一、Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建（论文文献综述）
巩元勇,赵丽华,闫飞,郭书巧,束红梅,倪万潮[1]（2021）在《琉璃苣BoD6D载体的构建及转化》文中提出运用植物基因工程手段构建琉璃苣BoD6D转化载体,为提高油料作物油份中γ-亚麻酸含量奠定基础。以琉璃苣基因组DNA为模板克隆BoD6D,构建酵母表达载体并转化酿酒酵母,对酵母进行诱导表达,提取脂肪酸后进行甲酯化反应,利用气相色谱分析脂肪酸含量;同时构建植物双元表达载体,经农杆菌介导通过蘸花法转化拟南芥,最后对转基因拟南芥通过抗性筛选及PCR进行鉴定。结果表明,BoD6D编码区不含有内含子,可以直接用于后续的功能研究;成功构建了酿酒酵母表达载体pYES2-BoD6D,气相色谱检测结果表明BoD6D在酵母中能够成功的将亚油酸催化生成γ-亚麻酸;成功构建了植物双元表达载体pBI121-BoD6D,卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定结果表明已经成功获得BoD6D的拟南芥转化植株。通过以琉璃苣基因组DNA为模板比较方便的获得有功能的BoD6D用于转基因植物研究。
戎春驰[2]（2019）在《ω-3脂肪酸脱饱和酶结构与底物选择性关系的研究》文中提出ω-3脂肪酸脱饱和酶（ω-3 fatty acid desaturase,ω3Des）是长链多不饱和脂肪酸（long-chain polyunsaturated fatty acids,LC-PUFAs）合成途径的关键酶,可以催化从C16到C20的多种ω-6多不饱和脂肪酸转化为ω-3多不饱和脂肪酸。近年来越来越多文献报道了不同来源的ω3Des,包括酵母、微藻、霉菌等在内,可在生物体内生产LC-PUFAs。以往的研究表明,产油微生物中的ω3Des对各种脂肪酸底物的催化活性存在显着差异。ω3Des的底物选择性直接决定了生物体内ω-6和ω-3脂肪酸的分布,导致ω-6和ω-3脂肪酸组成和比例相差很大。相比于研究比较成熟且完成晶体结构解析的Δ9脂肪酸脱饱和酶（Δ9 fatty acid desaturase,Δ9Des）,调控ω3Des底物选择性的分子机制仍没有定论。为了探究调控ω3Des底物选择性的分子机制及生物转化LC-PUFAs差异的原因,本研究首先应用多种生物信息学工具,筛选并得到4个候选ω3Des基因,完成了对其生物进化、跨膜结构和拓扑结构分析。随后以具有不同底物选择性的高山被孢霉（Mortierella alpina,M.alpina）和丛枝菌根真菌（Rhizophagus irregularis,R.irregularis）来源的ω3Des基因为基础,研究了ω3Des的功能,完成了对其底物选择性的验证,并通过构建12个重组嵌合酶,定位了影响ω3Des底物选择性的关键结构域。最后利用生物信息学方法对ω3Des关键结构域内和结构域外的保守氨基酸的分布情况进行比较分析,通过定点突变技术分别构建一系列突变体,并在酿酒酵母表达系统中进行功能验证;同时借助同源建模和分子对接技术,对影响ω3Des底物选择性的关键位点进行分析,以阐明调控ω3Des底物选择性的分子机制以及产油微生物转化LC-PUFAs差异的内在原因。本研究主要结果如下:1.将多种来源的ω3Des在酿酒酵母中异源表达,在培养基中添加ω-6脂肪酸底物对生长后发酵液和菌体的脂肪酸组成进行分析以研究其底物选择性,筛选并获得了2个候选ω3Des。以来源于瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum,P.aphanidermatum）中的oPaFADS17基因为模板,基于ω3Des基因的保守序列特征,筛选并合成了4个候选ω3Des基因,分别构建酿酒酵母表达载体,诱导后成功表达了oAcFADS17、oBgFADS17、oObFADS17和oRiFADS17蛋白。分析重组酵母发酵液和菌体的脂肪酸组成,结果显示oRiFADS17和oObFADS17两个候选蛋白具有脂肪酸脱饱和酶功能,其中oRiFADS17综合催化能力显着优于已报道的Δ17Des,对DGLA和AA转化率分别达到了61.8%和58.5%,重组酵母中ω-3脂肪酸含量显着增加。