一、毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在链霉菌中的表达研究（论文文献综述）
叶书林[1]（2021）在《木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究》文中研究说明目的:同种异体器官移植是治疗终末器官衰竭的有效手段。为了维持移植物在受者体内的存活,往往需要长期服用免疫抑制剂。一方面,术后器官排斥反应因免疫抑制剂的使用得以降低;另一方面长期应用免疫抑制剂的不良反应严重影响移植物和移植患者的存活,是移植免疫学和临床医学研究亟待解决的一大难题。中药免疫调节相关的基础研究和临床研究取得许多新的进展,从中药中寻求高效、低毒的免疫抑制剂是当今移植免疫学领域的研究方向之一。木犀草素是一种黄酮类化合物,研究表明木犀草素具有许多药理作用,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和神经保护等。在免疫调节作用方面的研究中发现木犀草素可以抑制小鼠T细胞的增殖和活化,下调IFN-γ、IL-6、IL-5等细胞因子的表达,具有免疫抑制作用。此外,还可以通过诱导CD4+CD25T淋巴细胞向CD4+CD25+调节性T细胞分化来减轻气道炎症。然而,目前木犀草素对于同种异体器官移植排斥反应方面的作用研究仍为空白。由于皮肤上抗原呈递细胞很多,排斥反应比其他器官移植更强,若药物能抑制皮肤排斥反应,则更能抑制其他器官移植排斥。因此,本实验首先通过小鼠同种异体皮肤移植模型探讨木犀草素对移植排斥反应的作用,再以同种异体胰岛移植模型进行验证,研究木犀草素对小鼠同种异体器官排斥反应的作用,以及其免疫调节的作用机制。方法:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究建立小鼠皮肤移植模型,以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植皮片生存时间的影响,用中位存活时间（Mediansurvival time,MST）表示;移植10天后,取移植皮片检测炎症细胞浸润、CD3、Foxp3及相关细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17a、Foxp3基因的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和外周引流淋巴结检测CD4+CD44high CD62Llow 和 CD8+CD44high CD62Llow 效应 T 细胞、CD4+Foxp3+调节性 T细胞、CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟树突状细胞的比例。木犀草素联合应用Anti-CD25删除小鼠体内Treg对小鼠皮肤移植反应的实验研究,分为四组:同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）、木犀草素高剂量联合同型对照组（Lut-H+Isotype,木犀草素50mg/kg灌胃联合Isotype抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,以及木犀草素高剂量联合Anti-CD25抗体组（Lut-H+PC61,木犀草素50mg/kg灌胃联合PC61抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,观察移植皮片生存时间,同时检测移植10天后脾脏和淋巴结中CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟DC的比例。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究以BALB/c小鼠胰岛细胞为供体,移植到STZ诱导的糖尿病C57BL/6小鼠肾包膜下,建立小鼠同种异体胰岛移植模型。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体胰岛移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植后血糖的影响,用中位存活时间（Median survival time,MST）表示;移植10天后,取胰岛移植物检测胰岛素、炎症细胞浸润及CD3+T的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和引流淋巴结通过流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验流式细胞术分选CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8法检测木犀草素对体外CD3+T细胞的细胞毒性,CFSE法检测木犀草素对体外CD3+T淋巴细胞增殖的影响,ELISA检测CD3+T细胞上清液中细胞因子IFN-y、IL-10和IL-17a蛋白的表达水平,流式细胞术分选CD4+CD25-T,检测木犀草素干预后对CD4+CD25+Treg的分化情况,Western Blotting检测木犀草素干预后CD3+T细胞中AKT/mTOR信号通路的蛋白表达。结果:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素低剂量组和高剂量组均能延长移植皮片的存活时间[MST=23.50±5.34（Lut-low）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.05;MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.01]。此外,与雷帕霉素组比较,木犀草素高剂量组在延长皮肤移植物存活率的作用差异无统计学意义（MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.35.00±6.70（Rapa）,P>0.05）。（2）在移植皮片中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均能改善炎症细胞浸润,抑制CD3+T淋巴细胞浸润,上调Foxp3的表达,同时抑制促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17amRNA的表达,上调IL-10和Foxp3mRNA的表达。（3）在受体小鼠淋巴器官脾脏和淋巴结中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均可显着降低CD4+CD44highCD62Llow和CD8+CD44highCD62Llow 效应 T 细胞以及 CD11c+CD86+和 CD11c+CD80+成熟 DC 的比例,同时显着增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例（P<0.05或P<0.01）。（4）在应用Anti-CD25抗体删除Treg后,可逆转木犀草素延长移植皮片生存时间的作用,同时逆转对成熟DC的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素可延长移植术后胰岛的存活时间。（2）在胰岛移植区域,与对照组相比,木犀草素可减轻炎症细胞浸润。（3）在受体小鼠周围淋巴器官中,与对照组相比,木犀草素可上调移植后引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验（1）不同浓度的木犀草素（1.25、2.5、5、10和20μM）给药48h和96h后,仅20μM浓度木犀草素对T细胞有活力有明显抑制作用（P<0.01）。（2）在T细胞增殖实验中,与对照组相比,木犀草素低浓度（Lut-low,2.5μM）和木犀草素高浓度（Lut-high,5μM）组与雷帕霉素组（Rapa,0.1μM）一样,均能显着抑制T细胞的增殖（P<0.01）。（3）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能显着抑制CD3+T细胞上清液中IFN-y和IL-17a的蛋白水平（P<0.01）,并上调IL-10蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01）。（4）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能明显促使CD4+CD25-T细胞向CD4+Foxp3+Treg分化（P<0.01）。（5）木犀草素（无论低浓度还是高浓度）能有效抑制P-p70S6K、P-mTOR和P-AKT蛋白的表达（P<0.01）,而雷帕霉素组对P-AKT蛋白的表达无明显作用（P>0.05）。结论:我们实验结果揭示了不管是在小鼠同种异体皮肤移植模型中还是胰岛同种异体移植模型中,木犀草素均可显着延长移植物的存活时间,提示木犀草素可抑制同种异体器官移植排斥反应,其潜在的作用机制可能是通过抑制效应性T细胞的增殖、DCs的成熟,同时诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,以及抑制AKT/mTOR信号通路的激活而实现的。因此,我们的研究填补了木犀草素在抑制移植反应作用方面的空白,木犀草素在自然界中来源广泛,无明显毒副作用,作为一种潜在的免疫抑制剂,具有进一步深入研究的价值。
