速度、更广泛的分化潜能、更强的免疫调节能力等。然而AFSCs具有显着的异质性,许多报道表明了AFSCs在细胞形态、分子表型和分化能力等多个方面存在不稳定性。细胞异质性带来的生物学特性的差异,在体外细胞增殖的过程中会进一步把这种差异扩大,进而影响临床细胞治疗效果的稳定性。而AFSCs异质性主要是因为其存在不同的组织器官来源,有研究指出羊水细胞中可以检测出骨髓、皮肤、肾、肝、肺、心等组织器官的特异性标记物。现今为止虽然已经有研究分离了不同组织特异性的AFSCs,但未对其进行深入的生物学特性检测以及临床治疗效能的评估。为此我们拟分离不同组织特异性的AFSCs,从多个角度的评估其生物学特性差异和治疗效能,为解决AFSCs异质性提供可行的思路,为AFSCs临床治疗应用提供更全面深入的理论基础。第一部分不同培养方法分离羊水来源的干细胞及其生物学特性分析目的:建立合适的AFSCs原代和传代培养方案,评估其生物学特性,同时与脐带间充质干细胞进行比较,为后续研究奠定实验基础。方法:1.建立三种培养模式,商品化培养基进行原代和传代培养（AFC）,传统间充质干细胞进行原代和传代培养（MSC）,以及商品化培养基进行原代培养和传统间充质干细胞进行传代培养（AFC-MSC）;2.通过克隆形成实验、CCK-8实验、群体倍增时间检测评估不同培养途径的培养效率;3.流式细胞仪检测细胞表面CD标志物;4.对不同培养途径获得的细胞进行成骨、成脂、成软骨分化,组织特异性染色和分化标志物基因的表达评估分化效果;5.把细胞与激活的外周血单个核细胞（PBMCs）进行共培养,通过CFSE增殖定量分析、增殖标记蛋白的表达及促炎因子的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.三种培养途径均能获得AFSCs细胞,但AFC培养途径效率更高,而MSC培养途径更廉价,AFC-MSC培养效率和成本处于两者之间;2.不同培养途径获得的AFSCs在在CD105的表达上存在差异,但不影响细胞形态、多能性基因的表达、分化潜能和免疫抑制能等主要生物学特性;3.与UCMSCs比较,AFSCs具有更高的成骨和成软骨分化能力,更强的免疫调节能力。结论:三种培养途径均可有效获得的AFSCs,CD105表达的差异不影响其他主要生物学特性,并具有比UCMSCs更强的分化潜能和免疫抑制能力。综合考虑时间和资金成本,选择AFC-MSC培养途径更合适。第二部分分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析目的:分离出不同组织特异性的AFSCs,从细胞形态、增殖能力、分子表型、多能性基因的表达、分化能力、迁移能力和免疫抑制能力等多个方面分析其差异。方法:1.通过机械挑克隆的方法分离出单个细胞形成的克隆并传代;2.对分离的克隆进行组织标记基因的检测,鉴定出不同组织特异性的AFSCs;3.显微镜下观察细胞形态,群体倍增时间分析增殖能力,β-半乳糖苷酶染色及细胞周期调控标志基因分析衰老程度;4.免疫荧光定性分析胚胎干细胞因子的表达,流式细胞仪定量分析细胞抗原决定簇和多能性因子的表达;5.进行成骨、成脂、成软骨分化,通过分化特异性染色的定性、定量分析及检测分化标志物基因的表达来评估分化程度;6.划痕实验、Transwell实验及检测迁移能力和趋化能力的标志基因评估细胞迁移能力;7.把细胞与激活的PBMCs共培养,通过CFSE细胞增殖实验、增殖标记蛋白的表达和促炎因子基因的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.从中孕期羊水分离的AFSCs能表达肺和肾组织特异性标记物,通过分离单细胞克隆并进行鉴定,可以分离出肾特异性AFSCs（AFSCs-K）、肺特异性AFSCs（AFSCs-L）和未知组织特异性AFSCs（AFSCs-X）;2.相比其他两组,AFSCs-K具有更快的增殖速率,更高的CD90、CD105和CD117的表达水平,更好的中胚层三系分化能力和更强的免疫抑制能力。但AFSCs-K具有更强的水平和垂直迁移能力,表达更多的迁移标志物基因,AFSCs-L则表达更多的趋化因子受体。3.分离后的不同组织特异性的AFSCs的各项生物学指标如细胞形态、增殖能力、分子表型、分化潜能等一致性更高,异质性大幅度降低。结论:AFSCs中可以分离出不同组织特异性的细胞,其生物学特性存在差异,总体上AFSCs-X的特性更优。按组织特异性分离后的细胞异质性大幅下降,细胞的各项指标更趋一致。分离不同组织特异性的AFSCs是解决细胞异质性的可行方案第三部分不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能目的:评估不同组织特异性的AFSCs在脓毒血症小鼠模型中的治疗效能。方法:1.使用盲肠穿刺法构建脓毒血症小鼠模型;2.对小鼠进行生存分析,构建生存曲线;3.对血液和腹腔液进行细菌培养,评估AFSCs的抗菌效能;4.Elisa分析血液中促炎因子的表达情况,评估AFSCs的抗炎效能。结果:1.不同组织特异性的AFSCs均能显着改善脓毒血症小鼠的存活率;2.不同组织特异性的AFSCs均能协助机体清除体内细菌,但以AFSCs-X的效果更为显着;3.相比AFSCs-L,AFSCs-K和AFSCs-X更能抑制促炎因子的表达,但两组之间无明显差异。结论:总体上AFSCs能改善脓毒血症生存率,具有抗菌抗炎的效果,其中以AFSCs-X的效果更为明显。
康莉[2]（2020）在《食管鳞癌中AKT和GSK3β驱动SOX2蛋白高表达的分子机制研究》文中认为食管鳞癌是原发于食管上皮组织的恶性肿瘤。长久以来,我国食管癌的发病率和死亡率位列世界首位。改善食管鳞癌发病率高和治愈率低的现状,需要全面而深入地探究食管鳞癌发生发展的调控机制。研究表明,SOX2异常表达促进多种肿瘤发生发展。在食管鳞癌中SOX2呈现蛋白水平的高表达和基因水平的异常扩增,但在SOX2高表达的肿瘤样本中,其基因水平的扩增只占少部分,提示我们导致肿瘤中SOX2高表达的机制仍有待研究。因此,本论文主要致力于探究SOX2的蛋白翻译后修饰对其蛋白稳定性的调控,并为精准靶向SOX2高表达的肿瘤治疗提供有力的理论依据。在食管鳞癌细胞中,我们发现SOX2的高表达广泛地受到蛋白稳定性的调控。我们实验室前期工作发现在胚胎干细胞中AKT激酶对SOX2蛋白稳定性具有重要的促进作用。基于AKT激酶通路在肿瘤细胞中广泛激活,我们在多株食管癌细胞系中研究了AKT是否通过调控SOX2蛋白稳定性促进其在食管癌中的高表达。我们证明了AKT是促进SOX2在食管癌细胞中高表达的重要驱动因子,并阐明了AKT在食管癌细胞中促进SOX2蛋白稳定性的分子机制。我们发现AKT通过磷酸化SOX2的T116抑制SOX2的蛋白酶体降解,进一步研究发现AKT是通过抑制泛素连接酶UBR5介导的蛋白酶体降解来促进SOX2蛋白稳定性,并发现UBR5通过催化SOX2的K115泛素化促进其发生蛋白酶体通路介导的降解。此外,我们发现AKT抑制剂能够显着下调SOX2的蛋白水平,并抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤干细胞的形成。综上,我们的研究揭示了AKT通过拮抗UBR5促进SOX2在食管癌高表达的新机制,并为通过靶向AKT治疗SOX2高表达的食管癌提供理论依据。在上述工作的基础上,为了深入探究SOX2高表达的分子机制,我们利用激酶抑制剂库在细胞水平上较系统地筛选调控SOX2蛋白水平的其它信号通路。我们发现GSK3β激酶抑制剂能显着下调食管癌细胞中SOX2水平,并且发现GSK3β激酶抑制剂通过下调SOX2蛋白稳定性下调SOX2蛋白水平。我们鉴定了GSK3β催化SOX2的磷酸化位点,发现GSK3β主要通过催化SOX2的251位丝氨酸的磷酸化来抑制SOX2蛋白酶体的降解。进一步的研究表明GSK3β主要通过抑制泛素连接酶复合体CRL4A与SOX2的相互作用,从而促进SOX2的蛋白稳定性。在生理状态下,此通路发挥着维持SOX2在食管基底层干细胞中高表达的重要作用。在病理样本中,GSK3β呈现异常高表达并与SOX2的蛋白水平存在正相关性。我们还通过小鼠荷瘤实验证明GSK3β的抑制剂能够有效的抑制SOX2高表达的食管鳞癌细胞的生长。综上,我们提出了GSK3β-SOX2通路是促进SOX2在生理和病理条件下高表达的新机制,此机制的阐释将有助于为食管鳞癌的精准治疗提供新的指导方案。