同时,本研究首次发现在海洋软体动物中存在脂肪酸脱饱和酶（oObFADS17）。2.基于结构域交换技术构建了12个ω3Des重组嵌合酶并进行异源表达,对酵母重组菌脂肪酸组成分析结果显示,该酶的His I区和His II区之间的片段是影响ω3Des底物选择性的关键结构域。基于氨基酸序列相似度和同源性考虑,选择来源于丛枝菌根真菌中的oRiFADS17和来源于高山被孢霉中的FADS15为亲本蛋白,通过结构域交换技术,将FADS15与oRiFADS17的氨基酸序列划分成6个片段,利用重叠延伸PCR技术融合构建了12个重组嵌合酶Chimera 1-12。在酿酒酵母中进行异源表达及功能检验,结果显示重组嵌合酶Chimera 3和Chimera 9对ω-6脂肪酸的底物转化率显着改变,表明His I区和His II区之间的片段对ω3Des的底物选择性有重要影响。3.对ω3Des关键结构域内氨基酸位点的分析结果显示,W129和T144氨基酸位点对调控ω3Des底物选择性有重要影响。基于ω3Des多序列比对和拓扑结构等信息,对来源于高山被孢霉中的FADS15和来源于丛枝菌根真菌中的oRiFADS17关键结构域内的36个氨基酸残基进行保守性分析,选择了结构域内的6个完全保守氨基酸位点和4个相对保守氨基酸位点进行定点突变,结果显示S118、N124和G128这3个完全保守氨基酸位点对ω3Des催化活性有重要影响,V137和V152氨基酸位点对ω3Des底物的识别起重要作用,W129和T144氨基酸位点对ω3Des底物选择性起关键作用。同源建模和分子对接分析进一步证明了W129和T144氨基酸位点是调控ω3Des底物选择性的关键氨基酸位点,推测W129位点的突变直接作用于底物的脂肪酸部分,降低了底物进入催化活性中心的空间位阻（T144与之相反）,为脂肪酸底物进入底物通道或从底物通道中释放创造了更多的空间,使得长链脂肪酸底物AA在底物通道中进出更有效,从而导致ω3Des底物选择性的改变。4.对ω3Des关键结构域外氨基酸位点的分析结果显示,A44、M156和W291氨基酸位点对调控ω3Des底物选择性有重要影响。基于ω3Des多序列比对和拓扑结构分析结果等信息,以来源于高山被孢霉中的FADS15和瓜果腐霉中的oPaFADS17为亲本蛋白,对其全序列氨基酸进行保守性分析,选择相对保守的8个氨基酸位点进行定点突变,结果显示A44S、M156I和W291M这3个位点氨基酸的替换导致ω3Des底物选择性发生显着改变;对这3个位点进行累积突变,构建累积突变体A44S/M156I、A44S/W291M、M156I/W291M和A44S/M156I/W291M,结果显示这些位点之间并没有协同效应;对oPaFADS17氨基酸序列上相对应的3个位点进行反向突变,构建S21A、I137M和M236W突变体,结果显示这3个位点对oPaFADS17的催化活性有更显着影响。同源建模和分子对接分析结果显示这3个位点与底物的辅酶A（Coenzyme A,CoA）载体部分相邻,推测这3个位点作用于底物的CoA载体部分,影响了CoA载体的定位,间接改变了底物进入催化活性中心的角度和深度,这些氨基酸位点的差异是造成ω3Des底物选择性改变的内在原因。
叶浩盈[3]（2019）在《三角褐指藻脂肪酸去饱和酶基因家族分析及高产EPA藻株的选育》文中提出三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）是一种无异味、易于培养、繁殖快且二十碳五烯酸（EPA）含量丰富的海洋微藻,而EPA在增强人体免疫力、降低血脂、血压等方面有着显着的作用,因此以高产EPA的三角褐指藻作为工业藻株是未来工业发展的新趋势。本研究希望通过分子生物学的方法及常压室温等离子体诱变（ARTP）的方式筛选出高产EPA的三角褐指藻藻株,为工业化提取EPA提供科学依据和可利用的藻株。通过对藻株（FACHB-863）进行形态学与分子生物学鉴定,最终判断该藻株为三角褐指藻。利用涂布、划线法,毛细吸管分离法,再结合抗生素除菌方法,获得无菌藻株。比较液体保藏、固-液双相保藏、低温甘油保藏几种方法的保藏效果,固-液双相保藏效果最好,低温保藏最差,且低浓度保护剂保藏的细胞未能存活。