周树波[2]（2021）在《兰坪虫草多糖联合顺铂增强Lewis荷瘤小鼠的抗肿瘤活性研究》文中研究指明癌症是全球重要的公共卫生问题,2020年全球癌症统计分析报告指出,肺癌是全球导致死亡人数最多的癌症。肺癌在临床上的治疗方法主要包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗和免疫治疗。近年来,中医药在肺癌患者的治疗中体现了独具特色的疗效,尤其是中药与化疗的联合使用,可增强化疗的敏感性,缓解耐药性,降低不良反应发生率,改善患者生活质量。因此,为了提高肺癌的诊疗效果,探索中医药与常规西医疗法的协同作用,具有重要的理论研究价值和应用潜力。兰坪虫草（Ophiocordyceps lanpingensis）是一种生长在喜马拉雅山脉东部的虫生真菌。长期以来,当地少数民族将其作为传统的药食两用真菌,用来预防和治疗泌尿系统疾病。我们的前期研究表明,兰坪虫草可以改善小鼠的急性肾功能衰竭,进一步研究证明多糖可能是兰坪虫草的主要活性成分。本研究旨在探讨兰坪虫草多糖A组分（component A of O.lanpingensis polysaccharides,OAP）联合肺癌常用化疗药物顺铂（Cis-dichlorodiammine platinum（II）,cisplatin,DDP）,用以增强Lewis荷瘤小鼠的抗肿瘤活性研究。本论文的研究内容包括以下三个方面:1.兰坪虫草多糖的制备和组分分析兰坪虫草在以美洲大蠊为主要成分的固态培养基中生长成熟,收集菌丝体,干燥后制成兰坪虫草菌粉。兰坪虫草菌粉在用水浸提,然后加入无水乙醇（体系乙醇浓度为75%）在4℃过夜,获得粗多糖沉淀。将粗多糖用水溶解,采用Seavge方法除蛋白杂质。经活性炭脱色后,进行透析,最后冷冻干燥多糖。将冻干的多糖溶解在蒸馏水中,使用DEAE-SepharoseTM Fast Flow柱,用氯化钠溶液进行梯度洗脱,收集0.1 M氯化钠洗脱液,去离子水中透析72 h,冻干获得的A组分多糖,即兰坪虫草多糖A组分（OAP）。OAP相对分子量约为1.6×104 Da,主要由甘露糖,葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖和岩藻糖这五类单糖组成。2.兰坪虫草多糖联合顺铂增强荷瘤小鼠脾脏的免疫力60只C57BL/6雄性小鼠随机分为6组,除空白对照组（Control）外,其余5组均接种Lewis肺癌细胞,分别为:模型组（Model）;兰坪虫草A组分多糖组（800 mg/kg OAP）;顺铂组（2 mg/kg DDP）;兰坪虫草A组分多糖低剂量-顺铂组（400 mg/kg,OAPL-DDP）;兰坪虫草A组分多糖高剂量-顺铂组（800 mg/kg,OAPH-DDP）。当小鼠皮下移植瘤体积约为50 mm3时,使用OAP和DDP同时治疗相应组别中的小鼠。OAP每天灌服一次,DDP每两天腹腔注射一次。在给药后的第18天,获取血液样本以及肿瘤组织和脾脏用于相关生理生化参数的检测和分析。结果表明:OAP与DDP联合用药时,OAP可以缓解DDP化疗导致体重下降的毒副作用,提高化疗小鼠的生存质量。OAP抑制荷瘤小鼠脾脏指数升高,以及脾脏形态学和病理学的异常改变;还可缓解DDP化疗导致的脾脏指数下降,一定程度恢复脾脏形态学和病理学损伤。进一步分析表明,OAP缓解了荷瘤小鼠脾脏的炎症反应,增加了Th2型抗炎细胞因子（IL-10和IL-13）的表达,修复DDP化疗诱导的脾脏损伤,维持DDP化疗时脾脏的正常功能。此外,OAP刺激小鼠脾脏表达IL-2和IFN-γ,升高机体血清中IL-2和IFN-γ的含量,进而促进脾脏CD4+T,CD8+T和NK细胞的增殖,增强荷瘤机体的免疫力。3.兰坪虫草多糖联合顺铂增强荷瘤小鼠的抗肿瘤活性采用免疫组化法检测肿瘤组织细胞增殖标记Ki67和PCNA的表达水平,用TUNEL荧光染色法观察组织细胞的凋亡情况。采用实时荧光定量PCR,蛋白免疫印迹分析和免疫荧光检测肿瘤组织中PI3K/AKT/m TOR/STAT3/HIF-α/PD-L1的m RNA和相关蛋白表达水平。结果表明:OAP可以抑制Lewis荷瘤小鼠肿瘤的生长,与DDP联用时,进一步增强了荷瘤小鼠的抗肿瘤活性,具有与DDP明显的协同增效作用。OAP可以明显抑制荷瘤小鼠肿瘤组织细胞的增殖,减少Ki67和PCNA的表达,促进肿瘤细胞凋亡。同时,OAP可以通过抑制肿瘤细胞PI3K/AKT/m TOR信号途径的激活,进而抑制STAT3的活化和HIF-1α的表达,降低了肿瘤细胞PD-L1的表达,可能有助于弱化肿瘤细胞PD-1/PD-L1免疫逃逸,最终表现出良好的抗肿瘤活性。
尚可[3]（2021）在《肺癌源性吲哚胺2,3-双加氧酶1在T细胞耗竭中的作用及其抗癌免疫治疗的实验研究》文中研究指明研究背景:肺癌的发病率和死亡率已位居世界恶性肿瘤之首,目前,我国人群肺癌的术后复发率高,预后差,晚期患者5年生存率低于20%。肺癌已逐渐成为严重危害我国居民生命健康的常见及重要疾病之一。因此,寻找高效安全的预防治疗肺癌的方法一直是肿瘤研究的重大课题。近年来研究发现,肿瘤发生过程中,会伴随着一种T细胞功能的异常现象--T细胞耗竭（T cell exhaustion）,近期有研究结果提示:在黑色素荷瘤小鼠,会发生T细胞耗竭,其表现为抑制性受体PD-1上调,其分泌的细胞因子IL-2、TNF-α会减少。肿瘤的发生、发展是肿瘤细胞与免疫细胞之间相互对抗的过程,特别是T细胞起着很重要的作用,如果T细胞发生耗竭将会引起免疫功能减弱,肿瘤的免疫耐受以及导致肿瘤免疫治疗无效,因此深入探讨T细胞耗竭的特点及其相关机制将为肿瘤的免疫治疗提供新思路,不但有重要的理论意义,而且还有较强的应用价值和临床意义。吲哚胺2,3–双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）IDO是机体内重要的内源性免疫负调控分子,IDO是细胞内一种含亚铁血红素的酶,是肝外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶,在维持机体免疫稳态、移植耐受、肿瘤局部免疫抑制微环境的形成,以及介导肿瘤的免疫逃逸中发挥了十分重要的作用。Munn等研究发现,IDO1不仅表达于肿瘤相关细胞,如DC、巨噬细胞、内皮细胞,而且高表达于肿瘤细胞。Que Z等研究发现,IDO1在小鼠的非小细胞肺癌中表达,通过增加IDO1的表达,促进Treg细胞增加,从而产生免疫抑制。Mittal,R等在小鼠肺癌实验中研究发现,肺癌小鼠的CD4+T细胞、CD8+T细胞中抑制性受体PD-1,BTLA的表达比正常小鼠的高,且肺癌小鼠CD8+T细胞分泌的细胞因子IFN-γ、IL-2比正常小鼠的低。Cara C.Schafer等在小鼠肺癌模型的研究发现,基因敲除IDO-/-的肺癌小鼠能降低肿瘤大小,降低肿瘤浸润的CD4+、CD8+T细胞耗竭的PD-1的表达,说明IDO缺失能抑制T细胞的耗竭。前期有研究发现,DC中的IDO1高表达会升高PD-1、TIM-3、BTLA的表达,引起T细胞耗竭,沉默DC中的IDO1会下调T细胞耗竭相关的抑制性受体,减少T细胞耗竭,且肿瘤细胞中的IDO1高表达能抑制T细胞的细胞毒性作用,促进Treg细胞的产生,那么肿瘤中IDO1与耗竭性T细胞是否相互影响?肿瘤中的IDO1高表达是否促进T细胞耗竭,都是值得探讨的问题。目前关于IDO1与肿瘤的相关研究主要集中在肿瘤免疫耐受方面,而肿瘤环境中IDO1与耗竭性T细胞的关系报道甚少,肺癌中的IDO1是高表达的。本研究将构建IDO1低表达的肺癌细胞株与耗竭性T细胞共培养,研究IDO1表达与T细胞耗竭的作用;体内用IDO1高表达的肺癌细胞株接种小鼠,建立肺癌荷瘤小鼠模型,再用IDO1-sh RNA治疗荷瘤小鼠,观察其T细胞耗竭及肿瘤生长情况。综上所述,我们提出以下假设:（1）肺癌细胞中的IDO1高表达会导致T细胞抑制性受体PD1、BTLA的过表达,从而导致T细胞耗竭、促进肿瘤的发生。（2）体内肿瘤中IDO1低表达,可以抑制T细胞耗竭,重新建立抗肿瘤免疫,从而抑制肺癌的生长。本研究将从以下几个方面进行:（1）肺癌源性IDO1在耗竭性T细胞中的作用;（2）肺癌中IDO1低表达抑制T细胞耗竭及肿瘤生长的体内实验研究,观察瘤源性IDO1对耗竭性T细胞的生物学特性,从而进一步探讨肺癌中的IDO1在T细胞耗竭中的作用机制,为肺癌的免疫治疗提供靶向依据。第一部分肺癌源性IDO1在耗竭性T细胞中的作用的体外实验研究目的:应用RNA干扰（RNA interfering,RNAi）技术沉默吲哚胺2,3双加氧酶1（IDO1）,观察IDO1-si RNA对Lewis肺癌细胞株（Lewis lung cancer cells,LLC）的IDO1沉默效果;验证肺癌细胞中IDO1表达下调对T细胞耗竭的影响。方法:采用IDO1-si RNA沉默LLC细胞中的IDO1的表达后,通过实时荧光定量PCR法检测IDO1m RNA的表达变化,Western-blot法检测IDO1蛋白的表达变化;建立了肺癌LLC荷瘤小鼠模型,从小鼠的淋巴结中分离了T细胞,再分别和IDO1-si RNA处理的LLC细胞、Gl2-si RNA处理的LLC细胞和未处理的LLC共培养,检测T细胞的增殖和凋亡情况,耗竭性T细胞的抑制性受体PD-1和BTLA的表达。结果:实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,IDO-si RNA转染LLC细胞后,IDO1 m RNA和蛋白的表达明显降低;IDO1-si RNA处理的LLC和T细胞共培养,T细胞增殖能力相对于阴性对照Gl2-si RNA组显着增加（Gl2-si RNA:74.4±1.5,IDO1-si RNA:82.5±2.3）,凋亡能力显着降低（Gl2-si RNA:73.63±1.85,IDO1-si RNA:13.83±1.34）。IDO1-si RNA处理的LLC和T细胞共培养组中的CD8+T细胞的抑制性受体PD-1和BTLA（PD?1:8.37±1.17%;BTLA:5.06±0.47%）的表达明显低于和Gl2-si RNA处理的LLC细胞共培养组（PD?1:15.8±1.18%;BTLA:7.34±1.02%）和未处理的LLC细胞共培养组（PD?1:16.8±2.3%;BTLA:7.83±1.07%）。结论:体外通过RNA干扰（RNA interfering,RNAi）技术沉默IDO1的表达切实可行,在体外沉默了LLC细胞中的IDO1的表达能抑制T细胞的凋亡,促进T细胞增殖,并且抑制了T细胞的耗竭。第二部分肺癌中IDO1低表达抑制T细胞耗竭及肿瘤生长的体内实验研究目的:研究IDO1敲低对肺癌荷瘤小鼠T细胞耗竭的作用及对其肿瘤生长的影响。方法:建立了LLC肺癌荷瘤小鼠模型后,通过流式细胞术检测肺癌荷瘤小鼠和非肿瘤小鼠淋巴结和脾脏中的CD4+、CD8+T细胞含量以及T细胞耗竭抑制性受体PD-1和BTLA表达情况,ELISA法检测细胞因子TNF-α和IL-2的分泌,然后使用IDO1-sh RNA、Scramble-sh RNA质粒尾静脉注射入荷瘤小鼠体内进行肿瘤治疗,免疫组化检测各处理组肺癌荷瘤小鼠IDO1的表达差异,游标卡尺测量肿瘤的大小,天平称量肿瘤的重量;再通过流式细胞术、ELISA法检测淋巴结和脾脏中的CD4+、CD8+T细胞耗竭的抑制性受体PD-1和BTLA表达情况,以及细胞因子TNF-α和IL-2的分泌情况。结果:相比正常小鼠模型,肺癌荷瘤小鼠能增加CD4+、CD8+T细胞PD-1、BTLA的表达;肺癌荷瘤小鼠经给予IDO-sh RNA治疗后,与Scramble-sh RNA、Control组相比,IDO1-sh RNA治疗组的肿瘤生长速度显着减慢、肿瘤显着减小、肿瘤的重量显着减轻;体内IDO1-sh RNA沉默IDO1的表达抑制了CD4+、CD8+T细胞PD-1、BTLA的表达;体内IDO1-sh RNA治疗肺癌荷瘤小鼠,其细胞因子TNF-α和IL-2的分泌增加,且能恢复到正常小鼠（非肿瘤）的TNF-α和IL-2的分泌量。结论:尾静脉注射IDO1-sh RNA可抑制肺癌荷瘤小鼠的肿瘤的生长,其机制可能是通过抑制T细胞耗竭途径。