伟人悦[3]（2020）在《猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究》文中进行了进一步梳理心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）是目前全球范围内导致患者死亡的最主要因素之一。冠状动脉类疾病（coronary artery disease,CAD）是心血管疾病中的一种,其致病机理为:由于血管内皮功能障碍引发血管损伤或血管功能丧失,造成心脏的血液灌注减少,最终引发心肌缺血甚至心肌梗塞。但是传统的药物针对该类疾病的治疗具有很大局限性,因此细胞移植治疗成为相关医疗及科研人员的关注点。胚胎干细胞（embryo stem cell,ESCs）和诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell,i PSCs）是细胞移植治疗的种子细胞来源。但是ESCs的临床应用涉及到医学伦理问题和异体移植后的免疫排斥风险,i PSCs的应用将为心血管疾病的治疗提供便利。目前,很多研究人员对i PSCs向血管内皮细胞的定向分化进行了探索,相关研究主要集中在小鼠和人上。猪作为一种重要的农用家畜,其器官大小及生理学特征与人体具有很大的相似性,猪的寿命又相对较长,因而被认为是研究人类心血管及代谢性疾病的良好动物模型。对于猪诱导多能性干细胞的建系、培养及定向分化为血管内皮细胞体系的研究将为创建猪心血管疾病模型提供保障。目前,很多研究组通过不同的方法建立了猪i PS细胞系,但是关于其向血管内皮细胞定向分化的研究少之又少。2013年,Gu等首次报道了将猪脂肪间充质来源的i PSCs诱导分化为内皮细胞的方法,但其采用了周期较长且效率较低的拟胚体诱导分化途径,培养液成分也相对复杂。针对上述问题,我们进行了以下四部分研究:（1）使用无血清单层细胞诱导的方式对四种猪多能性干细胞系（猪胚胎来源的干细胞系Penk6和Pe WCHX,猪诱导多能性干细胞系Pilw4和M10）进行诱导分化,并检测细胞分化前期谱系特异性基因的表达趋势,从而筛选出中胚层分化潜能最高的猪多能性干细胞系;（2）使用不同的细胞因子或化学小分子组合对上述细胞进行诱导,筛选出促进细胞向中胚层分化的最优组合;（3）优化上述培养体系,建立一种无血清无饲养层的猪i PSCs向血管内皮细胞定向分化的诱导方法;（4）使用上述方法分别诱导人和猪的多能性干细胞向内皮细胞分化,并比较二者分化进程中的差异。研究结果表明,猪胚胎来源的Penk6和Pe WCHX细胞系在诱导分化过程中细胞形态无明显变化,猪诱导多能性干细胞M10和Pilw4在诱导分化过程中失去克隆形态并有部分细胞死亡。谱系特异性基因的表达检测结果显示,Penk6、Pe WCHX和M10细胞没有启动向原条期的分化且中胚层标记基因的表达变化无规律,Pilw4细胞的原条期、内胚层以及中胚层标记基因的表达水平均是先提高后下降,说明该细胞启动了分化进程。据此,我们选择猪诱导多能性干细胞系Pilw4进行后续实验。首先,我们使用四种前人报道的诱导人ESCs向血管内皮细胞分化的单层培养方法对pi PSCs进行定向诱导,在其中选择能够有效促进pi PSCs向中胚层分化的方法用于后续实验。接下来,我们对上述方法进行优化并研究了CHIR99201和BMP4在诱导分化前期的作用。实验根据第0至4天的不同处理方案分为6组进行:F,在第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2;FB,第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2和BMP4;BFB,第0至2天添加BMP4、第3至4天FGF2和BMP4;CF,在0至2天添加CHIR99201、3至4天添加FGF2;CFB,在0至2天添加CHIR99201,第3至4天添加FGF2和BMP4;CBFB,在第0至4天添加CHIR99021和BMP4,第3至4天添加FGF2和BMP4。上述6组从第5天开始处理一致:第5至7天培养液中添加VEGF和BMP4,8至10天换用商品化的内皮细胞培养液进行培养,第11天对细胞进行流式分选以及血管内皮细胞鉴定。实验结果显示,F、FB、BFB三组在诱导分化前期原条期标记基因的表达水平很低,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比仅为3.12%-5.16%;CF、CFB、CBFB三组在诱导分化前期原条期和内胚层标记基因的表达水平先上升后下降,中胚层标记基因表达水平持续上升,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比均高于12%,其中实验组CFB,CBFB的CD31阳性细胞率分别为21.3%和17.1%。以上结果表明,CHIR99201在pi PSCs向血管内皮细胞分化的前期具有促进作用,在诱导分化中期添加BMP4能够显着提高血管内皮细胞的诱导效率。此后,我们利用优化后的诱导步骤,从pi PSCs中获得了血管内皮细胞,该细胞具有与猪主动脉血管内皮细胞（AOCs）相似的形态、基因表达模式和功能特征。此外,我们使用相同的诱导步骤对人胚胎来源的干细胞进行诱导分化,结果表明人胚胎干细胞的分化效率远低于pi PSCs的分化效率,这可能与诱导过程中二者谱系基因表达模式上的差异相关。综上所述,我们建立了一种无血清的不依赖于饲养层的单层细胞诱导分化方法,可以将猪诱导多能性干细胞定向分化为具有功能的血管内皮细胞。该研究为评价大动物体内血管内皮细胞自体移植效果以及创建猪心血管疾病模型提供了可能。
杨玉花[4]（2020）在《人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究》文中研究表明背景:体细胞重编程可以产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。产生的患者特异性干细胞不仅能模拟人类疾病过程,研究发病机制,还能用于药物开发和筛选,以及为个性化再生细胞疗法提供新的机会。目的:探索一种快速简便、不损伤细胞活性、能高效产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）的方法,并评价应用该法获得的iPSCs在体外诱导为皮肤黑素细胞的可能性,为临床治疗色素性疾病提供研究基础。方法:1.分离酶消化修剪后包皮,获得表皮片,一部分做组织培养,另一部分进一步消化成细胞悬液培养。健康个体包皮来源的表皮片平铺在基质胶包被的培养板上培养3周,获得KCs,并进行KSCs标志物K15免疫荧光染色,证实表皮中KSCs的存在。胰酶消化表皮获得表皮KCs悬液,接种在预先IV型胶原包被的六孔培养板,留取15min内贴壁的细胞继续培养。培养24 h后,采用K15抗体、SOX2和OCT4抗体以及干细胞活细胞染料CDy1,进行染色。未染色孔的细胞用胚胎干细胞培养基继续培养1周,观察细胞形态,70%融合后传代培养。15 min未贴附的细胞也同步培养,作为对照研究。拔取的毛囊放入基质胶包被的培养板进行体外培养,分析毛囊KCs的OCT4和NANOG的DNA甲基化水平,与表皮中的KCs相比较。2.用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒转染富集的表皮KSCs获得iPSCs。观察和记录产生的克隆的形态和时间,采用干细胞标记物的相应抗体、碱性磷酸酶检测试剂盒、干细胞活细胞CDy1染料进行检测。分析OCT4和NANOG启动子区域的DNA甲基化水平,RT-PCR检测多潜能基因表达。采用含有不同因子的诱导培养基,诱导iPSCs分别分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs等。用携带4种转录因子的慢病毒转染毛囊KCs,观察iPSCs的形成。将iPSCs种植到SCID小鼠的后肢皮下,观察畸胎瘤的形成,获取畸胎瘤后,进行组织病理和免疫组化检测。从畸胎瘤中获取细胞,分别在KCs培养基、M254培养基和DMEM培养基中培养,观察细胞形态。3.分离酶消化修剪后包皮获得表皮片,通过不同培养方法分别获得KCs、MCs、成纤维细胞（fibroblasts,FBs）。用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒分别转染KCs、MCs并获得相应的iPSCs,FBs通过长时间胰酶消化获得Muse细胞。透射电镜观察人皮肤KCs、MCs及重编程产生的iPSCs和Muse细胞的超微结构。结果:1.表皮片贴附在基质胶包被的培养板底部,产生外向性生长的KCs,中心区域细胞体积小,表皮片外缘的细胞体积逐渐变大,细胞呈多边形。K15抗体染色显示,皮片中心区域阳性细胞密集,周边区阳性数目减少,证实KSCs的存在和大致分布。用胰酶消化未培养的表皮片,获得细胞悬液,这些细胞接种到IV型胶原包被的培养板后,15 min内大约有20～30%的细胞贴壁。快速贴壁的细胞体积较小。24 h后,细胞黏附牢固,部分开始增殖,K15染色和干细胞活细胞染料CDy1染色,明显阳性。而针对干性特异性标志物SOX2和OCT4的染色呈弱阳性。用胚胎干细胞培养基继续培养快速贴壁细胞1周,可见大小不等的克隆形成。相比之下,同步培养的慢贴壁细胞也有克隆形成,但比快速贴壁细胞的克隆小。拔取的毛囊很容易贴附到基质胶上,从毛外根鞘处爬出很多KCs,其中许多呈克隆样生长。传代培养的毛囊KCs和表皮KCs的SOX2和OCT4的甲基化水平相近。2.获得的表皮KSCs传代培养后,进行细胞转染。最早在第7天出现第一个克隆,在10天可见很多典型的iPSCs。干细胞特异性标记物SOX2、OCT4、NANOG和SSEA3染色阳性。干细胞活细胞CDy1染料呈阳性,碱性磷酸酶染色细胞呈紫红色。与亲本KCs相比,获得的iPSCs显示OCT4和NANOG启动子DNA去甲基化。RTPCR检测结果示:iPSCs中SOX2、OCT4、NANOG基因表达水平高于亲本的KCs,而亲本KCs的KLF4基因表达水平高于iPSCs。拟胚体在明胶包被的培养板生长良好,自分化培养可出现外胚层、中胚层和内胚层细胞。用不同分化培养基,诱导iPSCs逐渐分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs,特异性染色相应为AFP（+）、油红O染色（+）、βIII-微管蛋白（+）、神经丝（+）、HMB45（+）和TYR（+）。用四种因子转染毛囊KCs,同样可获得iPSCs。将产生的iPSCs注射到4周龄SCID小鼠后肢皮下,第8周肿瘤长到足够大小,切取畸胎瘤组织进行病理和免疫病理学检查。