从TAIR中下载拟南芥FAD基因家族,Blast比对筛选出三角褐指藻的FAD基因,共鉴定出15个家族基因。参与脂肪酸合成的去饱和酶基因分别有Δ4、Δ5、Δ6和Δ12,其中,Δ5去饱和酶基因位于11号染色体上并且是参与EPA合成途径中的关键酶基因,所以利用生物信息学对其所编码的蛋白（ptd5α）进行理化性质分析研究。对ptd5α进行分析时发现该蛋白较为稳定,属于亲水性蛋白。ptd5α蛋白有4个跨膜结构域,存在较多潜在的磷酸化位点,说明这些蛋白在与其他酶类蛋白互作过程中可能会改变其磷酸化状态,从而对其生物活性及功能进行调节。本论文针对提高三角褐指藻EPA产量展开了研究。首先对多不饱和脂肪酸合成途径中位于EPA上游的关键酶基因Δ5去饱和酶进行克隆;其次,构建重组质粒p Pha-T1-Δ5导入三角褐指藻中进行过表达;最后,通过ble抗性筛选以及PCR测序验证,筛选出了三株突变藻株（5D1、5D2、5D3）。通过一系列生理生化指标的测定,虽然突变藻株与野生藻株（WT）生长周期差异不显着,但脂肪酸的含量却有显着的提高,尤其是5D1、5D2、5D3三株突变藻株的EPA含量比野生藻株分别提高了24.2%、20.4%、30.9%。荧光定量PCR检测表明突变藻株5D1的Δ5去饱和酶基因的相对表达量较WT提高了61.5%,5D2、5D3藻株的Δ5去饱和酶基因的相对表达量较WT都提高了85.3%。将3株突变藻株与野生藻株基因组重测序发现,各组的In Del和SNP变异情况存在1-4个差异基因。对三角褐指藻野生藻株进行ARTP诱变处理,经初筛和复筛,筛选出4株诱变藻株SJA1、SJA3、SJA4、SJA6,EPA含量分别较野生藻株提高了25.6%、17.4%、15.5%、21.6%。
于海彦,周志峰,贾俊强,桂仲争[4]（2017）在《家蚕类ω3-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、表达及功能研究》文中认为ω3-脂肪酸脱氢酶是生物体内催化多不饱和脂肪酸合成的关键酶之一,其表达受生物胁迫和非生物胁迫因素的影响。从家蚕蛹中克隆了类ω3-脂肪酸脱氢酶基因（Bm FAD3-like）,该基因具有一个长度为1 083 bp的开放阅读框,编码由360个氨基酸残基组成的分子质量为41.5 k D的蛋白质。将该基因克隆到p YES2.0载体,构建重组表达载体p YBm FAD3-like及重组酿酒酵母工程菌株YBm FAD3-like后进行诱导表达,收集菌体提取脂肪酸,经气相色谱检测表明异源表达的重组Bm FAD3-like能够将诱导表达体系中加入的外源底物亚油酸（LA）转化为α-亚麻酸（ALA）。半定量RT-PCR检测Bm FAD3-like基因mRNA几乎在家蚕5龄第3天幼虫的所有组织中都有转录,在5龄幼虫期、蛹期和蛾期的转录水平较高,并且其转录水平受低温（0℃）和真菌（球孢白僵菌Beauveria bassiana）侵染（636 h）诱导显着上调。对家蚕蛹体注射siRNA沉默目的基因1272 h后,Bm FAD3-like mRNA转录水平显着下调。研究结果表明,Bm FAD3-like的表达产物能催化LA在ω3位脱氢生成ALA,并且该基因在蚕体受到低温诱导和真菌侵染等胁迫时显着上调表达,外源siRNA能够介导该基因的沉默,显着下调其转录水平。
杨青[5]（2017）在《中华绒螯蟹Δ9和Δ6脂肪酸去饱和酶的真核表达》文中提出脂肪酸是人类重要的营养来源,其中的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）是人体重要的生理活性物质,PUFAs不仅是生物体的基本成分,同时也是生物体的生命活动代谢产物,PUFAs的合成是通过一系列FAD（Fatty acid desaturase）和脂肪酸延长酶的催化作用形成的。去饱和酶是PUFAs合成途径中的关键酶,它控制着PUFAs的不饱和程度。Δ6脂肪酸去饱和酶（Fatty acid desaturase,Δ6-FAD）和Δ9脂肪酸去饱和酶（Fatty acid desaturase,Δ9-FAD）是PUFAs合成途径的关键酶,都可将特定C-C单键催化成双键。