胡玥[4]（2021）在《蛋氨酸脑啡肽（Methionine Enkephalin）对人鼻咽癌细胞生物学行为的抑制作用及其作用机制的研究》文中提出实验目的通过观察蛋氨酸脑啡肽（Methionine Enkephalin,MENK）对体外人鼻咽癌CNE2细胞增殖、迁移侵袭的抑制作用以及对体内荷CNE2瘤裸鼠的肿瘤形成时间、大小、生存率的影响,分析其结果,进而对可能的机制进行rescue验证,探讨MENK对人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的抑制作用及其可能的作用机制,继而为鼻咽癌的治疗提供新的思路。实验方法一、MENK在体内及体外抑制人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的实验研究1、MENK体外抑制人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的实验研究体外培养人鼻咽癌CNE2细胞,分为阴性对照组（Ctrl组）和MENK组,通过MTT法检测MENK对CNE2细胞增殖的抑制程度,计算MENK对CNE2细胞的生长抑制率;利用显微镜记录MENK对CNE2细胞形态的影响;通过流式细胞分析技术检测两组间CNE2细胞的细胞周期和凋亡率有无差异;通过qRT-PCR检测CNE2细胞阿片受体的表达情况以及MENK对其表达有无影响;增加阿片受体NTX拮抗组,通过细胞划痕和Transwell小室侵袭实验检测三组间CNE2细胞迁移、侵袭转移能力的差异情况;2、MENK体内对荷CNE2瘤裸鼠抗肿瘤作用的实验研究采用BABL/C Nude裸鼠30只,皮下注射CNE2细胞悬液制作荷CNE2瘤裸鼠模型。分设3组,即Ctrl组、MENK组及NTX组,其中Ctrl组给予注射生理盐水、MENK 组给予 50mg/kgMENK,NTX 组给予 NTX10mg/kg 0.5h 后再给 50mg/kg MENK,每日观察裸鼠状态及皮下CNE2瘤的生长情况,定期记录肿瘤体积变化,于第42天处死裸鼠,取瘤,称重、测量瘤体大小,对比三组间有无差异及其意义;通过HE染色及免疫组织化学染色方法查看肿瘤组织病理形态的差异,从而分析MENK对CNE2瘤生长的抑制作用及其可能途径。二、蛋氨酸脑啡肽（MENK）抑制人鼻咽癌CNE2细胞迁移侵袭机理的实验研究通过WesternBlot检测MENK作用前后CNE2细胞中侵袭迁移相关蛋白的表达变化情况,推测MENK可能的作用途径;然后通过OGFr-siRNA瞬时下调OGFr的表达以及TGF-β/smad通路拮抗剂SB431542的应用干预CNE2细胞,再观察MENK对人鼻咽癌CNE2细胞侵袭抑制作用的改变情况;并通过免疫荧光分析β-catenin的降低在MENK对人鼻咽癌CNE2细胞侵袭抑制作用中的意义,进而深入探讨MENK抑制人鼻咽癌CNE2细胞侵袭迁移的可能机制。实验结果一、MENK可以抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长和侵袭迁移1.MENK在体外抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长和侵袭迁移（1）MTT实验结果表明MENK能抑制人鼻咽癌CNE2细胞的增殖,最佳作用时间为72h,IC50为4mg/ml。MENK可以明显改变CNE2细胞的形态,倒置显微镜下见CNE2细胞为扁平梭形细胞,相互衔接排列紧密,经MENK作用后,细胞排列松散,体积变大,核膜出现较多空泡,漂浮细胞增多。（2）流式细胞术分析结果提示MENK通过阻断CNE2细胞的细胞分裂,使CNE2细胞大部分阻滞在G2/M期。经6mg/mlMENK作用48h后,处于G2/M期的CNE2细胞约占29.7%,而对照组为20.8%（p<0.05）;与阴性对照组相比（6.43%）,MENK组细胞凋亡率为17.1%,二者差异显着（p<0.01）,提示MENK有效抑制了CNE2细胞的分裂、促进了CNE2细胞的凋亡;（3）qRT-PCR检测到人鼻咽癌CNE2细胞有阿片受体MOR（μ）、DOR（δ）、KOR（k）及ZETA（ξ）的表达。经6mg/ml的MENK作用后,阿片受体表达情况较阴性对照ctrl组明显增多,并且差异有统计学意义（p<0.05）;（4）划痕实验结果显示:MENK能明显抑制CNE2细胞的迁移能力。与阴性对照组的62.13%相比,MENK组伤口愈合率仅达17.57%,差异有统计学意义（p<0.01）;而与MENK组相比,NTX组的伤口愈合率明显增高,差异有统计学意义（p<0.01）,说明MENK可能通过作用在阿片受体发挥其抑制CNE2细胞迁移的作用。Transwell侵袭实验结果显示:与阴性对照组Ctrl相比,MENK组穿透成功的细胞数量明显降低,差异有统计学意义（p<0.01）,说明MENK有效抑制了CNE2细胞的侵袭能力;而与MENK组相比,NTX组的成功穿透细胞数明显增多,差异有统计学意义（p<0.01）,说明MENK可能通过作用在阿片受体发挥其抑制CNE2细胞侵袭转移的作用。2.MENK在体内可以抑制裸鼠CNE2瘤的生长（1）成功制作荷CNE2瘤裸鼠模型;（2）MENK组CNE2瘤的生长与Ctrl组相比,生长缓慢,42天处死后,MENK组CNE2瘤的体积和重量明显低于Ctrl组,差异有统计学意义（p<0.05）,说明MENK可以抑制体内CNE2瘤的生长;与MENK组相比,NTX组CNE2瘤的重量明显增高,差异有统计学意义（p<0.05）,提示MENK可能通过阿片受体抑制CNE2瘤的生长。（3）瘤组织切片HE染色结果显示,与Ctrl组相比,MENK组瘤细胞的密度降低,胞浆淡染,细胞核气球样变性,核仁明显,核固缩细胞较多,瘤细胞间血管减少,可见裸核的凋亡细胞;与MENK组相比,NTX可以部分抑制瘤组织的病理改变。（4）瘤组织切片免疫组化实验提示与Ctrl组相比,MENK组中OGFr表达增高,胞浆和胞核均有增高,以胞核明显;与MENK组相比,NTX组OGFr表达有所减少,但较Ctrl组相比仍有上调,提示NTX可以部分抑制MENK的上调作用。二、MENK通过多种途径来抑制CNE2细胞的侵袭迁移1.Westernblot筛查提示,与Ctrl组相比,MENK可以上调CNE2细胞中OGFr和E-ca蛋白的表达,下调Slug、Snail、p-smad3、β-catenin和TGF-β 1蛋白的表达,对Vimentin和N-ca蛋白的表达无明显影响,从而推断MENK可能通过调控TGF-β/SMAD通路来抑制CNE2细胞的侵袭迁移能力。2.OGFr-siRNA可以成功瞬时干扰CNE2细胞中OGFr的表达。MENK作用于被OGFr-siRNA干扰的CNE2细胞时其侵袭迁移能力无明显下降（p<0.05）,表明OGFr是MENK发挥作用的关键所在。3.Transwell小室侵袭实验结果提示:与MENK组相比,SB组成功穿透的CNE2细胞数明显增多,差异有统计学意义（p<0.01）,提示拮抗TGF-β/SMAD通路后MENK对CNE2细胞的侵袭抑制作用降低;Westernblot实验结果提示:与MENK组相比,SB组中p-smad3、Slug及Snail等促侵袭的标志蛋白表达有所增多,结合二者结果分析,表明SB431542可以拮抗MENK对CNE2细胞侵袭的抑制作用,提示MENK能通过TGF-β/SMAD通路来抑制CNE2细胞的侵袭能力。4.免疫荧光结果提示OGFr在CNE2细胞的胞浆和核内均有表达,MENK可以上调OGFr的表达,以胞核增多为主;MENK可以下调β-catenin的表达,并且β-catenin表达的降低主要体现在胞核内表达量的减少。结论1.MENK可以直接抑制CNE2细胞的增殖、迁移和侵袭,有效杀伤CNE2细胞。2.MENK可以通过调节OGFr介导TGF-β/SMAD通路而发挥对人鼻咽癌CNE2细胞侵袭抑制的作用。3.MENK可以上调阿片受体OGFr的表达,降低蛋白β-catenin在胞核的表达,有效抑制CNE2细胞的侵袭。