结果显示:Vimentin（+）、CK（pan）（+）和KI-67（+）阳性,GFAP和AFP染色为阴性。从畸胎瘤组织获得的单细胞,在KCs培养基中生长3周细胞小而圆体,核浆比大,细胞荧光仍然很强,培养6周后细胞排列紧密,细胞活力好,增殖快速。在DMEM培养基中生长3周时细胞主要是圆形,部分有突起,培养6周的细胞,细胞显出扁平形,类似纤维细胞的形态。在M254培养基中生长3周以细小圆形细胞为主,可见部分细胞有少量突触样结构,培养6周的细胞显示出细长的树突,类似MCs的形态。3.透射电镜显示KCs胞体大致呈方形,细胞核大,有一个核仁。MCs呈椭圆形,并且细胞核染色质聚集性差,胞质中可见膜包裹的黑素小体。MCs和KCs重编程产生的iPSCs的超微结构大致相同,细胞呈圆形,具有多个核仁,细胞质稀少,核浆比高,可见发育不良的内质网和高尔基复合体。FBs胞体呈梭型或不规则形,细胞核呈椭圆形或圆形,染色质丰富,细胞器较多。Muse细胞核质比高,细胞核有较多突起,核仁体积较大,细胞质内细胞器较少,相对幼稚。结论:1.KCs混悬液接种在IV型胶原包被的培养板中,15 min内贴壁的细胞富含KSCs。拔取毛发可获得大量的KCs,与表皮来源的KCs类似,包含大量的KSCs。2.用携带四种转录因子的慢病毒转染表皮KSCs,可高效率和较短时间出现iPSCs。这些细胞具有多能性,并可被诱导分化成为不同类型细胞。拔取毛发获的KCs可被重编产生iPSCs。iPSCs接种到SCID小鼠皮下,可产生肿瘤。畸胎瘤细胞在不同培养基中生长呈现不同形态。3.透射电镜显示KCs重编程产生得iPSCs的超微结构与MCs来源的iPSCs超微结构以及Muse细胞的超微结构近似,核浆比高,多个核仁,细胞浆中细胞器较少,且发育不成熟。
张昕[5]（2020）在《黄芩苷在乳腺发育中的作用及分子机制研究》文中研究说明目的:黄芩苷（Baicalin）在妇科疾病中具有的广泛的应用,本课题拟通过利用小鼠乳腺再生模型和乳腺成体干细胞体外培养扩增的实验体系,对中药黄芩的提取物黄芩苷在乳腺干细胞和乳腺发育中的作用及其机制进行深入研究。此外,由于成体干细胞与肿瘤有相似的生长调控机制,本课题在探索黄芩苷在乳腺发育的作用的同时,也进一步探索了黄芩苷对乳腺癌发生的影响,以期为黄芩在临床的应用提供更多的理论基础和建议。方法:1.黄芩苷对小鼠乳腺发育的作用考察将3周龄雌性小鼠用Baicalin处理,每两天处理一次,分别至5周、6周和8周时取小鼠乳腺进行全组织染色,考察小鼠乳腺发育情况。2.黄芩苷在体外对乳腺干细胞干性维持的作用研究利用流式细胞分选技术,通过CD24和CD29表面分子标记在谱系（CD31,CD45,TER119）阴性的细胞中分离乳腺基底细胞（CD24+CD29hi）;将基底细胞在基质胶中进行3D培养,培养过程中加入黄芩苷处理,测量处理后细胞克隆的大小;对黄芩苷处理的体外3D培养的乳腺基底细胞进行连续传代,每次传代时记录基底细胞克隆的数目。3.黄芩苷在体内对乳腺重建的作用研究体外连续传代培养的乳腺基底细胞进行体内移植实验,将黄芩苷处理的连续传代后的乳腺基底细胞克隆移植到3周龄的裸鼠乳腺脂肪垫,移植后饲养小鼠45至60天,取乳腺脂肪垫进行全组织染色,记录重建乳腺的数目和形态。4.黄芩苷对乳腺干细胞表面分子标记表达的调控黄芩苷处理的连续传代后的乳腺基底细胞,利用RT-qPCR、Western blot等技术考察乳腺基底细胞中乳腺干细胞表面分子标记蛋白C受体（Procr）的表达。5.黄芩苷对三阴乳腺癌的作用研究体外实验:培养三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,以DMSO处理作为对照组,在培养过程中分别加入不同剂量黄芩苷（100μM、200μM、400μM）处理,考察经黄芩苷处理后,三阴性乳腺癌细胞系中Procr的表达。体内实验:将三阴性乳腺癌细胞株移植到小鼠体内,用黄芩苷连续处理21天后,考察乳腺肿瘤生长情况。结果:黄芩苷在小鼠乳腺发育过程中能显着促进青春期小鼠（5周、6周）乳腺导管的延伸,对成年期小鼠的乳腺发育无显着作用（8周）,差异具有统计学意义（P<0.05）;体外3D培养乳腺干细胞并加入不同剂量黄芩苷处理后发现,黄芩苷能显着促进乳腺干细胞的克隆形成,增加连续传代后的乳腺干细胞数目,差异具有统计学意义（P<0.05）;将分离的乳腺干细胞移植至小鼠体内后,经黄芩苷处理,能显着提高乳腺干细胞再生乳腺的效率;黄芩苷能够显着提高乳腺干细胞干性维持相关基因Procr的表达（原代细胞与细胞系的mRNA水平,蛋白水平;以及原代细胞的流式分析均显示）;黄芩苷也会促进三阴乳腺癌中蛋白C受体的表达,导致三阴乳腺癌肿瘤体积变大。结论:黄芩苷能在体外培养过程中维持乳腺干细胞的自我更新;并在小鼠青春期促进小鼠乳腺发育;其作用机制与能够上调乳腺干细胞表面分子标记蛋白C受体的表达相关;在肿瘤模型中,黄芩苷会促进三阴乳腺癌的生长。
圣男[6]（2019）在《人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的研究》文中进行了进一步梳理在人体中,最大的器官是皮肤,它保护我们的机体免受外界的伤害,通过排出汗液带走多余的热量,同时皮肤还能够使我们感知冷暖并抵抗外界的压力。每年因烧伤死亡的人数不在少数。在我国,每年约有上千万人遭受不同程度的烧伤,其中有约5%左右的病人需要进行住院治疗。目前的临床治疗手段对于大面积深度烧伤病人的救治有较高的成活率。但是,烧伤病人治疗后的创面处由于形成瘢痕通常会丧失正常皮肤的许多功能,而疤痕组织由于不含有汗腺,导致汗液无法正常排出体外,丧失部分皮肤的散热功能,对病人的生活质量造成了严重的影响。汗腺的发生是一个非常复杂的过程,由于汗腺细胞是终末分化的体细胞,很难在体外进行大规模的培养。对于大面积深度烧伤病人,无法从病人身上取得自体汗腺细胞,而治疗过程中病人对汗腺细胞的需求量较大,这些问题导致汗腺再生的研究和功能性皮肤重建在临床上的应用发展缓慢。鉴此,如何使汗腺再生,构建功能性皮肤,从而提高大面积深度烧伤病人的生活质量,使目前临床烧伤救治面临的新挑战,其中汗腺再生的研究已经成为重要的课题之一。近年来,随着干细胞研究的深入,在皮肤损伤修复中干细胞发挥了一定的作用,也包括了汗腺的重建,其中骨髓间充质细胞（BMSCs）被用在重度烧伤救治中。虽然研究者对干细胞分化为汗腺细胞的研究取得了一部分进展,但是汗腺分化发育的具体机制还不够明确。因此,从干细胞分化到汗腺细胞的过程中寻找汗腺分化发育的机制,为汗腺的重建研究提供基础,具有重要的临床意义。皮肤组织工程中功能性汗腺的重建工作是当今医学研究的热点和难点问题,汗腺细胞体外培养增殖传代难的问题使得汗腺的重建缺乏种子细胞,干细胞汗腺细胞分化的研究取得了一定的进展,但是在培养体系和分化机制上还存在分歧。鉴此,本课题建立了人羊水干细胞体外分离、培养、鉴定的方法,建立了人外泌汗腺细胞体外分离、培养、纯化和鉴定的方法,利用条件培养基使人羊水干细胞分化为汗腺样细胞。同时,本课题证明了分化后的汗腺样细胞与人羊水干细胞相似,具有低免疫原性,为体外功能性汗腺重建提供了种子细胞,具有研究的创新性及重要的临床意义。同时在分化过程中,确定了有关键作用的分子,为其他类型干细胞分化为汗腺样细胞提供了理论基础,使汗腺的功能性重建成为可能,提高大面积烧伤病人救治后的生活质量。第一部分人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞及其生物学特性的鉴定目的:建立人羊水干细胞体外分离、培养、鉴定的方法,并建立了人外泌汗腺细胞体外分离、培养、纯化和鉴定的方法,利用条件培养基使人羊水干细胞分化为汗腺样细胞,为汗腺的功能性重建提供足够量的种子细胞。方法:（1）人羊水干细胞体外培养鉴定:将收集的羊水样本离心获得细胞,贴壁培养,用胰酶消化细胞,使用磁珠细胞分选法（MACS）对羊水细胞进行免疫磁珠分离,从中分离提取出CD117表达阳性的AFS细胞培养。用流式细胞仪技术测定AFS表面特异性抗原的表达。（2）汗腺细胞的分离培养鉴定:将婴幼儿多指样本去除皮下脂肪,放入含有双抗的PBS中浸泡,随后用PBS漂洗,用眼科剪将皮肤剪成小于1cm×1cm的组织小块,经DispaseⅡ酶4℃消化18小时,用镊子分离表皮和真皮。将去除表皮的真皮组织进一步用胶原酶Ⅳ在培养箱中消化1小时,待汗腺组织游离出,在倒置显微镜下挑取完整的汗腺组织（包括导管和腺体）用胰岛素针拉出盘旋在腺体中的部分导管,并切断导管和腺体的连接处,舍去导管和腺体的中间连接部分,将机械分离的腺体部分用汗腺培养基培养。倒置显微镜观察人外泌汗腺细胞形态;PCR分析汗腺细胞基因表达;免疫荧光染色技术检测体外培养的汗腺细胞的标志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表达。（3）人AFS细胞向汗腺样细胞分化:收集汗腺腺体细胞条件培养基（CM）,使用汗腺腺体分化培养基（汗腺培养基:条件培养基CM=1:1,额外添加50ng/ml的人表皮生长因子）对人AFS进行诱导分化,每天更换培养基。对分化后的汗腺样细胞进行RT-PCR,免疫荧光染色,流式细胞仪和透射电镜的检测。结果:（1）人AFS表达胚胎干细胞标记,部分表达间充质干细胞标记,不表达造血干细胞标记,其分化潜能介于ESCs和成体干细胞之间。（2）光学倒置显微镜下观察人外泌汗腺,游离出来的汗腺组织可以观察到盘曲成球的分泌部和较直的导管部;体外培养的人汗腺细胞呈典型的上皮细胞样,排列紧密,类似铺石路状,细胞边界明显,核清晰,具有一定的增殖能力;PCR结果显示,体外培养的汗腺细胞,不表达胚胎干细胞的干性指标Oct-4、Sox-2和Nanog,表达增殖相关基因Klf-4和c-Myc,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞指标K14、K8、K18和K19;免疫荧光染色结果显示,体外培养的人汗腺细胞表达角蛋白K14、K8、K18,以及汗腺特异性指标CEA。