本研究通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术得到中华绒螯蟹肝胰腺cDNA,再根据中华绒螯蟹Δ6-FAD（Δ6-FAD GenBank登录号:KP876058）和Δ9-FAD（Δ9-FAD Accession Number:JQ693685）基因的cDNA序列设计引物,分别得到中华绒螯蟹Δ6-FAD和Δ9-FAD基因的开放阅读框（ORF）。以此为材料,分别构建酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统,验证Δ6和Δ9-FAD的功能。并通过SDS-PAGE和Western-blotting、气相色谱-质谱联用（GCMS）等试验方法对实验结果进行分析验证。酿酒酵母表达系统使用酵母INVSC1,选取表达载体pYES2,分别根据Δ6和Δ9-FAD的ORF和载体p YES2的序列,设计引物,每对引物上加上6xHis标签,通过PCR得到含有6xHis标签的Δ6和Δ9-FAD目的基因序列,分别特定的快切酶,酶切目的基因和载体,再通过T4DNA连接酶连接,得到重组质粒并送公司测序验证。将测序正确的重组质粒电转入酵母感受态细胞中,在SC-U固体培养上30℃基培养24-36h,挑取阳性菌株,进行酵母菌液PCR,将条带正确的菌液送去测序验证,将测序正确的菌株分别在16℃,25℃,30℃诱导表达,并在24h,48h,72h,96h取样,样品经处理后用经Westernblot分析和GC-MS检测。Δ6和Δ9-FAD基因在酿酒酵母中的表达结果显示:分别将含有Δ6和Δ9-FAD基因的重组质粒转化酿酒酵母后,样品处理后经Westernblot检测,并没有目的蛋白条带;测定脂肪酸,添加外源LA和ALA的Δ6-FAD诱导表达组以及不添加任何外源底物的表达组没有检测到γ-亚麻酸（γ-Linolenic Acid,GLA）或十八碳四烯酸（C18:4）;同时,添加外源底物硬脂酸（C18:0）的Δ9-FAD诱导表达组以及不添加任何外源底物的表达组都没有检测到油酸（C18:1）。毕赤酵母表达系统选取酵母GS115,选pPIC3.5K为Δ9-FAD的表达载体,选取pPICZαA为Δ6-FAD的表达载体。分别根据Δ6和Δ9-FAD的ORF和各自对应的载体的序列,设计引物,每对引物上加上His标签,通过PCR得到含有His标签的Δ6和Δ9-FAD目的基因序列,分别用特定的快切酶,酶切目的基因和载体,再通过T4DNA连接酶连接,得到重组质粒;经Sac1线性化后,将重组质粒电转入酵母细胞中,并经过不同浓度梯度抗性筛选,获得高拷贝的转化株,并挑取阳性菌株测序验证,将测序正确的菌株在30℃诱导表达,并在48h取样检测。Δ6和Δ9-FAD基因在毕赤酵母中的表达结果显示:成功构建了含有Δ6和Δ9-FAD基因的重组毕赤酵母表达菌株,在不同诱导条件下培养,菌样经Westernblot检测,Δ6-FAD诱导表达组在60KD处检测到目的蛋白表达,并经质谱鉴定为Δ6-FAD蛋白,至此成功将Δ6-FAD在毕赤酵母中表达。
于海彦[6]（2017）在《家蚕类ω3-/Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆、表达及功能研究》文中研究说明家蚕是重要的经济昆虫之一,也是非常重要的模式昆虫和实验材料,蚕蛹是重要的蚕桑产业副产物,对蚕蛹脂肪酸组成及其合成机制的研究可以为蚕蛹的综合利用提供理论依据,对家蚕脂肪酸合成代谢的分子机制研究显得十分必要。本论文基于家蚕最新基因组数据库资源,通过生物信息分析方法对家蚕脂肪脱氢酶进行克隆、序列分析,并对家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因进行了表达模式、原核表达、酿酒酵母表达等研究,为探究BmFAD3-like和BmD6DES基因的功能,对低温诱导、真菌侵染和RNAi的处理后的蚕蛹体内两个基因的mRNA相对转录水平变化进行了初步研究。获得如下研究结果:1.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的克隆及序列分析利用脂肪酸脱氢酶蛋白保守的组氨酸结构域序列对家蚕基因组序列进行同源性检索,设计合成特异性引物,从蚕蛹中分别克隆到1 083 bp和1 335 bp的cDNA片段,分别命名为BmFAD3-like和BmD6DES。