刘浩[5]（2021）在《缺血损伤相关的新生表位在器官移植术后体液性排斥中的作用及机制研究》文中认为新型免疫抑制剂的发明应用使器官移植术后的排斥反应发生率逐渐下降。临床上广泛使用的免疫抑制剂主要机制为T细胞抑制,这是因为既往认为细胞性排斥反应是移植术后发生排斥的直接原因,然而不断有临床数据发现即使采取了足量的T细胞免疫抑制治疗,仍然有排斥反应发生。直到后来研究发现是供体特异性抗体介导了排斥反应的发生,并对移植物失功甚至移植失败产生重要影响,进而影响着受体术后生存质量和存活率。抗体介导的排斥反应主要是由B细胞为主、T细胞辅助的体液免疫反应介导参与的。导致体液性排斥反应发生的抗体有很多,主要是抗供者HLA的抗体或ABO血型系统抗原的抗体。但越来越多的研究发现“非HLA抗体”也在损害移植器官中发挥了重要作用,“非HLA抗体”在移植中一般指的是自身反应性抗体和同种异体反应性抗体,种类繁多,其特异性针对HLA以外的靶点。炎症环境、抗原表达的增加以及通过翻译后修饰形成的新抗原都有助于非HLA抗体的形成,随后对移植物造成损伤。缺血再灌注损伤是影响器官移植术后受体发病率和死亡率的重要原因,因为缺血再灌注损伤与围手术期并发症息息相关,包括再灌注后综合征、移植延迟、原发性无功能以及急、慢性排斥反应。研究发现,细胞在缺血再灌注损伤的过程中会产生新抗原表位,然后引起机体产生获得性免疫分泌抗体与之结合进而加重再灌注损伤。这些缺血损伤相关的新生表位所带来的危害可能并不局限于缺血再灌注损伤本身,可能也会诱发或加重器官移植后机体的体液性排斥反应。一、缺血损伤导致新生表位的产生我们通过建立小鼠单次和二次肾脏缺血再灌注损伤模型来进行此部分研究（单次缺血:左肾行假手术,100天后行右肾缺血手术;二次缺血:左肾先行缺血手术,100天后再行右肾缺血手术）。病理及生化结果发现经历二次缺血的右肾组织和功能比单次缺血的右肾损害严重（p<0.05）,且首次左肾缺血时间越长,右肾损害越明显,表明首次左肾缺血对后期缺血的右肾产生了影响。ELISA结果提示血清中新生抗原表位ANAX4的抗体滴度在二次缺血损伤后较单次缺血小鼠显着升高（p<0.01）,提示ANAX4抗体可能与肾损害相关。流式细胞技术检测发现二次缺血损伤后小鼠脾脏中Tfh细胞、生发中心B细胞、记忆性B细胞比例增高,说明二次缺血损伤诱导了体液免疫的发生。免疫荧光结果显示ANAX4的新生抗原表位在各组中的表达情况无明显差异（p>0.05）,而血清中ANAX4抗体在二次缺血损伤后却增高,可能与记忆性B细胞激活分化为可分泌抗体的浆细胞有关。我们进一步在左肾缺血期间加用了T细胞免疫抑制剂FK506,结果显示FK506不仅可以减少二次缺血损伤后Tfh细胞在脾脏中的比例,也减少了生发中心B细胞、记忆性B细胞在脾脏中的比例,同时减少了血清中ANAX4抗体水平,右肾功能和病理损伤情况也得到好转,再次证明新生表位激活了体液免疫分泌抗体参与对机体的损害。此外,免疫荧光结果证实C4d和Ig G在肾缺血损伤时候会浸润肾组织,说明补体系统也参与了肾缺血损伤引起的体液免疫反应。二、缺血损伤相关的新生表位在器官移植中的作用及机制此部分我们建立了小鼠肾缺血100天后行异种小鼠肾移植的动物模型,在肾缺血时候或肾移植术时加用FK506,观察其对移植效果的影响。具体分组如下:sham,肾移植+FK506,肾缺血+肾移植,肾缺血+肾移植+FK506,肾缺血+FK506+肾移植+FK506。结果发现在肾缺血+移植组中的肾组织损害最严重,血清中ANAX4抗体水平也最高。而肾移植+FK506组与肾缺血+肾移植+FK506组比较,病理损害则较轻,ANAX4抗体水平也较低,这提示前期肾缺血对后期的移植肾组织产生不利影响,且可能与新生表位产生有关。而在移植肾的免疫荧光中,ANAX4抗原表位在各组间无明显差异,表明ANAX4抗体水平的变化与移植术后体液免疫反应有关。此外C4d和Ig G在肾缺血+肾移植+FK506组中沉积比在肾移植+FK506组中多（p<0.05）,也说明早期肾缺血更易导致补体对移植肾的损害。我们进一步检测了脾脏和移植肾引流淋巴结中的Tfh细胞、生发中心B细胞、记忆性B细胞的比例,结果显示肾缺血+肾移植+FK506小鼠的三种细胞比例较肾移植+FK506组更高（p<0.05）,这些结果再次表明早期肾缺血损伤更易导致移植术后体液免疫发生,从而对移植肾造成损害。而在肾缺血+FK506+肾移植+FK506组中,由于缺血期间应用了FK506,其病理损害、C4d和Ig G沉积较肾缺血+肾移植+FK506都有所下降,三种免疫细胞比例也降低（p<0.05）,提示早期应用FK506可以适当减轻损伤和免疫反应。移植术后体液免疫的活跃可能预示抗体介导的排斥反应的发生,于是我们进一步对供体特异性抗体进行了检测,如预期所料,前期肾缺血会导致肾移植术后DSA-Ig G升高,说明了抗体介导的排斥反应的发生,从而对移植肾造成排斥。三、新生表位诱导的移植术后体液性排斥反应的防治探讨第二部分证实早期肾血损伤相关新生表位会诱发移植术后的体液性排斥反应,此部分,针对免疫反应不同环节,我们将眼镜蛇毒因子、CTLA4-Ig和（或）FTY720用于移植术后体液排斥反应的治疗。结果发现眼镜蛇毒因子可以减轻移植肾病理损害,改善肾功能,同时降低血清中ANAX4抗体和DSA-Ig G水平,尤其在抑制补体沉积上作用明显,但其对新生表位生成和免疫细胞的比例变化上无作用。而CTLA4-Ig除了改善移植肾功能和损害等效果外,还能通过抑制Tfh细胞、生发中心B细胞、记忆性B细胞的活化、增值进而抑制体液性排斥反应。当与FTY720合用后这些效果进一步增强。以上结果说明CTLA4-Ig和FTY720联用是预防和治疗缺血损伤相关表位诱导的移植术后体液性排斥反应的有效方法。四、褪黑素对肾缺血再灌注损伤的作用及机制研究减轻缺血再灌注损伤也一直是研究热点。因为褪黑素具有调节节律、抗炎、抗氧化等作用,因此我们将褪黑素用于肾脏缺血再灌注损伤的研究。实验证明褪黑素预处理对肾脏有保护作用,褪黑素预处理后的小鼠即使经历缺血再灌注,组织损伤也较少,血清肌酐和尿素氮水平没有明显升高。褪黑激素的保护作用进一步通过降低氧化应激得到证实,表现为脂质过氧化降低,抗氧化能力增强。随后研究证明褪黑素预处理显着限制了肾缺血损伤时引起的促炎细胞因子产生和中性粒细胞、巨噬细胞的浸润。透射电镜和Western blot等结果提示褪黑素在缺血再灌注过程中可以诱导肾脏自噬产生,TUNEL结果证实褪黑素预处理可以减少细胞凋亡。进一步研究发现褪黑素可通过下调TLR4/My D88激发自噬发挥保护作用,此外,MEK/ERK/m TORC1通路的下调对于褪黑素介导的自噬也是必需的。综上所述,我们通过小鼠二次肾缺血损伤模型验证了新生抗原表位的产生以及对体液免疫的影响。然后通过肾缺血+肾移植模型明确了缺血损伤相关的新生表位可以诱导移植术后的体液性排斥反应并对移植物造成损害,进一步实验表明缺血早期或移植术后通过干预抑制免疫反应可减轻移植物损害和排斥反应。最后我们证实褪黑素可以在肾缺血损伤中通过诱导自噬发挥保护性作用。
黄镇辉[6]（2020）在《肝癌浸润淋巴细胞（TILs）的提取以及特性研究》文中研究指明研究背景与目的:原发性肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是高度恶性的肿瘤,每年我国因肝癌死亡的人数超过12万,占全世界肝癌死亡人数的44%左右,病死率高居各类肿瘤的第三位[1]。尽管有肝切除、肝移植、化疗栓塞和新酪氨酸酶抑制剂（如索拉菲尼）等方法可用于肝癌的治疗,但肝癌患者仍呈现频繁复发,甚至在肝移植之后[2]。而免疫治疗特别是细胞免疫治疗可以调节机体免疫功能,改变肿瘤微环境（TME）,诱导特异性肿瘤免疫,达到治疗肝癌、减少肝癌复发和转移的目的,已经成为继手术、化疗、放疗后的第四种治疗方式[3]。基于肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes,TILs）的过继免疫治疗也越来越受到国内外学者的关注。TILs是从肿瘤组织中分离出来的肿瘤抗原特异性淋巴细胞群,含有T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞,主要以T淋巴细胞为主,而T淋巴细胞根据细胞表型可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞,其中能发挥杀伤肿瘤作用为CD8+T细胞,其疗效是淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated killer,LAK）的50-100倍[4-6]。人源肿瘤组织异种移植模型（patient-derived xenograft models,PDX）是指将病人的新鲜肿瘤组织或肿瘤细胞通过原位或异位等方式移植到免疫缺陷小鼠体内,依靠小鼠提供的环境生长的一种异种移植模型[7,8]。这种模型保留了原代肿瘤的微环境和组织病理学及遗传学特征,能模拟人肿瘤异质性,对肿瘤临床前评估、治疗和预后具有重要的转化意义,被认为是目前为止最接近临床研究的相关肿瘤模型,是肿瘤学临床研究非常宝贵的标本[9]。研究表明,CD8+TILs的数量与肿瘤的客观缓解率呈正相关[5 6,10]。目前,国内研究TILs,尤其是CD8+TILs用于肝癌的治疗相对较少,本研究中我们将探讨CD8+TILs在肝癌组织的分布以及高效提取分离、培养扩增CD8+TILs的方法,同时进一步验证CD8+TILs的免疫学特性,为将来应用自体CD8+TILs免疫治疗晚期HCC奠定基础。研究方法:1.肝癌组织标本的苏木素-伊红染色（HE）与免疫组织化学染色（IHC）:取癌巢、癌旁组织制成切片,分别行HE染色和细胞表面CD8抗原IHC,研究CD8+TILs在肝癌癌巢和癌旁组织分布;2.肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的提取与鉴定:摸索对比组织块培养法、细针抽吸、混合酶消化法提取TILs,使用吖啶橙（AO）染色判断细胞活性,采用流式细胞学检测TILs表面标志物CD3、CD4、CD8抗原表达以及研究CD4+TILs、CD8+TILs细胞比例;3.体外扩增TILs并分选CD8+TILs:对体外扩增后的TILs使用免疫磁珠法分选其中的CD8+TILs;4.CD8+TILs细胞毒性实验:CD8+TILs与分选后的非CD8+TILs做对比,按效靶比（E/T）为1、5、10分别与肝癌细胞株（Hep G2、Hep3B）共培养,采用CCK8法检测CD8+TILs的肿瘤抑制率以及初步摸索最适效靶比。5.三维立体培养的前期探索:使用携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒转染293T细胞,海藻酸钠包裹转染成功的293T细胞形成微囊,建立三维立体结构培养,通过荧光显微镜下观察微囊内293T细胞的生长情况,进而使用同一病毒感染TILs。6.肝癌PDX模型建立:通过皮下移植肿瘤组织块和皮下接种肝癌肿瘤细胞悬液两种方法造模。肿瘤组织块成瘤法是直接皮下包埋组织块;肿瘤细胞悬液成瘤法是通过混合酶消化法将肝癌患者手术后标本制成肿瘤细胞悬液,接种至裸鼠两侧近腋窝、两侧腹股沟皮下,观察皮下成瘤情况。实验结果:1.肝癌组织标本的苏木素-伊红染色（HE）与免疫组织化学染色（IHC）:相对于癌巢组织,CD8+TILs主要分布在癌旁组织,而且主要富集在癌旁组织的汇管区。2.肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的提取与鉴定:采用混合酶消化法提取效果较好,AO染色（Day14）示,细胞活力为（90.5±3.0）%。流式检测CD3+细胞比例为（77.53±16.37）%,CD3+CD4+比例为（27.08±21.56）%,CD3+CD8+比例（44.55±12.73）%。