（3）利用汗腺腺体分化培养基（SGDM）成功将人AFS诱导分化为汗腺样细胞,细胞的形态从原来的间充质细胞样转变为上皮细胞样;RT-PCR结果表明汗腺发育相关基因EDA和EDAR在分化第14天有显着的升高,随后在分化28天时下降到正常汗腺细胞水平,汗腺分泌部分相关基因K8和CEA的表达有显着的升高,在28天分化后接近正常汗腺细胞的水平;免疫荧光染色结果表明分化后的汗腺样细胞表达EDA,EDAR,CEA,和K8,与正常人汗腺细胞类似;流式细胞仪技术检测人AFS分化为汗腺样细胞的效率大约为30%;透射电镜结果发现分化后的汗腺样细胞的细胞膜上存在有微绒毛这种汗腺细胞特殊的细胞结构。结论:本研究对人羊水干细胞体外分离,培养和鉴定进行了较全面的分析,并对人汗腺细胞的分离、纯化和传代进行了一系列分析,基本完成了对汗腺细胞的鉴定,这些为进一步研究人汗腺细胞提供了理论依据。在获得了良好的起始细胞和目的细胞的基础上,我们设计了一种全新的诱导分化培养基SGDM,能够诱导人AFS成功分化为汗腺样细胞,得到的汗腺样细胞经过检测与正常人汗腺细胞相类似,这为其他类型的干细胞分化得到汗腺样细胞奠定了基础,同时也为汗腺分化发育的研究提供了一条新的途径。第二部分人羊水干细胞源汗腺样细胞生物学功能的鉴定目的:建立SGDM介导的人AFS分化为汗腺样细胞的方法,并对其生物学特性进行鉴定,同时在分化的过程中,寻找汗腺分化的相关分子。方法:去除未分化的人AFS,将分化后的汗腺样细胞加入体外三位培养胶中,培养21天,取出进行切片,观察胶中的结构;取汗腺样细胞,更换培养基为添加CaCl2的汗腺细胞培养基,使用Fluo 3/AM进行染色,添加不同浓度的乙酰胆碱在共聚焦显微镜下观察Flou 3的荧光信号强度,并且使用流式细胞仪的方法检测荧光强度;将汗腺样细胞和人羊水干细胞与活化的T淋巴细胞共培养,观察在T细胞增殖方面的潜在影响;通过设计几种不同的分化培养基,分析CM中存在的未知因子（UFCM）和额外添加的EGF在SGDM中的作用。结果:（1）免疫组织化学的结果显示,分化后的汗腺样细胞能够在胶中形成类似于正常人汗腺结构的汗腺样结构,并且在胶中形成汗腺样结构的数量大约在24个。免疫荧光染色结果表明,结构中的汗腺样细胞表达汗腺分泌部分的指标EDA,EDAR,CEA,K8,K18,EMA,CD133和Na-K ATPase;（2）通过荧光强度的反映,乙酰胆碱提高了细胞中游离的Ca2+浓度,结果表明分化后的汗腺样细胞具有部分汗腺的功能性;（3）与活化的T细胞共培养,结果表明汗腺样细胞与人羊水干细胞相类似,具有低免疫原性;（4）几种不同分化培养基分化后细胞RT-PCR结果表明UFCM在SGDM中具有重要的作用,而EGF则可以提高SGDM的分化效率,进一步检测发现Shh可能包含在CM中并在汗腺样结构形成的过程中起重要作用。结论:在由汗腺腺体诱导分化培养基SGDM介导的人AFS分化为汗腺样细胞的过程中,鉴定得到的汗腺样细胞的功能型,包括分泌汗液的潜能,体外三维培养形成汗腺样结构的能力,抑制T细胞活化的能力,并在分化过程中寻找到存在于CM中与汗腺样结构形成相关的分子——Shh。这为干细胞分化为汗腺细胞的研究提供了一种新的方法,同时为汗腺分化发育的研究奠定了基础,使汗腺的功能型重建成为可能。
施昀[7]（2019）在《过表达LL37的肺成体干细胞对肺损伤和感染的保护作用研究》文中研究说明研究背景呼吸系统主要行使通气和换气功能,对维持人体的正常生命活动非常重要,呼吸系统的完整性依赖于其自身的先天免疫系统,它可保护人体免受各种微生物的感染并且对炎症反应有调节作用。在受到外界因素损伤后,呼吸系统上皮细胞会大量死亡并诱发炎症反应,从而导致肺部组织大规模的损伤,常导致各种急性和慢性的肺部疾病。这些疾病在进展到一定程度后,由于炎症和肺上皮层渗漏,经常反复发生感染,进一步会导致不可逆的肺纤维化进展。1986年,PJ Cole教授提出了着名的“恶性循环”理论来阐述支气管扩张和慢性阻塞性肺病的病理生理过程,该理论指出外界因素引起肺组织损伤,损伤的上皮细胞更容易被细菌感染,而反复感染可导致慢性炎症和更多的组织损伤,这样恶性循环最终会导致肺功能明显下降,甚至死亡。鉴于呼吸道感染已成为人类死亡的主要原因,且耐抗生素病例不断增加,增强宿主防御将成为一种极具临床潜力的策略。组织再生作为肺损伤的一种辅助治疗方法引起了广泛关注。正常的成人肺组织在受到伤害或刺激后可激活一群特殊的肺成体干细胞并通过再生过程修复受损肺组织。目前发现,有一群特殊的内源性肺干/祖细胞在维持肺的稳态和再生方面起到重要作用。其中,已有研究发现表达基底细胞限制性转录因子P63和角蛋白5的远端气道干细胞/祖细胞（DASCs）在肺损伤后具有强大的再生能力。流感性肺损伤可激活DASCs,并使其大量增殖并迁移至损伤区域通过再生修复损伤的肺组织,而且DASCs可以分化成为成熟的上皮细胞。因此,大量的体外扩增能力和移植后显着的肺整合能力使DASC成为肺疾病治疗的理想选择。抗微生物多肽（AMPs）是由动物、细菌和植物产生的多肽类物质,被认为是自然界的广谱抗生素,其是先天免疫的重要组成部分,具有广谱的抗微生物活性,包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。LL37是目前发现的唯一存在于人类体内的抗微生物多肽,已知其通过直接靶向微生物生物膜和刺激先天免疫细胞功能参与多种宿主防御过程。在肺炎患者肺组织中,LL37表达升高并且具有强大的抗感染和抗炎能力,提示LL37可作为常规抗生素的替代品来治疗肺部感染。然而,由于蛋白酶对LL37的作用,使其在体内的半衰期较短而限制了其在临床中的应用。此外,为了避免潜在的毒性,LL37需要在局部发挥作用而不是全身性的给药。因此,开发一种能够实现局部、长期释放LL37的方法对于肺部感染的治疗是非常必要的。呼吸系统受到外界有害物质损伤后会对病毒和细菌等微生物更加易感,最终恶性循环导致肺功能的丧失甚至死亡。因此将组织修复（DASC）和抗微生物（LL37）结合起来的新策略将成为呼吸系统复杂疾病的理想选择。目的1.观察小鼠源性DASCs（mDASCs）对小鼠博来霉素（BLM）肺损伤后的保护作用;2.观察抗微生物多肽LL-37对铜绿假单胞菌（PAO1）的抗菌作用并研究其相关作用机制;3.通过BLM肺损伤合并肺感染验证“恶性循环”理论,然后通过慢病毒转染技术使mDASCs表达LL37并观察LL37转染对细增殖、整合和分化能力的影响,进一步观察LL37-mDASCs的体外和体内抗菌作用以及对小鼠肺功能的影响;4.通过慢病毒转染技术使人源性DASCs（hDASCs）过表达LL37并将其移植到脱细胞化的大鼠肺中观察LL37-hDASCs的抗菌作用。方法1.分离、培养mDASCs,通过气管滴注BLM（3U/g）制作小鼠肺损伤模型,并在BLM损伤后7天通过气管移植mDASCs（1*106）,并在移植细胞7天和14天后通过体视显微镜观察干细胞在肺内的分布及整合;通过免疫荧光染色观察细胞在肺内的增殖,分化;通过HE和Masson染色观察mDASCs对BLM肺损伤的影响;测定肺羟脯胺酸含量并通过蛋白质印记法和免疫荧光染色检测肺内α-SMA表达的变化;通过检测小鼠动脉血O2饱和度、O2分压和CO2分压观察mDASCs对BLM肺损伤小鼠肺功能的影响;观察mDASCs对BLM肺损伤小鼠死亡率的影响。2.将不同浓度的人工合成抗微生物多肽LL37（80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、50μg/ml和2.5μg/ml）和PAO1（1*105 CFUs/ml）共培养12h,或将10μg/ml的LL37分别和1*105 CFUs/ml及1*106 CFUs/ml的PAO1共培养4h、4h、12h和24h,在波长595nm处测量OD值,观察其抗菌作用;将大鼠肺泡巨噬细胞NR8383给予脂多糖（LPS）刺激,Control组给予正常培养液培养12h,LPS组给予含1μg/mL LPS的培养液培养12 h,LL37组给予含10μg/ml LL37的培养液培养12 h,LPS+LL37组在1μg/mL LPS刺激的基础上,同时加入10μg/ml LL37培养12 h,LPS+LL37+anti-LL37组在上组基础上加入10μg/ml的LL37中和抗体。用CCK-8法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,酶联免疫吸附法检测细胞上清液肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的分泌水平,用蛋白质印迹法检测细胞P-NF-κΒp65蛋白表达水平。3.