利用cDNA末端快速快速扩增技术（RACE）对两个脂肪酸脱氢酶基因进行了cDNA全长扩增,BmFAD3-like全长为1 727 bp,开放阅读框（ORF）全长1 083 bp,编码360个氨基酸,预测分子量为41.5 KDa,等电点为7.1;BmD6DES全长为2 298 bp,开放阅读框（ORF）全长1 335 bp,编码444个氨基酸,预测分子量为51.7 KDa,等电点8.05。两条基因的编码蛋白均不含信号肽序列。基于家蚕及其它昆虫脂肪酸脱氢酶蛋白保守序列的多序列比对结果,构建了脂肪酸脱氢酶基因系统进化树,BmFAD3-like和BmD6DES基因同昆虫中已报道的其它脂肪酸脱氢酶基因之间的相似性较小。2.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的表达模式研究利用semi RT-PCR方法检测家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因在家蚕个体发育过程中的表达模式研究。BmFAD3-like和BmD6DES两个基因在家蚕大部分个体发育期都有表达,只是表达量有差异。其中BmFAD3-like基因,从蚁蚕期到三龄眠期都有显着表达,从4龄起蚕到成蛾产卵期持续显着高表达,但是在卵期的表达极弱几乎检测不到。BmD6DES基因在家蚕不同发育时期的表达模式和BmFAD3-like基因非常相似,不同的是其在于蛹期特别是在蛹变态发育期的表达量明显高于其他时期,并且在蛾后期表达有明显的下降。通过分析家蚕幼虫5龄3d各组织中BmFAD3-like和BmD6DES两个基因的表达模式,BmFAD3-like基因在幼虫5龄第3天的各个组织器官中均有表达,特别是在卵巢、脂肪体、血淋巴、表皮和表达相对较高,在中肠、丝腺、精囊中表达量极少。同样,BmD6DES基因在家蚕幼虫5龄第3天各组织中也均有表达,特别是在脂肪体、表皮、精囊和卵巢表达相对较高,在中肠、丝腺、头部和血淋巴中表达量极少。总之,家蚕脂肪酸脱氢酶基因主要在家蚕成虫-蛹-蛾变态发育的后期和脂肪体、表皮和生殖器官中表达,推测其可能与家蚕脂质体的存储、生殖发育、求偶交配、信息素合成有关。3.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因原核表达研究将BmFAD3-like和BmD6DES基因构建重组载体后转入大肠杆菌表BL21（DE3）中,体外表达两个基因的编码蛋白并用含His-tag的层析柱纯化所表达蛋白,原核表达的结果显示,BmFAD3-like和BmD6DES基因所编码的蛋白使用最终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h后,融合蛋白能够被大肠杆菌高效表达;所表达的两种融合蛋白为非可溶性蛋白,在大肠杆菌内以包涵体形式存在;Western Blotting印迹结果验证了重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中获得成功表达,电泳结果显示所表达蛋白质分子量为44.3KDa和54.8 KDa,其大小与预测的BmFAD3-like和BmD6DES基因编码蛋白质相一致。4.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因在酿酒酵母细胞表达研究将BmFAD3-like和BmD6DES基因双酶切后构建到酿酒酵母表达载体pYES2.0中,将工程菌株进行发酵,发酵液中添加2%的半乳糖糖诱导目的基因表达,亚油酸LA做为外源底物。气相色谱分析工程菌发酵产物的脂肪酸成分,以只含pYES2.0空质粒的工程菌为对照。结果表明这两个基因都能在酵母中表达,与对照相比pYBmFAD3-like发酵产物中产生了一种新的脂肪酸色谱峰,经鉴定为α-亚麻酸（ALA）即C18:3?9,12,15,含量占发酵产物总脂肪酸的2.8%,同样pYBmD6DES发酵产物中也产生了一种新的脂肪酸色谱峰,经鉴定为γ-亚麻酸（GLA）即C18:3?6,9,12,含量占总脂肪酸的2.1%。