流式检测有CD3细胞表位抗原表达,且高比例,表明提取的细胞大部分都是TILs,且CD8+TILs居多。3.体外扩增TILs并分选CD8+TILs:扩增后细胞数为（1.22.5）×10 8,扩增倍数17-50倍。使用免疫磁珠分选出的CD8+TILs数量与流式检测结果基本一致。4.CD8+TILs细胞毒性实验:在非CD8+TILs中,效靶比（E/T）在1、5和10时,抑制率分别为（0.53±2.21）%、（0.30±1.67）%、（75.00±4.90）%（Hep G2）和（1.29±2.83）%、（1.94±2.04）%、（43.54±1.98）%（Hep3B）,而在CD8+TILs中,效靶比在1、5和10时,抑制率分别为（1.60±0.23）%、（85.16±3.66）%、（77.74±5.81）%（Hep G2）和（3.35±2.59）%、（81.34±2.32）%、（91.03±2.41）%（Hep3B）,SPSS软件采用Bonferroni法分析,在E/T=5或10与E/T=1比较,差异均有统计学意义（P<0.05）,而E/T=5与E/T=10比较,差异无统计学意义（P>0.05）,结果提示,当E/T=5时,CD8+TILs就能较好发挥肿瘤抑制作用。5.三维立体培养的前期探索:转染的293T细胞在海藻酸钠微囊内可以存活,且培养72小时的细胞数量最多,同时使用慢病毒同样可以转染TILs。6.肝癌PDX模型建立:皮下接种肝癌组织块未成功,但皮下接种肿瘤细胞悬液,约3个月后,有皮下成瘤迹象。结论:本研究证实了CD8+TILs主要富集在癌旁组织汇管区,对比组织块培养、细针穿刺法,混合酶消化法更能高效从人肝癌组织提取出CD8+TILs,改良的扩增方案并实现大量扩增,体外实验进一步表明提取的CD8+TILs具有较强肿瘤抑制作用。初步尝试建立裸鼠肝癌PDX模型,同时,前期实验初步验证了,使用海藻酸钠包裹细胞实现三维立体培养和扩增具有可行性。
杜家乐[7]（2020）在《非小细胞肺癌患者组织中PD-L1、CD8+T细胞与p53蛋白表达与治疗疗效的关系》文中认为目的:探索非小细胞肺癌患者肿瘤组织中PD-L1、CD8+T细胞、p53蛋白表达是否具有统计学相关性,及PD-L1、CD8+T细胞、p53蛋白分别与疗效的关系,探讨p53是否可作为免疫治疗的新的生物监测点。方法:收集我院肿瘤内科2018.02-2020.03收治的非小细胞肺癌患者共计45例,通过免疫组化的方法测定肿瘤组织中PD-L1、CD8+T细胞、p53蛋白表达情况,采用spss22.0统计软件,计数资料采用构成比或率表示,组间比较采用Fisher确切概率法,采用Kplan-Meier计算患者的生存率,用Log-rank法进行组间比较,采用COX回归分析各特征对患者疾病无进展生存时间的影响。结果:1.收集到的45例样本中,PD-L1阳性表达率为37.8%,p53阳性表达率为24.4%,CD8+T细胞阳性表达率为57.8%,PD-L1、p53、CD8+T细胞不同指标比较,结果显示与性别、年龄、吸烟史、Ki-67表达情况无统计学相关性。2.p53与PD-L1、CD8+T细胞表达无统计学相关性（前者P=0.639,后者P=0.548）。PD-L1与CD8+T细胞表达无统计学相关性（P=0.463）。3.PD-L1表达阳性组中位PFS为9.7个月,表达阴性组中位PFS为5.3个月。PD-L1组间PFS差异具有统计学意义（X2=8.638,P=0.003）,PD-L1阳性组无进展生存期较长。4.p53表达阳性组中位PFS为5.8个月,表达阴性组中位PFS为6.2个月。p53表达组间PFS差异无统计学意义,两组无进展生存期无差别（X2=0.086,P=0.769）。5.CD8+T细胞阳性组中位PFS为6.2个月,表达阴性组中位PFS为5.8个月。CD8+T细胞表达组间PFS差异无统计学意义,两组无进展生存期无差别（X2=0.227,P=0.634）。6.Ki-67表达≤40%中位PFS为7.3个月,Ki-67表达>40%组中位PFS为4.7个月,Ki-67表达≤40%组PFS较>40%组PFS具有统计学意义,说明表达≤40%组无进展生存期较长。（X2=14.693,P<0.001）。7.采用多因素COX回归分析,结果显示PD-L1、Ki-67均为疾病无进展生存期的独立影响因素,其中Ki-67为独立为危险因素,PD-L1为独立保护因素。结论:1.PD-L1、p53、CD8+T细胞表达之间无显着相关性;2.PD-L1阳性、Ki-67表达≤40%的患者拥有更长的PFS,p53、CD8+T细胞表达对PFS无明显影响;3.PD-L1、Ki-67是独立危险因素。
李振华[8]（2020）在《5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究》文中研究说明肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居癌症死亡的首位,据世界卫生组织统计,每年约有176万人死于肺癌。由于绝大多数的肺癌患者在临床确诊时多属进展期或难以治愈的Ⅲb期或Ⅳ期,因此失去了手术根治的机会。而近些年来,随着免疫治疗在临床上的逐渐应用,其显示出了一定的优势,并对部分肺癌患者的预后产生了改善,因此被推荐为晚期肺癌标准治疗方案之一。其中肿瘤特异性T细胞是目前具有良好发展前景的免疫细胞,因此发掘能被T淋巴细胞识别的靶抗原是治疗的关键。癌睾丸抗原（cancer testis antigen,CTA）家族是目前已知的肺癌组织中重要的肿瘤相关抗原。癌睾丸抗原家族的表达模式具有相当程度的特异性:该蛋白家族内的成员在多种癌症中均有表达,如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤,对于正常组织而言,癌睾丸抗原仅在睾丸细胞中表达,偶尔也可以在胎盘组织中被检测到,且睾丸拥有免疫豁免能力,不会被免疫系统识别并杀伤。因此,癌睾丸抗原家族是肿瘤免疫治疗的理想标靶。黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene,MAGE）属于CTA亚家族,是一种肿瘤相关性抗原,其具有免疫原性及表达限制性。据研究显示,人类的MAGE家族基因位于X染色体上,其编码的肿瘤排斥抗原（tumor rejection antigen;TRA）,经过细胞内的加工从而产生抗原肽,并与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）结合形成复合物,被自体细胞毒性T淋巴细胞特异性识别,能诱导对肿瘤细胞具有特异性杀伤能力的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）。MAGE家族的表达模式和CTA家族相同,在多种肿瘤细胞中均有表达,如乳腺癌、黑色素瘤、食管癌、结直肠癌,且在大多数正常组织中不表达。本研究认为,MAGE家族有极大的潜力作为CTL介导肿瘤特异性免疫治疗的预备标靶。对于MAGE家族的深入研究和理解有助于肺癌的分子生物学诊断和个体化分子靶向治疗。树突状细胞（dendritie cells,DC）是非单核吞噬细胞中的一种,是人体内已知的功能最强的抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells,APC）,抗肿瘤免疫的产生依赖于DC细胞对肿瘤抗原的捕获与加工处理,随后将抗原信息呈递给淋巴组织内的未成熟T细胞并激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应。具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）具有杀伤能力强、增殖活性强等特点。本研究拟通过MAGE-A10抗原肽与DC细胞共同培养并诱导肿瘤特异性CTL细胞,以有效杀伤癌细胞株。有学者使用与MAGE家族基因序列相似的共同表位肽进行了类似研究,证明了这个短肽对于肿瘤细胞的诱导杀伤能力。抗肿瘤免疫治疗不仅受限于肿瘤细胞表面免疫原性强弱还受到肿瘤特异性抗原的表达量和表达率的限制。靶抗原在肿瘤细胞表面表达是以肽为基础免疫治疗的核心,提升靶抗原的表达量在一定程度上可改善肿瘤免疫治疗的效果。5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine or DAC）是一种特异性的甲基化抑制剂,可以降低甲基化水平,应用该药物可以使MAGE-A10表达量升高。因此,本研究采用DAC处理肺癌细胞株,以期望能诱导MAGE-A10的表达升高。目前在肺癌中,高表达的MAGE-A10与患者临床病理学参数及患者生存之间的关系尚无定论。且将MAGE-A10抗原肽及去甲基药物DAC免疫疗法用于肺癌的免疫治疗的研究尚未见报道。因此,本课题设计MAGE-A10抗原肽联合去甲基药物DAC肺癌的体外杀伤作用进行研究。通过免疫组织化学法检测肺癌组织中MAGE-A10在蛋白水平的表达情况,探讨MAGE-A10的表达与患者临床病理特征的关系,通过Kaplan-Meier Plotter在线公共数据库进行生存分析,验证MAGE-A10对肺癌患者预后的影响,在不同的肺癌原代细胞及细胞系中验证去甲基药物DAC是否可以诱导肺癌细胞表面MAGE-A10表达的增加,在去甲基化药物处理过的肺癌细胞系中验证MAGE-A10特异性CTL对去甲基化药物诱导的肺癌细胞的杀伤效果。第一部分MAGE-A10抗原在人肺癌组织的表达及临床意义目的:采用免疫组织化学法,研究MAGE-A10抗原在肺癌患者组织中的表达及其与临床病理参数的相关性,为MAGE-A10抗原肽参与肿瘤免疫治疗建立理论基础。方法:1.免疫组织化学法检测MAGE-A10抗原在正常肺组织中和肺癌组织中的表达。2.分析MAGE-A10抗原表达与患者临床病理参数的相关性。3.采用Kaplan-Meier生存分析法,分析肺癌患者MAGE-A10抗原阳性表达与患者5年总生存率情况。结果:1.免疫组织化学检测结果显示,MAGE-A10蛋白在正常肺组织中阳性表达率低,阳性表达4例,阴性表达26例,阳性表达率为13.3%,在肺癌组织中阳性表达率高,阳性表达198例,阴性表达218例,阳性表达率为47.6%,在肺癌细胞质和细胞核均有表达。2.