通过慢病毒转染使mDASCs表达LL37;通过细胞增殖实验观察LL37转染对细胞的影响;通过体视荧光显微镜观察比较mDASCs和LL37-mDASCs在肺内的整合;通过免疫荧光染色观察比较较mDASCs和LL37-mDASCs在肺内的增殖和分化;通过PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光染色观察LL37的表达;将mDASCs和LL37-mDASCs的细胞（1*106）或细胞上清同1*104CFUs的PAO1或者大肠杆菌（E.coli）共培养16h,并测定波长595nm处测量OD值或菌落计数观察LL37-mDASCs的抗菌作用;气管滴注BLM（3U/g）制作小鼠肺损伤模型7天后通过气管将30ul含有5*106CFUs的PAO1或E.coli的菌液和标记了GFP的mDASCs或LL37-mDASCs（1*106）通过气管滴入小鼠肺内,2天后取有荧光的肺叶并检测肺泡灌洗液（BALF）及肺组织匀浆中菌荷量;通过HE染色观察LL37-mDASCs对BLM损伤及感染的影响;通过对CD68分子免疫组织化学染色,观察BLM损伤及肺感染后LL37-mDASCs对肺内免疫细胞的影响;通过检测动脉血O2饱和度、O2分压和CO2分压观察LL37-mDASCs对BLM损伤及肺感染后小鼠肺功能的影响。4.通过慢病毒转染使hDASCs过表达LL37;通过PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光染色观察LL37的表达;制备脱细胞化大鼠肺,并将hDASCs和LL37-hDASCs移植入脱细胞化肺内,体式荧光显微镜下观察移植情况;将有细胞定植的肺叶和PAO1或E.coli（2*104CFUs）在24孔板（500μl）中共培养16h,在波长595nm处测量OD值,观察其抗菌作用。结果1.BLM损伤后7天后肺内会出现内源性的mDASCs并且具有增殖活性;将mDASC移植到BLM损伤的小鼠的肺内,发现mDASC可以在肺内定植,并随着时间延长可以在肺内形成肺泡样结构并且表达AECI的标志物AQP5、PDPN和HOPX;通过组织病理学改变及评分发现mDASC移植可以明显改善肺组织的损伤;此外,mDASCs可以降低肺内胶原的沉淀,抑制成纤维细胞的形成,改善小鼠肺功能,降低死亡率。2.LL37可以对铜绿假单胞菌有直接抑制作用,并且其抗菌能力具有浓度依赖性和时间依赖性;LL37可以减轻LPS导致的NR8383细胞活性下降和凋亡;LL37可以有效抑制LPS诱导的NR8383细胞促炎症因子的分泌;LL37可以抑制LPS导致的NR8383细胞P-NF-κΒp65蛋白的表达。3.小鼠肺在BLM损伤后对细菌感染的清除能力下降并且损伤更加严重;LL37转染对细胞的增殖、定植和分化能力没有影响;体外实验中,表达LL37的mDASC对PAO1或E.coli具有抑制作用,并且这种抗菌作用可以被LL37的中和抗体所抑制;体内实验中,LL37-mDASCs可以降低BALF和肺组织匀浆中的菌荷量,改善肺组织的损伤,明显减少肺组织内免疫细胞的浸润,改善损伤后小鼠的肺功能。4.LL37-hDASC可在脱细胞化的大鼠肺内定植并表达LL37;体外实验中,过表达LL37的hDASC对PAO1或E.coli具有抑制作用。结论1.mDASCs小鼠BLM性肺损伤具有保护作用;2.LL-37对PAO1具有直接抗菌作用并对LPS诱导的NR8383细胞损伤有保护作用,其机制可能和下调NF-κB信号通路,从而抑制炎性因子的产生有关。3.小鼠肺在BLM损伤后对细菌感染的清除能力下降并且损伤更加严重,LL37-mDASCs具有对PAO1或E.coli具有抑制作用,可以减轻BLM损伤及肺感染并改善肺功能。4.LL37-hDASCs对PAO1或E.coli具有抑制作用。
张桂龙[8]（2018）在《γ-干扰素在神经干细胞及其外泌体治疗缺血性脑卒中过程中的作用及机制研究》文中研究表明第一部分体外IFN-γ对NSCs活性、增殖、分化及氧化应激水平的研究目的本部分实验旨在通过从体外水平来研究IFN-γ对NSCs活性、增殖、分化及氧化应激水平的影响,并与其他四种细胞因子BDNF、VEGF、TGF-β1及IGF-1进行比较。方法提取胎鼠原代NSCs,通过细胞形态及免疫荧光鉴定细胞特异性标志物;用不同浓度IFN-γ对NSCs进行干预,通过细胞形态及CCK8评估其是否对NSCs有毒性,并用其他四种细胞因子BDNF、VEGF、TGF-β1及IGF-1进行对比评价细胞的增殖及分化情况;另通过WB及qPCR等检测IFN-γ对NSCs的状态、信号通路及氧化应激水平的影响。结果原代NSCs体外培养呈神经球样,表达特异性标志物Nestin,成功分化为神经元、星形胶质及少突胶质细胞。不同浓度IFN-γ对NSCs无毒副作用,在20ng/ml浓度时轻度促进细胞增殖,但与其他四种细胞因子无明显差异;在分化条件下,IFN-γ促进NSCs分化为神经元（Tuj1）的比例明显增多,能力优于其他四种细胞因子。此外IFN-γ在干预早期活化NSCs,激活下游Jak1/Stat1通路,及增加细胞内的氧化应激表达。结论成功提取培养了胎鼠海马区原代NSCs,IFN-γ对NSCs无明显毒副作用,在分化条件下IFN-γ能促进NSCs更多地分化为神经元;且IFN-γ在早期影响NSCs状态,增加细胞的抗氧化应激能力,及活化下游Jak1/Stat1信号通路。第二部分联合IFN-γ和NSCs体内移植治疗脑缺血大鼠的作用研究目的本部分实验旨在从体内水平通过联合IFN-γ与NSCs移植治疗缺血性脑卒中大鼠,探讨IFN-γ在NSCs移植治疗过程中的潜在作用。方法构建大鼠脑缺血MCAO模型,将不同浓度IFN-γ（50ng或500ng）单独或联合NSCs定向移植,通过m NSS和Rotarod评分来评估MCAO大鼠的神经功能改善情况,TTC染色计算治疗28天后的脑梗塞体积,尼式和TUNEL染色评估大鼠脑缺血区神经细胞的变性及坏死程度,双标免疫荧光染色（Brdu+DCX/GFAP）检测脑缺血区移植NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的情况,免疫组化评估MCAO大鼠脑缺血周围小胶质细胞（Iba1）及T细胞（CD4+和CD8+）的表达,ELISA检测脑脊液中4种促炎因子（IL1β、IL6、TNF-α和IFN-γ）和两种抗炎因子（IL-10和TGF-β1）的表达,及WB评估治疗后IFN-γ下游信号通路及体内氧化应激SOD2的表达。结果低浓度IFN-γ（50ng）协同增加了NSCs移植对MCAO大鼠的治疗作用,联合治疗后14天和28天的神经功能改善程度优于单独NSCs组,并进一步减少了脑梗塞体积;IFN-γ的协同治疗还保护了脑缺血区神经细胞的存活,增加了移植NSCs分化为神经元的比例。而高浓度IFN-γ（500ng）在体内却增加了炎症反应程度（如小胶质细胞和T细胞活性）,但对NSCs的治疗作用没有影响,NSCs共同移植后一定程度上减少了高浓度IFN-γ的炎症影响,降低了大鼠体内的炎症水平。IFN-γ下游Stat1信号通路被激活。结论单纯IFN-γ的体内移植对脑缺血大鼠神经功能改善无效,低浓度IFN-γ（50ng）与NSCs联合可协同促进脑缺血大鼠的神经功能恢复、减少神经细胞的凋亡与坏死,且促进移植NSCs更多地分化为神经元;而高浓度IFN-γ（500ng）在体内增加了神经炎症反应,NSCs的共同移植可以在一定程度上中和或减轻高浓度IFN-γ对其神经炎症影响。第三部分IFN-γ刺激前后NSCs来源外泌体在体外及体内中的作用研究目的因成功获得人源human NSCs（hNSCs）,后续实验在此细胞基础上进行。本部分实验旨在通过提取人源hNSCs培养上清中的外泌体,探索IFN-γ刺激前后hNSCs分泌的外泌体在体内外的潜在功能,并进行相关功能对比研究。方法从孕3月左右胎儿脑海马中提取原代hNSCs,通过细胞形态及免疫荧光等鉴定hNSCs基本特征。通过超高速离心及外泌体提取试剂盒提取hNSCs培养上清中的外泌体,进行了相关鉴定。通过过氧化氢H2O2构建细胞应激模型,利用IFN-γ刺激前后hNSCs分泌的外泌体进行干预,通过CCK8、活死细胞及免疫荧光染色等评价细胞活性及坏死凋亡情况;PKH67标记外泌体后评价其在体内外的迁移;并用外泌体定向移植治疗MCAO大鼠后评价大鼠的神经功能、脑梗塞面积、神经细胞增殖及神经血管重建等情况。结果原代hNSCs体外培养呈典型神经球样,明显表达特异性标志物Nestin、SOX2及Musashi1,并成功分化为三系;hNSCs来源外泌体具有外泌体典型大小及形态特征,明显表达特异性标志物Hsp70、CD63和Tsg101。体外实验示外泌体明显增加了H2O2应激模型下细胞的活力减少了细胞凋亡坏死,另外泌体还可影响hNSCs的分化方向。体内实验示外泌体可有效治疗MCAO大鼠,促进大鼠神经功能恢复、减少脑梗塞面积、保护缺血区神经细胞存活、增加神经细胞及微血管发生等,且以IFN-γ刺激后产生的外泌体效果尤甚。PKH67标记的外泌体在体外及体内均可顺利迁移至细胞内及进行远处迁移。结论成功提取了人源hNSCs及其培养上清中的外泌体;在体外水平发现外泌体可以在一定程度上缓解了H2O2模型下细胞的凋亡坏死并增加细胞的增殖活力;在体内水平则证实外泌体的定向移植可以有效改善脑缺血大鼠的神经功能、减少脑梗塞面积并促进了脑缺血区神经微血管重建,且以IFN-γ刺激后产生的外泌体疗效更加显着。第四部分NGS检测IFN-γ刺激前后NSCs外泌体中miRNA表达调控研究目的本部分实验旨在通过高通量测序检测IFN-γ刺激前后hNSCs分泌的外泌体中miRNA的表达差异,并验证及研究其中潜在功能miRNA,探讨外泌体的潜在调控机制。方法通过超高速离心获取IFN-γ刺激前后hNSCs分泌的外泌体,提取相关RNA后进行高通量测序;统计其中存在差异表达的miRNAs,进行靶基因预测及GO、KEGG分析。qPCR验证其中差异显着的miRNA,挑选3个miRNAs进行功能评价;通过转染miRNA minics进入hNSCs内后用H2O2应激模型评估细胞凋亡坏死,并利用外泌体转染特异性miRNA评价其对hNSCs的转导效应。