5.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的表达调控研究为进一步探究BmFAD3-like和BmD6DES基因的表达调控,我们对这两个基因在蚕蛹受低温诱导、真菌侵染和siRNA介导的RNAi处置后的相对转录水平进行了qRT-PCR检测。蚕蛹BmFAD3-like和BmD6DES基因受低温诱导后mRNA表达量在0℃下36 h后有30%和28%的上调,但此后mRNA的相对转录水平和对照相比并无较大变化,推测低温能诱导mRNA的上调表达,但是不能大幅度提升蛋白质（酶）的活性。BmFAD3-like和BmD6DES基因在真菌侵染的诱导下mRNA相对转录水平在6 h后有分别有160%和145%的上调,12 h后mRNA的相对转录水平超过对照量120%和110%,到60 h后蛹体内BmFAD3-like基因表达量不到对照的20%。蚕蛹BmD6DES在siRNA介导的RNAi干涉后mRNA表达量在25℃下12 h后分别有8%和10%的下调,此后随着时间的增加mRNA的相对转录水平一直下降,到36 h后下降达到最大值的45%和60%,蚕蛹BmFAD3-like和BmD6DES基因的mRNA相对转录水平能有效地被siRNA介导的RNAi干涉。
史海粟[7]（2016）在《Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性研究及其在高山被孢霉中的应用》文中认为生物体中的多不饱和脂肪酸是通过脂肪酸合成途径逐步生成的,而Δ6脂肪酸脱饱和酶（delta 6 fatty acid desaturase,FADS6）是这个途径中催化亚油酸（linoleic acid,LA）和α-亚麻酸（α-linolenic acid,ALA）在6位碳脱饱和分别形成γ-亚麻酸（γ-linolenic acid,GLA）和十八碳四烯酸（stearidonic acid,SDA）的关键酶,该酶的底物选择性直接决定生物体内ω6和ω3脂肪酸的分布。在ω6和ω3组成比例存在显着差异的生物体中,其Δ6脂肪酸脱饱和酶的底物选择性不同。高山被孢霉（Mortierella alpina,M.alpina）已被广泛应用于花生四稀酸（arachidonic acid,AA）的生产,其ω6系脂肪酸含量达到总脂含量的40%,而ω3系脂肪酸如二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid,EPA）含量很低（仅低温能产,含量为1-3%）;而细小微胞藻中EPA含量达到总脂含量的26%,ω6系脂肪酸含量却很低（仅0.1%左右）。本研究从分析高山被孢霉和细小微胞藻的Δ6脂肪酸脱饱和酶基因入手,从蛋白质一级结构层面解析影响FADS6底物选择性的关键区域和位点,并将偏好ω3系的细小微胞藻Δ6脂肪酸脱饱和酶基因应用于高山被孢霉生物合成EPA的研究。主要研究结果如下:1.Δ6脂肪酸脱饱和酶的底物选择性研究:以pYES2/NT C质粒为骨架构建了细小微胞藻Δ6脂肪酸脱饱和酶基因和高山被孢霉Δ6-I与Δ6-II脂肪酸脱饱和酶基因的表达载体并转化至酿酒酵母,通过在培养基中添加Δ6脂肪酸脱饱和酶的底物来考察3个Δ6脂肪酸脱饱和酶对各底物的选择性。结果表明,高山被孢霉中Δ6-I脂肪酸脱饱和酶（MaFADS6-I）对ω6系的LA具有底物选择性,Δ6-II脂肪酸脱饱和酶（MaFADS6-II）对底物没有选择性,而细小微胞藻中Δ6脂肪酸脱饱和酶（MpFADS6）对ω3系的ALA具有底物选择性。2.分析影响Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性的结构区域:为研究MaFADS6-I和MpFADS6具有不同底物偏好作用的机制,将两者的氨基酸序列按照保守区域划分为五部分,利用重叠延伸PCR的方法获得了十种重组Δ6脂肪酸脱饱和酶的融合基因,并在酿酒酵母中测定了这十种Δ6脂肪酸脱饱和酶融合酶的活性。结果表明,Δ6脂肪酸脱饱和酶中His I区和His II区之间的片段对其底物选择性有重要影响;细胞色素b5区（HPGG）和His I区之间的片段也对其底物选择性有影响;底物浓度的改变不会影响Δ6脂肪酸脱饱和酶的底物选择性。