统计结果显示,MAGE-A10蛋白的表达与肺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤临床分期、没有相关性,（P>0.05）,与淋巴结转移（6.81,0.0090）、复发转移（4.64,0.0313）具有相关性（P<0.05）。3.MAGE-A10分子阳性表达的肺癌患者较阴性表达患者5年总生存率更低。Log Rank检验结果P=5.002e-10。结论:MAGE-A10抗原在肺癌组织呈阳性表达,正常肺组织少有表达,提示MAGE-A10抗原可以作为肺癌免疫治疗的靶抗原。MAGE-A10可能与肺癌患者的不良预后相关。第二部分MAGE-A10抗原在人肺癌细胞系和原代细胞的表达及MAGE-A10的生物信息学分析目的:研究MAGE-A10在人肺癌细胞系及原代细胞中的表达状况;使用生物信息学方法分析MAGE-A10表达与患者生存的关系。方法:1.通过q RT-PCR和Western blot技术检测人类肺癌细胞系A549和H1975及原代细胞L228、L419及L329细胞中MAGE-A10的表达。2.从Kaplan-Meier Plotter在线公共数据库（http://www.kmplot.com）获得1926例OS样本,344例FP样本,982例PPS样本,并进行生存分析。结果:1.在肺癌细胞系中,A549细胞中的MAGE-A10 m RNA呈低水平表达,而在H1975细胞中呈高水平表达;在肺癌原代细胞中,L329细胞中的MAGE-A10 m RNA呈低水平表达,而在L228及L419细胞中呈高水平表达。2.基于开放的公共数据库Kaplan-Meier Plotter的分析结果显示,高表达MAGE-A10的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者（P<0.05）。结论:1.H1975、L228及L419细胞中MAGE-A10 m RNA呈高水平表达,A549细胞及L329细胞呈低表达水平。2.MAGE-A10高表达的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者。第三部分去甲基化药物对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响的研究目的:研究去甲基化药物DAC对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响。方法:1.通过q RT-PCR和Western blot技术检测去甲基化药物DAC处理后肺癌细胞H1975、L228、L419、A549及L329细胞中MAGE-A10 m RNA和蛋白的表达。2.ELISA法检测MAGE-A10共同抗原特异性CTL与肺癌组织原代细胞混合培养上清中IFN-γ分泌水平。3.细胞毒性实验检测MAGE-A10特异性CTL对肺癌组织原代细胞杀伤效应的影响。结果:1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加,且MAGE-A10蛋白表达量和m RNA量呈剂量依赖性。2.IFN-γ释放实验结果显示同时加入MAGE-A10抗原肽与DAC组IFN-γ分泌水平有显着升高,且效靶比越高,IFN-γ分泌水平越高（P<0.05）。3.细胞毒性实验结果显示,在同一效靶比下MAGE-A10抗原肽+DAC组杀伤效率最高。效靶比为40:1时杀伤效率最高。结论:1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加。2.去甲基化药物DAC能够增强MAGE-A10共同抗原肽特异性CTL对H1975细胞、L228细胞及L419细胞的杀伤功能。
王硕[9]（2019）在《免疫疗法联合125I放射粒子治疗非小细胞肺癌的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景及目的:针对目前非小细胞肺癌治疗方法单一且预后差的现状,125I放射性粒子近距离放疗和PD-1/PD-L1抑制剂抗肿瘤机理不同,目前关于二者联合应用治疗NSCLC还未见报道,是否能给肺癌患者带来临床收益还没有经验,基于以上分析提出近距离放疗联合PD-1抗体治疗非小细胞肺癌假说,通过体内及体外实验观察125I放射性粒子联合PD-1抗体的疗效,评估二者联合用于治疗人非小细胞肺癌的可行性,期待通过该项研究来评估进而应用于非小细胞肺癌患者的可行性及可能机理。内容:本课题首先进行体外实验,证实联合应用抗PD-1抗体Nivolumab和近距离放疗后,是否能够更有效的抑制肿瘤细胞的生长和促进其凋亡,再进行体内实验,建立肺癌的小鼠模型,联合应用抗PD-1抗体Nivolumab和近距离放疗,验证是否可以增加疗效,使抑瘤率得到提高,检测小鼠体内的免疫情况。应用转录组分子实验探索125I近距离放疗联合Nivolmab治疗NSCLC可能机制,通过比较组织中转录组差异,挖掘在联合治疗下发挥重要作用的基因和信号通路,为二者联合应用是否能带来临床获益提供理论依据。方法:1.125I联合免疫调节人肺癌细胞生物学行为的研究首先检测三种肺癌细胞株PD-L1的蛋白水平,本实验利用三种肺癌细胞株,分别为H1299,SPC-A1和A549细胞株进行实验,Nivolumab主要针对PD-L1增高的情况有效,所以利用western-bloting筛选其PD-L1蛋白水平相对表达最高的细胞系作为实验所用肺癌细胞株。筛选出PD-L1相对高表达细胞株后继续实验,实验分为对照组、125I组、Nivolumab组、125I联合Nivolumab组,对选定肺癌细胞系分别给予Nivolumab（工作浓度100nM）及125I粒子持续低剂量率照射（细胞培养平面初始剂量率为2.59cGy/h,对于指数生长期细胞予以10Gy照射）,采用MTT法比较各组间肿瘤细胞生长抑制率,随后进行细胞凋亡实验和Transwell侵袭实验等生物学行为研究。2.联合疗法在小鼠移植瘤模型中的疗效研究建立小鼠移植瘤模型,经筛选后PD-L1高表达肺癌细胞株经过荧光质粒转染后种植在小鼠前胸,观察移植瘤生长情况,荧光摄影测量移植肿瘤的大小,并且当移植肿瘤的体积在约一周后达到100mm 3或更多时,可以开始分组实验。将移植的肿瘤小鼠随机分成三组,125I组、Nivolumab组、125I联合Nivolumab组。开始药物处理以及植入125I粒子。粒子的初始活性为1mCi,无菌条件下,将放射性125I植入肿瘤中心,并将热释光剂量计置于与粒子平行位置,二者距离用游标卡尺测量固定为0.5cm,Nivolumab采用尾静脉注射给药1mg/kg。继续饲养小鼠3周,观察小鼠状态并且每周测量两次肿瘤体积变化计算抑瘤率;肿瘤组织标本取材,切片做HE染色及免疫组化等组织病理学鉴定;检测小鼠移植瘤中PD-L1蛋白以及PD-L1 mRNA表达的水平。3.通过转录组分子实验对联合治疗机制的研究取荷瘤鼠不同处理组病理标本。提取组织RNA,片段分选后上机测序,测序数据下机后质控过滤,应用RSEM软件计算各个样本中基因表达量,比较样本间表达差异。基于比对结果利用edgeR软件分析基因在各样本中的差异表达情况,对差异表达基因进行GO和KEGG通路富集分析,查找在差异实验结果之后,起重要作用的基因和信号通路。结果:1.肺癌细胞系的筛选及细胞生物学实验通过western-bloting检测三种肺癌细胞系,H1299中PD-L1蛋白表达量最高。选取H1299为实验用肺癌细胞株,对125I组、Nivolumab组、125I联合Nivolumab组肺癌细胞系分别予以药物及照射处理,结果显示,与其他两组相比,联合治疗组肿瘤抑制率更高。流式细胞实验显示,联合治疗组肿瘤细胞凋亡率明显高于单处理组。Transwell实验表明联合治疗能更有效抑制肿瘤细胞侵袭。2.荷瘤鼠体内实验通过对荷瘤鼠模型不同治疗方法的观察测量,绘制曲线并计算肿瘤抑制率,发现联合治疗组比较放射性粒子植入组和免疫治疗组对肿瘤生长抑制更加明显,效果显着。取移植瘤组织进行分析发现,PD-L1蛋白水平及mRNA表达量125I组最高,Nivolumab组次之,联合治疗组最低。3.转录组分子实验通过比较不同处理条件下的细胞系转录组差异,挖掘在不同生境下发挥重要作用的基因和信号通路。结果发现651个mRNA发生明显的上调或下调。GO分析显示来自上调的mRNA参与细胞对细胞因子刺激的反应、细胞因子反应,免疫反应,细胞因子介导的信号传导,对化学物质的反应和细胞因子活性。细胞侵袭转移相关的mRNA有所下调。随后的通路分析显示,异常的上调mRNA参与IL23介导的信号转导事件,干扰素γ信号传导,NK-kapaB信号通路,趋化因子与趋化因子的受体结合,鸟苷结合蛋白偶联受体（GPCR）配体结合,与生物代谢紊乱有关氧化酶的调节等通路。通路分析中下调的mRNA具有Ca2+通路和NK细胞介导的细胞毒性中的ras非依赖性通路等细胞分子生物学特性。结论:1.在PD-L1高表达非小细胞肺癌细胞株中,125I联合Nivolumab能够显着抑制肿瘤细胞生长,增加其凋亡并且抑制肿瘤侵袭等生物学行为。2.体外实验显示,125I联合Nivolumab能够有效抑制荷瘤鼠肿瘤生长,取移植瘤组织进行分析发现,联合治疗组PD-L1蛋白水平及mRNA表达量较单因素治疗组更低。3.转录组实验表明,联合治疗可影响mRNA异常表达。GO分析显示来自上调的mRNA参与细胞对细胞因子刺激的反应、细胞因子反应,免疫反应,细胞因子介导的信号传导,对化学物质的反应和细胞因子活性。细胞侵袭转移相关的mRNA有所下调。随后的通路分析显示,异常的上调mRNA参与IL23介导的信号转导通路,干扰素γ信号传导通路,NK-kapaB信号通路,趋化因子与趋化因子的受体结合通路,鸟苷结合蛋白偶联受体（GPCR）配体结合通路,与生物代谢紊乱有关氧化酶的调节等通路。通路分析中下调的mRNA有Ca2+通路和NK细胞介导的细胞毒性中的ras非依赖性通路。