结果对IFN-γ刺激前后hNSCs分泌外泌体中的RNA进行高通量测序及分析（如总Reads数及nc RNA注释等）,通过数据库对miRNAs数量进行统计及表达量校正,发现了47个差异表达miRNAs（24个上调和23个下调）;经调整差异倍数及P值（|log2（Fold Change）|≥2,且P<0.01）,对差异最显着的7个miRNAs进行了qPCR验证（hsa-miR-206、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-3151-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-3656、hsa-miR-34c-3p和hsa-miR-4677-5p）;另发现外泌体可将特异性Cel-miR-39-3p转导入hNSCs内成功表达,且转染了hsa-miR-133a-3p和hsa-miR-3656的hNSCs在H2O2应激模型下细胞凋亡比例下降。结论通过高通量测序分析了IFN-γ刺激前后hNSCs分泌外泌体中的miRNA表达,筛选出差异性表达miRNA后并用qPCR鉴定了其中差异最显着的7个miRNAs;证实了外泌体主要通过传导功能性miRNA进入细胞内发挥潜在生物学作用;其中IFN-γ刺激hNSCs后产生的外泌体可能主要是通过传导hsa-miR-133a-3p和hsa-miR-3656增加细胞应激能力来减少H2O2模型下细胞的凋亡坏死。
王庭亮[9]（2018）在《脂肪干细胞的部位特异性及ECM对其影响的研究》文中研究说明脂肪及脂肪干细胞在整形外科临床的应用范围越来越广泛,包括各种脂肪填充治疗,创面修复治疗,干细胞疗法等。然而,我们对它的特性并不完全透彻。目的:研究皮下脂肪与髌下脂肪垫来源的干细胞在分化与增殖等方面的差异。进一步通过高通量的转录组测序（RNA-seq）和蛋白组学,从基因表达谱和蛋白合成谱的角度去分析它们的差异与它们来源的关系。在前面的基础上,研究脱细胞细胞外基质对脂肪干细胞的促进作用,探讨两者结合的应用价值。方法:通过供体匹配的方法获取兔皮下脂肪和髌下脂肪垫,酶消化法获得相应的脂肪干细胞。研究其增殖速度,表面标志表达的差别。研究成骨分化,成软骨分化,成脂肪分化能力的差别。获取脂肪干细胞的RNA,下一代测序获取其表达信息,分析差异表达基因。获取脂肪干细胞的蛋白,蛋白质组学得到其蛋白表达谱信息,分析差异蛋白的分布及特征。获取人皮下脂肪干细胞,体外用脂肪干细胞在培养皿表面包被脱细胞细胞外基质,再将脂肪干细胞分别种植于普通培养皿和基质包被后的培养皿,研究细胞外基质对脂肪干细胞增殖能力和分化潜能的影响。结果:皮下脂肪来源的干细胞在增殖和成脂分化方面有优势,髌下脂肪垫来源的干细胞在成软骨方面有显着优势,两者在成骨分化方向没有显着差异。RNA-seq和蛋白质组学研究在基因和蛋白表达层面证明了髌下脂肪垫来源的干细胞天然地倾向于向成软骨方向分化,皮下脂肪来源干细胞则偏好成脂分化方向,并解释了后者增殖速度快的机制。脱细胞细胞外基质能够显着促进脂肪干细胞的增殖能力,并促进其成脂和成软骨分化能力。结论:髌下脂肪垫和皮下脂肪来源的干细胞存在显着的差异,它们展现的功能与部位相适应。髌下脂肪垫来源的干细胞天然地倾向于向软骨方向分化。皮下脂肪来源干细胞则更容易向成脂方向分化,并且表现出明显的增殖优势。脱细胞细胞外基质培养可在较长培养时间内维持脂肪干细胞的增殖能力,并可以促进其分化潜能,是一种有效的体外脂肪干细胞培养方式。
柯敏霞,纪猛,王皓,洪丹萍,吴月红,齐念民[10]（2018）在《干细胞模型研究进展及商业化应用的现状》文中指出背景:干细胞是具有自我更新能力的潜在的"永生化"细胞,是挖掘人类发育与衰老奥秘的关键,也是实现再生医学的核心。目的:总结胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞的生物学特性,评述其在细胞治疗和药物筛选中的临床及商业化应用现状,并浅析干细胞产业所面临的问题和前景。方法:应用计算机检索1995至2017年PubMed数据库、CNKI数据库中有关干细胞模型的相关文献,检索词为"干细胞,胚胎干细胞,成体干细胞,诱导多能干细胞,干细胞研究进展,干细胞治疗,药物筛选,stem cells,embryonic stem cells,adult stem cells,induced pluripotent stem cells,stem cell therapy,drug screening"。结果与结论:①干细胞模型根据其来源分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。不同来源的干细胞具有其独特的生物学优势;②胚胎干细胞具有发育全能性,但存在伦理道德争议;成体干细胞研究最为广泛和深入,应用最为普遍和成熟;诱导多能干细胞具有类似于胚胎干细胞的全能性,并且不受细胞来源、道德伦理等诸多限制,为干细胞应用带来了新的机遇;③干细胞在细胞治疗领域的应用技术最为成熟。目前已有多款成体干细胞商业化产品上市,用于细胞治疗;同时国际上也开展了多个利用胚胎干细胞和诱导多能干细胞进行细胞治疗的临床研究;此外,利用多能干细胞建立的细胞模型或疾病模型进行特异性药物筛选具有广泛的应用前景。
二、成体干细胞的研究及潜在应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、成体干细胞的研究及潜在应用（论文提纲范文）
（1）不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究（论文提纲范文）
| 缩略词英中文索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言总论 |
| 第一部分 不同培养方法分离羊水来源的干细胞及分析其生物学特性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基于分化潜能和免疫调节特性的羊水来源干细胞的治疗潜力 |
| 参考文献 |
| 附录 研究技术路线图 |
| 硕士研究生在读期间发表的论文及个人奖励 |
| 致谢 |
（2）食管鳞癌中AKT和GSK3β驱动SOX2蛋白高表达的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 转录因子SOX2的研究进展 |
| 1.1.1 SOX家族成员简介 |
| 1.1.2 SOX2功能的研究进展 |
| 1.1.2.1 SOX2在胚胎发育中的作用 |
| 1.1.2.2 SOX2在成体干细胞中的作用 |
| 1.1.2.3 SOX2与肿瘤的发生发展 |
| 1.1.3 SOX2蛋白的翻译后修饰 |
| 第二节 食管癌的研究进展 |
| 1.2.1 食管组织结构 |
| 1.2.2 食管癌的分型 |
| 1.2.3 SOX2在食管鳞癌中的作用 |
| 第三节 磷酸化修饰与肿瘤的研究进展 |
| 1.3.1 磷酸化修饰简介 |
| 1.3.2 磷酸激酶在肿瘤治疗中的作用 |
| 1.3.3 磷酸激酶AKT的研究进展 |
| 1.3.3.1 磷酸激酶AKT简介 |
| 1.3.3.2 AKT与肿瘤的发生发展 |
| 1.3.4 磷酸激酶GSK3β的研究进展 |
| 1.3.4.1 磷酸激酶GSK3β简介 |
| 1.3.4.2 GSK3β与肿瘤的发生发展 |
| 第四节 课题研究的意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 实验器材 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 试剂配方 |
| 2.1.4 表达质粒 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.1.6 抗体信息 |
| 2.1.7 抑制剂信息 |
| 2.1.8 细胞系 |
| 2.1.9 小鼠类型 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 RNA抽取和c DNA获取 |
| 2.2.2 分子克隆 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 稳定表达细胞系的建立 |
| 2.2.6 细胞增殖检测 |
| 2.2.7 免疫共沉淀 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 免疫染色 |
| 2.2.10 组织HE染色 |
| 2.2.11 免疫组化染色 |
| 2.2.12 体外纯化蛋白 |
| 2.2.13 peptide-pulldown |
| 2.2.14 体外磷酸化反应 |
| 2.2.15 小鼠异种移植模型 |
| 2.2.16 提取基因组DNA |
| 第三章 AKT驱动食管鳞癌中SOX2 蛋白高表达并促进肿瘤干细胞形成的分子机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 食管鳞癌中SOX2 的蛋白水平不完全依赖SOX2 的基因扩增 |
| 3.2.2 食管鳞癌中AKT正控SOX2 的蛋白水平 |
| 3.2.3 食管鳞癌中SET7对SOX2 蛋白没有显着调控 |
| 3.2.4 AKT促进SOX2 的蛋白稳定性 |
| 3.2.5 食管鳞癌中SOX2对AKT不存在反馈调节机制 |
| 3.2.6 AKT通过磷酸化SOX2-T116 促进SOX2 蛋白稳定性 |
| 3.2.7 筛选介导AKT促进SOX2 稳定的泛素连接酶 |