3.分析影响Δ6脂肪酸脱饱和酶活性的关键催化位点:在定位了影响Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性关键区域的基础上,选取细小微胞藻Δ6脂肪酸脱饱和酶His I区和His II区域内37个氨基酸残基中的7组位点进行定点突变,研究结果证明MpFADS6中G194,E222,M227和V399/I400四组位点对底物的识别起重要作用;进一步选取高山被孢霉Δ6-I脂肪酸脱饱和酶中细胞色素b5区（HPGG）下游的5组位点进行定点突变,研究结果证明MaFADS6-I中K61和D68两组位点对LA的催化作用有重要影响。从而找到Δ6脂肪酸脱饱和酶两个关键区域中影响其催化活性的关键位点。4.偏好催化ω3系ALA的MpFADS6基因在高山被孢霉中的异源表达:首先以pBIG2-ura5s质粒为骨架构建了MpFADS6的二元表达载体,然后利用根癌农杆菌介导方法将MpFADS6基因整合至尿嘧啶营养缺陷型高山被孢霉的基因组,通过对转化子的筛选和鉴定得到了高山被孢霉重组菌株（Ma-MpFADS6）。5.高山被孢霉重组菌株应用于EPA合成:在恒温和变温培养条件下,高山被孢霉重组菌中EPA产量分别为80.0 mg/L和90.4 mg/L;为了提高MpFADS6底物的含量,以游离型ALA为外源底物,高山被孢霉重组菌中EPA产量达到114.5 mg/L;考虑培养成本和游离型底物稳定性的因素,以富含ALA的牡丹籽油（PSO）和牡丹籽粕（PSM）为外源底物,高山被孢霉重组菌中EPA产量分别达到149.3 mg/L和515.29 mg/L;在外源添加50 g/L PSM于5升发酵罐发酵16天后,高山被孢霉重组菌株中EPA产量达到588.5 mg/L,占总脂的7.8%,比原始菌株（0.8%）提高了9.8倍,利用分批补料发酵方法发酵16天后,高山被孢霉重组菌株中EPA产量提升至638.5 mg/L,比原始菌株（22.5mg/L）提高了28.4倍,成功实现了在高山被孢霉中通过ω3脂肪酸合成途径生产EPA。
葛德鹏,全越,卢刚,王长远[8]（2014）在《深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及pGAPZαA-D6D表达载体的构建》文中提出被孢霉属（Mortieralla isabellina）是目前用于微生物发酵生产γ-亚麻酸（GLA）的主要菌种。根据Δ6-脂肪酸脱氢酶基因保守区以及pGAPZαA载体的多克隆位点设计引物,上下游分别加入ECoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,从深黄被孢霉中克隆Δ6-脂肪酸脱氢酶基因（D6D）,并与pGAPZαA表达载体进行连接,经酶切与PCR鉴定重组质粒,证明成功构建了pGAPZαA-D6D表达载体。
朱祺[9]（2013）在《深黄被孢霉诱变菌株Δ5-脂肪酸脱氢酶在大肠杆菌中表达》文中认为花生四烯酸是ω-6系列的一种重要多不饱和脂肪酸，在维持细胞膜的结构与功能方面具有重要的作用，它不仅作为一种极为重要的结构脂类广泛存在于哺乳动物的组织（特别是神经组织）器官中，而且还是许多二十碳衍生物如前列腺素E2，前列环素，血栓烷A2和白三烯等物质的前体，具有广泛的生物活性和重要的营养作用。ARA在体内不能从头合成，必须由食物供给它们相应的前体物质如：脂肪酸-亚油酸和α-亚麻酸，在此基础上经过脱氢和碳链的延长作用转化而来。其中Δ5-脂肪酸脱氢酶是催化AA形成的最后一步脱饱和反应的酶，它以二高-γ亚麻酸为底物，催化其第5位碳脱氢形成AA，是ARA合成途径上的限速酶。本研究根据pET-30a（+）载体序列多克隆位点，参照GenBank报道的△5脂肪酸脱氢酶基因序列，利用Oligo6软件设计了一对扩增△5脂肪酸脱氢酶基因序列的特异性引物。