周积云[10]（2019）在《乙型肝炎患者不同感染阶段CD8+CD28+T淋巴细胞表达及其与HBsAg的关系》文中研究说明目的:通过对乙型肝炎患者不同感染阶段外周血及肝脏组织内CD8+CD28+T淋巴细胞含量进行检测,观察CD8+CD28+T淋巴细胞在不同感染阶段的表达差异;同时讨论CD8+CD28+T淋巴细胞与外周血HBsAg的关系,并探讨其临床意义。方法:选取2018年4月2019年1月于我院诊治的乙型肝炎患者80例,其中免疫耐受期、免疫清除期、非活动期、再活动期患者各20例,另选择健康人20例。使用流式细胞术检测纳入人群外周血CD8+CD28+T淋巴细胞表达;免疫组织化学方法检测乙型肝炎患者肝脏组织内CD8+CD28+T淋巴细胞表达;以及电化学发光法定量检测乙型肝炎患者外周血HBsAg含量。收集实验数据并进行统计学分析。结果:（1）流式细胞术结果显示:健康人、免疫耐受期、免疫清除期、非活动期、再活动期外周血CD8+CD28+T淋巴细胞百分比分别为（26.2±3.5）%、（26.6±3.5）%、（40.3±5.5）%、（20.0±4.4）%和（22.3±2.0）%,各组之间差异具有统计学意义（均有P<0.05）。免疫组织化学结果示:免疫耐受期、免疫清除期、非活动期、再活动期肝脏组织CD8+CD28+T淋巴细胞表达分别为（13.1±3.5）个/HP、（31.1±5.3）个/HP、（6.2±2.4）个/HP和（8.7±1.9）个/HP,各组之间差异具有统计学意义（均有P<0.05）。（2）HBsAg低、中、高三组人群外周血CD8+CD28+T淋巴细胞百分比分别为（22.7±6.3）%、（27.0±8.1）%和（32.7±8.6）%,各组间差异有统计学意义（均有P<0.05）;肝脏组织CD8+CD28+T淋巴细胞表达分别为（9.4±7.8）个/HP、（14.3±9.8）个/HP和（21.2±10.4）个/HP,各组间差异有统计学意义（均有P<0.05）。结论:（1）乙型肝炎患者不同感染阶段外周血及肝脏组织CD8+CD28+T淋巴细胞表达均存在明显差异,可能与病毒长期刺激机体免疫系统,导致免疫系统功能失调有关。（2）HBsAg分子水平可间接反应肝脏免疫反应激活程度。
二、毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在链霉菌中的表达研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在链霉菌中的表达研究（论文提纲范文）
（1）木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究（论文提纲范文）
| 答辩委员会名单及评定意见 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 移植免疫概述 |
| 一、器官移植排斥反应概述 |
| 二、调节性T细胞在移植免疫中的作用 |
| 三、DC细胞在移植免疫中的作用 |
| 第二节 免疫抑制剂在器官移植中的作用 |
| 一、免疫抑制剂分类 |
| 二、雷帕霉素 |
| 第三节 中医药在器官移植中的研究进展 |
| 一、中医药对移植前后的病因病机认识 |
| 二、中医药对移植前后的辨证认识 |
| 三、中药对器官移植的治疗 |
| 第四节 木犀草素的研究进展 |
| 一、木犀草素药代动力学及生物利用度的研究进展 |
| 二、木犀草素药理作用的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 木犀草素对小鼠皮肤移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体皮肤移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的作用 |
| 三、木犀草素联合应用Anti-CD25抗体删除Treg对小鼠皮肤移植反应的影响 |
| 四、讨论 |
| 第二节 木犀草素对小鼠胰岛移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体胰岛移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠胰岛移植的作用 |
| 三、讨论 |
| 第三节 木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验 |
| 一、实验内容 |
| 二、讨论 |
| 第三章 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新性 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（2）兰坪虫草多糖联合顺铂增强Lewis荷瘤小鼠的抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的流行病学 |
| 1.2 肺癌的治疗方式 |
| 1.2.1 手术治疗 |
| 1.2.2 化学治疗 |
| 1.2.3 放射治疗 |
| 1.2.4 靶向治疗 |
| 1.2.5 免疫治疗 |
| 1.2.6 中医药疗法 |
| 1.3 顺铂的临床应用及其毒副作用 |
| 1.4 多糖的抗肿瘤活性研究 |
| 1.5 虫草的药用研究 |
| 1.6 本课题研究的目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 兰坪虫草多糖的制备和组分分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验菌种 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 兰坪虫草的培养以及菌粉的制备 |
| 2.2.4 兰坪虫草多糖的制备 |
| 2.2.5 分子量测定 |
| 2.2.6 傅里叶变换红外光谱法(FT-IR) |
| 2.2.7 PMP衍生-HPLC测定多糖中单糖的组成 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 高效凝胶渗透色谱分析 |
| 2.3.2 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析 |
| 2.3.3 HPLC分析兰坪虫草多糖的单糖组成 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 兰坪虫草多糖联合顺铂增强荷瘤小鼠脾脏的免疫力 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和细胞系 |
| 3.2.2 试剂和仪器 |
| 3.2.3 细胞的培养以及小鼠皮下异位移植瘤模型的构建 |
| 3.2.4 流式细胞术 |
| 3.2.5 脾脏RNA的提取及实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR) |
| 3.2.6 脾脏蛋白的提取及浓度测定 |
| 3.2.7 脾脏免疫印迹分析 |
| 3.2.8 酶联免疫吸附剂测定(ELISA) |
| 3.2.9 脾脏组织病理学检查 |
| 3.2.10 统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 兰坪虫草多糖改善小鼠的生活状态 |
| 3.3.2 兰坪虫草多糖改善脾脏的指数,形态学和病理学 |
| 3.3.3 兰坪虫草多糖抑制脾脏的炎症反应 |
| 3.3.4 兰坪虫草多糖促进脾脏T淋巴细胞和NK细胞增殖 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 兰坪虫草多糖联合顺铂增强荷瘤小鼠的抗肿瘤活性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料和细胞系 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 细胞的培养以及小鼠皮下异位移植瘤模型的构建 |
| 4.2.4 实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR) |
| 4.2.5 肿瘤免疫印迹分析 |
| 4.2.6 肿瘤病理学检查 |
| 4.2.7 免疫组化 |
| 4.2.8 免疫荧光 |
| 4.2.9 TUNEL分析 |
| 4.2.10 统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 兰坪虫草多糖抑制肿瘤的生长 |
| 4.3.2 兰坪虫草多糖抑制肿瘤组织增殖 |
| 4.3.3 兰坪虫草多糖抑制肿瘤增殖机理的初步探索 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论及展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（3）肺癌源性吲哚胺2,3-双加氧酶1在T细胞耗竭中的作用及其抗癌免疫治疗的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肺癌与免疫逃逸 |
| 1.2 吲哚胺2,3–双加氧酶 |
| 1.3 T细胞耗竭 |
| 1.4 T细胞表面抑制性受体 |
| 1.4.1 程序性细胞死亡受体1 |
| 1.4.2 B和T淋巴细胞衰减因子 |
| 1.4.3 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 |
| 1.5 免疫调节细胞因子 |
| 第二章 肺癌源性IDO1 在耗竭性T细胞中的作用的体外实验研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞株及动物来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要的试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 siRNA的转染 |
| 2.2.3 q PCR检测siRNA转染后LLC细胞IDO1 m RNA的表达 |
| 2.2.4 Western-blot检测siRNA转染后LLC细胞IDO1 蛋白的表达 |
| 2.2.5 不同处理的LLC细胞与T细胞共培养 |
| 2.2.6 肺癌细胞中IDO1 沉默对T细胞的增殖与凋亡情况:CFSE法检测增殖,Annexin-V/PI检测凋亡 |
| 2.2.7 流式细胞术检测耗竭性T细胞的抑制性受体:PD1、BTLA |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 体外IDO1-siRNA降低LLC细胞中的IDO1 的表达 |