| 3.2.8 UBR5 促进SOX2 的泛素化降解 |
| 3.2.9 AKT通过抑制UBR5与SOX2 的互作促进SOX2 的稳定性 |
| 3.2.10 UBR5 催化SOX2的K115 的泛素化 |
| 3.2.11 UBR5 通过调控SOX2 影响细胞增殖和肿瘤干细胞形成 |
| 3.2.12 AKT抑制剂显着遏制肿瘤干细胞的形成能力 |
| 3.2.13 AKT通过调控SOX2 蛋白影响肿瘤干细胞的形成 |
| 3.3 总结与讨论 |
| 3.3.1 AKT-SOX2 调控通路的广谱性 |
| 3.3.2 多种泛素连接酶调控SOX2的蛋白稳定性 |
| 3.3.3 AKT抑制剂对食管鳞癌发生发展的影响 |
| 第四章 GSK3β促进食管基底层干细胞和食管癌中SOX2 蛋白稳定性的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 筛选调控SOX2蛋白的磷酸激酶 |
| 4.2.2 抑制GSK3β的活性促进SOX2 的泛素化降解 |
| 4.2.3 GSK3β促进SOX2 蛋白稳定性 |
| 4.2.4 GSK3β对 SOX2 的调控依赖于其激酶活性 |
| 4.2.5 GSK3β对 SOX2 的调控不依赖于AKT |
| 4.2.6 质谱检测GSK3β磷酸化SOX2 的位点 |
| 4.2.7 GSK3β磷酸化SOX2的S251 位点 |
| 4.2.8 GSK3β通过磷酸化SOX2-S251 促进其稳定性 |
| 4.2.9 筛选介导GSK3β促进SOX2 稳定的泛素连接酶 |
| 4.2.10 食管鳞癌中CRL4A复合体调控SOX2 蛋白稳定性 |
| 4.2.11 抑制GSK3β活性促进CUL4A与 SOX2 的相互作用 |
| 4.2.12 激活态的GSK3β和 SOX2 在食管基底层存在共定位 |
| 4.2.13 小鼠食管基底层存在Gsk3β对 Sox2 的调控作用 |
| 4.2.14 食管鳞癌中GSK3β和 SOX2 蛋白异常高表达并呈正相关 |
| 4.2.15 食管鳞癌中GSK3β转录水平异常激活 |
| 4.2.16 GSK3β通过调控SOX2 影响细胞增殖 |
| 4.2.17 GSK3β抑制剂影响小鼠荷瘤生长 |
| 4.3 总结与讨论 |
| 4.3.1 CRL4A复合体介导GSK3β调控SOX2 蛋白稳定性的机制探究 |
| 4.3.2 GSK3β-SOX2 通路的异常对食管鳞癌发生发展的影响 |
| 4.3.3 AKT-GSK3β通路对SOX2 蛋白稳定性的影响 |
| 4.3.4 GSK3β抑制剂对食管鳞癌的作用 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 科研成果 |
（3）猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 血管内皮细胞与心血管疾病 |
| 1.1.1 血管内皮细胞的发生 |
| 1.1.2 血管内皮细胞的病变与心血管疾病 |
| 1.1.3 心血管疾病的治疗现状 |
| 1.2 多能性干细胞 |
| 1.2.1 多能性干细胞的分类和特征 |
| 1.2.2 多能性干细胞应用的前景和挑战 |
| 1.3 多能性干细胞向血管内皮细胞的定向分化 |
| 1.3.1 多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究进展 |
| 1.3.2 多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的鉴定 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及材料 |
| 2.1.2 主要仪器及设备 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 常用试剂及配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 病毒包装 |
| 2.2.3 猪诱导多能性干细胞的建系 |
| 2.2.4 细胞多能性鉴定 |
| 2.2.5 Realtime-PCR检测 |
| 2.2.6 猪多能性干细胞向血管内皮细胞的诱导分化 |
| 2.2.7 流式细胞分选 |
| 2.2.8 血管内皮细胞的功能鉴定 |
| 2.2.9 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪多能性干细胞的获得及鉴定 |
| 3.1.1 猪诱导多能性干细胞的获得及鉴定 |
| 3.1.2 猪多能性干细胞的培养及鉴定 |
| 3.2 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层分化潜能的比较 |
| 3.2.1 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层诱导过程中的形态比较 |
| 3.2.2 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层诱导过程中谱系标记基因的表达比较 |
| 3.3 piPSCs向中胚层分化的诱导体系的筛选 |
| 3.4 piPSCs向血管内皮细胞诱导分化体系的建立 |
| 3.4.1 不同处理对piPSCs向中胚层分化过程中谱系标记基因表达的影响 |
| 3.4.2 不同处理对piPSCs向血管内皮细胞分化效率的影响 |
| 3.4.3 piPSCs来源的血管内皮细胞(pi PSC-ECs)的鉴定 |
| 3.5 piPSCs和 h ESCs向血管内皮细胞分化进程的比较 |
| 3.5.1 piPSCs和 h ESCs向中胚层分化过程中谱系标记基因的表达比较 |
| 3.5.2 piPSCs和 h ESCs向血管内皮细胞分化效率的比较 |
| 3.5.3 pi PS-ECs和 h ES-ECs的形态、基因表达和体外功能的比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层的分化潜能 |
| 4.2 猪多能性干细胞向中胚层分化的调控 |
| 4.3 猪诱导多能性干细胞来源的血管内皮细胞的鉴定 |
| 4.4 多能性干细胞向血管内皮细胞诱导分化体系的物种特异性 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（4）人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一章 富含干细胞的人皮肤角质形成细胞的获取 |
| 一、试剂和材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 人皮肤角质形成细胞重编程产生诱导性多能干细胞 |
| 一、试剂、材料和使用设备 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 诱导性多能干细胞超微结构的对比研究 |
| 一、试剂材料和仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 总结和展望 |
| 第四章 综述 |
| 综述 1 表皮干细胞增殖和分化机制研究 |
| 参考文献 |
| 综述 2 皮肤干细胞在皮肤再生及创伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述 3 人皮肤源性多潜能干细胞的研究现状和应用前景 |
| 参考文献 |
| 负责科研项目 |
| 参与科研项目 |
| 读博期间发表的论文 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（5）黄芩苷在乳腺发育中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 中药黄芩和黄芩苷的研究进展 |
| 一、黄芩的化学成分 |
| 二、黄芩的药理作用 |
| 三、黄芩苷的研究进展 |
| 第二节 乳腺和乳腺干细胞的研究现状 |
| 一、干细胞和成体干细胞的概述 |
| 二、哺乳动物乳腺的概述 |
| 三、乳腺干细胞(MaSC)再生的研究进展 |
| 四、乳腺癌的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 黄芩苷对小鼠乳腺发育的作用考察 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论与小结 |
| 第二节 黄芩苷在体外对乳腺干细胞干性维持的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三节 黄芩苷对乳腺干细胞干性维持的作用机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第四节 黄芩苷对三阴乳腺癌的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验内容 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 黄芩苷对小鼠乳腺发育的作用考察实验随机数字分组结果(n=36) |
| 附录二 黄芩苷对三阴乳腺癌的作用研究动物实验分组结果(n=12) |
| 附录三 统计学相关表格 |
| 附件三：统计学处理合格证明 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞及其生物学特性的鉴定 |
| 1. 试剂与材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人羊水干细胞源汗腺样细胞生物学功能的鉴定 |
| 1. 试剂与材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结和展望 |
| 课题资助 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（7）过表达LL37的肺成体干细胞对肺损伤和感染的保护作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、肺损伤的病理生理研究进展 |
| 二、干细胞在肺再生中的应用研究进展 |
| 三、抗微生物多肽的应用研究进展 |
| 第一部分 肺成体干细胞对小鼠博莱霉素肺损伤的保护作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 使用仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 方法 |
| 2.1 mDASC的分离和培养 |
| 2.2 实验动物模型的建立和处理 |
| 2.3 肺组织湿/干重(W/D)比例测定 |
| 2.4 肺组织病理学检测 |
| 2.5 肺组织免疫荧光染色 |
| 2.6 肺组织羟脯胺酸含量检测 |
| 2.7 WesternBlotting |
| 2.8 动脉血气分析 |
| 2.9 生存分析 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLM肺损伤后小鼠内源性mDASC的表达及特性 |
| 3.2 mDASC在小鼠BLM损伤肺组织中的定植和分化 |
| 3.3 mDASC对小鼠BLM性肺损伤的保护作用 |
| 3.4 mDASC可减少BLM损伤的肺组织中胶原的含量和α-SMA的表达 |
| 3.5 mDASC对 BLM性肺纤维化小鼠肺功能的保护作用 |
| 3.6 mDASC对 BLM性肺损伤小鼠生存率的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 LL37 的抗菌作用及其相关作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 使用仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 方法 |
| 2.1 铜绿假单胞菌的培养和计数 |
| 2.2 LL-37 抗菌实验 |
| 2.3 细胞的培养 |
| 2.4 LPS对 NR8383 细胞炎性损伤模型 |
| 2.5 NR8383 细胞活性检测 |
| 2.6 NR8383 细胞凋亡检测 |
| 2.7 细胞炎性因子检测 |
| 2.8 WesternBlotting |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LL-37对PAO1 的抗菌活性 |
| 3.2 LL37对LPS致 NR8383 细胞活性和凋亡的影响 |
| 3.3 LL37对LPS致 NR8383 细胞TNF-α和 IL-6 分泌水平的影响 |
| 3.4 LL37对LPS致 NR8383 细胞中P-NF-κΒp65 蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 表达LL37的mDASC对小鼠博莱霉素肺损伤及肺感染的保护作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 使用仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 方法 |
| 2.1 过表达LL37的mDASC的制备 |
| 2.2 实验动物模型的建立和处理 |
| 2.3 肺组织湿/干重(W/D)比例测定 |
| 2.4 小鼠肺泡灌洗的收集 |
| 2.5 肺组织病理学检测 |
| 2.6 肺组织免疫荧光染色 |
| 2.7 WesternBlotting |
| 2.8 实时荧光定量PCR |
| 2.9 LL37-mDASC的体外抗菌作用 |
| 2.10 LL37-mDASC体内抗菌作用 |
| 2.11 免疫组织化学染色 |
| 2.12 动脉血气分析 |
| 2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLM肺损伤对小鼠肺感染的影响 |
| 3.2 LL37 转染对mDASC的影响 |
| 3.3 LL37-mDASC体外抗菌作用 |
| 3.4 LL37-mDASC体内抗菌作用 |
| 3.5 LL37-mDASC对小鼠肺功能的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 过表达LL37的hDASC的抗菌作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 使用仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 方法 |
| 2.1 人源性DASC的分离和培养 |
| 2.2 大鼠肺脱细胞化和再细胞化 |
| 2.3 人源性DASC的体外抗菌作用 |
| 2.4 肺组织病理学检测 |
| 2.5 免疫荧光染色 |
| 2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 过表达LL37 人源性DASC的特性 |
| 3.2 大鼠肺的脱细胞和再细胞化 |
| 3.3 过表达LL37 人源性DASC的抗菌作用 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）γ-干扰素在神经干细胞及其外泌体治疗缺血性脑卒中过程中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一部分 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 博士在读期间发表文章及会议情况 |
| 致谢 |
（9）脂肪干细胞的部位特异性及ECM对其影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 皮下脂肪与髌下脂肪垫来源脂肪干细胞的分离与差异分析 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 脂肪干细胞的转录组测序与蛋白质组学研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三部分 脱细胞细胞外基质对脂肪干细胞的功能影响研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文与科研成果目录 |
（10）干细胞模型研究进展及商业化应用的现状（论文提纲范文）
| 文章快速阅读: |
| 文题释义: |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 文献筛选标准 |
| 2 结果Results |
| 2.1 干细胞模型 |
| 2.1.1 胚胎干细胞 |
| 2.1.2 成体干细胞 |
| 2.1.3 诱导多潜能干细胞 |
| 2.2 商业化应用现状 |
| 2.2.1 细胞治疗 |
| 2.2.2 药物筛选 |
| 3 讨论Discussion |
四、成体干细胞的研究及潜在应用（论文参考文献）
- [1]不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究[D]. 刘能青. 广州医科大学, 2021
- [2]食管鳞癌中AKT和GSK3β驱动SOX2蛋白高表达的分子机制研究[D]. 康莉. 华东师范大学, 2020(02)
- [3]猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究[D]. 伟人悦. 东北农业大学, 2020(04)
- [4]人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究[D]. 杨玉花. 苏州大学, 2020(06)
- [5]黄芩苷在乳腺发育中的作用及分子机制研究[D]. 张昕. 广州中医药大学, 2020(06)
- [6]人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的研究[D]. 圣男. 苏州大学, 2019
- [7]过表达LL37的肺成体干细胞对肺损伤和感染的保护作用研究[D]. 施昀. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [8]γ-干扰素在神经干细胞及其外泌体治疗缺血性脑卒中过程中的作用及机制研究[D]. 张桂龙. 东南大学, 2018(01)
- [9]脂肪干细胞的部位特异性及ECM对其影响的研究[D]. 王庭亮. 上海交通大学, 2018(06)
- [10]干细胞模型研究进展及商业化应用的现状[J]. 柯敏霞,纪猛,王皓,洪丹萍,吴月红,齐念民. 中国组织工程研究, 2018(05)