| 2.3.2 LLC细胞中IDO1 降低对T细胞增殖能力和凋亡能力的影响 |
| 2.3.3 LLC细胞中的IDO1 基因沉默对CD8~+T细胞的抑制性受体PD-1和BTLA的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 肺癌中IDO1 低表达抑制T细胞耗竭及肿瘤生长的体内实验研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞及动物来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要的试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 建立荷瘤小鼠模型 |
| 3.2.2 质粒提取 |
| 3.2.3 治疗荷瘤小鼠 |
| 3.2.4 肿瘤生长监测 |
| 3.2.5 制作石蜡病理切片 |
| 3.2.6 免疫组织化学染色 |
| 3.2.7 免疫组织化学染色结果评估 |
| 3.2.8 各治疗组耗竭性T细胞的抑制性受体:PD1、BTLA的表达 |
| 3.2.9 ELISA法检测细胞因子:TNF-α、IL-2 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IDO1-sh RNA对肺癌荷瘤小鼠的治疗效果 |
| 3.3.2 肺癌荷瘤小鼠能增加CD4~+、CD8~+T 细胞PD-1、BTLA的表达 |
| 3.3.3 体内IDO1-sh RNA沉默IDO1 表达抑制了CD4~+、CD8~+T 细胞PD-1、BTLA的表达 |
| 3.3.4 体内IDO1-sh RNA沉默IDO1 表达恢复了细胞因子的分泌 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 综述 IDO1与T细胞耗竭在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
（4）蛋氨酸脑啡肽（Methionine Enkephalin）对人鼻咽癌细胞生物学行为的抑制作用及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 论文一 蛋氨酸脑啡肽(MENK)在体内及体外抑制人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 论文二 蛋氨酸脑啡肽(MENK)抑制人鼻咽癌CNE2细胞迁移侵袭机理的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 药物 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 蛋氨酸脑啡肽(MENK)在鼻咽癌治疗的应用前景 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）缺血损伤相关的新生表位在器官移植术后体液性排斥中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 缺血损伤导致新生表位的产生 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 缺血损伤相关的新生表位在器官移植中的作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 新生表位诱导的移植术后体液性排斥反应的防治探讨 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 褪黑素对肾缺血再灌注损伤的作用及机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 抗体介导的排斥反应在器官移植中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）肝癌浸润淋巴细胞（TILs）的提取以及特性研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）非小细胞肺癌患者组织中PD-L1、CD8+T细胞与p53蛋白表达与治疗疗效的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 免疫治疗的生物标记物研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 MAGE-A10抗原在人肺癌组织的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MAGE-A10抗原在人肺癌细胞系和原代细胞的表达及MAGE-A10的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 去甲基化药物对MAGE-A10 特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肿瘤免疫治疗及MAGE-A抗原在肿瘤免疫治疗中的研究进展和应用现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）免疫疗法联合125I放射粒子治疗非小细胞肺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、~(125)I联合免疫调节人肺癌细胞生物学行为的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 主要试剂、材料与仪器设备 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 蛋白印迹法检测H1299,SPC-A1和A549中PD-L1 表达情况 |
| 1.2.2 不同处理组对H1299肿瘤细胞抑制率的比较 |
| 1.2.3 流式检测不同处理组H1299 肿瘤细胞凋亡结果 |
| 1.2.4 肿瘤细胞侵袭试验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、联合疗法在小鼠移植瘤模型中的疗效研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 主要试剂与材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 小鼠移植瘤模型的建立 |
| 2.2.2 各组荷瘤鼠肿瘤疗效的观察 |
| 2.2.3 不同处理组标本HE染色及免疫组化染色结果 |
| 2.2.4 流式细胞学实验检测各组PD-L1 含量结果 |
| 2.2.5 通过real-time PCR检测各处理组对PD-L1mRNA表达量的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、~(125)I联合抗PD-L1基因表达差异及其通路相关分子 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 主要试剂、材料与仪器设备 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RNA质检结果 |
| 3.2.2 分析mRNA的差异的表达 |
| 3.2.3 分析mRNA的富集 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 非小细胞肺癌免疫疗法及放射性粒子近距离治疗研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）乙型肝炎患者不同感染阶段CD8+CD28+T淋巴细胞表达及其与HBsAg的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 5、结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 A 缩略语表 |
| 附录 B 作者简介 |
| 附录 C 综述 |
| 参考文献 |
四、毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在链霉菌中的表达研究（论文参考文献）
- [1]木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究[D]. 叶书林. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]兰坪虫草多糖联合顺铂增强Lewis荷瘤小鼠的抗肿瘤活性研究[D]. 周树波. 昆明理工大学, 2021(02)
- [3]肺癌源性吲哚胺2,3-双加氧酶1在T细胞耗竭中的作用及其抗癌免疫治疗的实验研究[D]. 尚可. 南昌大学, 2021(01)
- [4]蛋氨酸脑啡肽（Methionine Enkephalin）对人鼻咽癌细胞生物学行为的抑制作用及其作用机制的研究[D]. 胡玥. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]缺血损伤相关的新生表位在器官移植术后体液性排斥中的作用及机制研究[D]. 刘浩. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [6]肝癌浸润淋巴细胞（TILs）的提取以及特性研究[D]. 黄镇辉. 广州医科大学, 2020(01)
- [7]非小细胞肺癌患者组织中PD-L1、CD8+T细胞与p53蛋白表达与治疗疗效的关系[D]. 杜家乐. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [8]5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究[D]. 李振华. 河北医科大学, 2020(01)
- [9]免疫疗法联合125I放射粒子治疗非小细胞肺癌的实验研究[D]. 王硕. 天津医科大学, 2019(02)
- [10]乙型肝炎患者不同感染阶段CD8+CD28+T淋巴细胞表达及其与HBsAg的关系[D]. 周积云. 蚌埠医学院, 2019(01)