提取深黄被孢霉基因组总RNA，经反转录合成cDNA，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增△5脂肪酸脱氢酶基因，与pMD18-T载体连接，转化到E.coli DH5α感受态细胞中，筛选构建的重组质粒，经PCR、酶切、测序鉴定后，以Not I和Sal I双酶切重组质粒和表达载体pET-30a（+），用DNAT4连接酶连接，转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，筛选构建表达质粒，在IPTG浓度为1.0mmoL/L、诱导6h表达水平最高，表达出的55kDa蛋白（含6个组氨酸标签），并对蛋白分离纯化，进行SDS-PAGE电泳，最后经Western bloting鉴定，结果表明该蛋白可与△5脂肪酸脱氢酶发生特异性反应，具有较好的抗原性，证实了所得蛋白为△5脂肪酸脱氢酶。本研究克隆了深黄被孢霉△5脂肪酸脱氢酶基因，成功构建了重组表达质粒，获得了稳定表达的pET30（+）大肠杆菌原核表达体系，这为进行△5脂肪酸脱氢酶的结构与相关功能研究和构建基因工程菌株奠定了一定的基础。
黎明[10]（2012）在《花生四烯酸和二十碳五烯酸合成途径的构建及大豆种子特异性启动子的改造》文中提出多不饱脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids, PUFAs）,尤其是超长链多不饱和脂肪酸（Very long chain polyunsaturated fatty acids, VLC-PUFAs），具有十分重要的生理功能，是维持人体健康所必需的。通常情况下PUFAs主要来源于深海鱼油和海洋藻类，但是由于过度捕捞，海洋污染以及藻类生产PUFAs价格的昂贵，因此迫切需要寻找一种PUFAs的替代来源。随着转基因技术的迅速发展，利用转基因的油料作物生产PUFAs被认为是一种十分有前景的的替代来源。大豆是最主要的油料作物之一，含有非常丰富的亚油酸（Linoleic acid, LA）和α-亚麻酸（α-Linolenic acid,ALA），它们分别占大豆中总脂肪酸的55%和13%，是合成花生四烯酸（Arachidonic acid, ARA）和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid, EPA）的前体。因此，大豆是通过代谢工程生产ARA和EPA的重要宿主。在转基因植物中，ARA和EPA生物合成的Δ6途径已经被广泛研究了，但Δ8途径仅在拟南芥中进行研究并且不是种子特异性表达。由于在转基因植物中ARA和EPA生物合成的Δ6途径存在复杂的底物转换瓶颈，因此，在本研究中，我们分别在酿酒酵母和大豆中重构ARA和EPA生物合成的Δ8途径，构建出产ARA和EPA的酿酒酵母工程菌和无选择标记基因的转基因大豆；同时对BCSP952启动子进行改造，以便提高转基因大豆中ARA和EPA的合成效率。首先，分别从球等鞭金藻H29（Isochrysis galbana H29）、小眼虫藻FH277（Euglena gracilis FH277）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中克隆出Δ8途径中的三个基因Δ9延长酶基因IgASE2、Δ8脱氢酶基因efd2和Δ5脱氢酶基因ptd5，并在酿酒酵母INVSc1中鉴定它们的功能。IgASE2基因长1653bp，包括一个786bp的ORF （Open reading frame）、一个44bp的5’-UTR（Untranslatedregion）和一个823bp3’-UTR。该基因编码的延长酶IgASE2与已经报道的延长酶IgASE1的氨基酸序列有87%的相似性。IgASE2在酿酒酵母中表达时，能分别将LA和ALA转化成二十碳二烯酸（ω6-eicosadienoic acid, EDA）和二十碳三烯酸（ω3-eicosatrienoic acid, EtrA），LA和ALA的转化率分别是57.6%和56.1%，表明IgASE2基因是一个新的C18-Δ9专一性的PUFAs延长酶基因。efd2基因ORF长1266bp，编码421个氨基酸，它与已经报道的EFD1的氨基酸序列相似性为96%。efd2基因在酿酒酵母中表达时，催化底物EDA和EtrA转化成二高γ-亚麻酸（dihomo-γ-linolenic acid, DGLA）和二十碳四烯酸（eicosatetraenoic acid, ETA）的转化效率分别约为31.2％和46.3％，表明efd2是一个位置专一性的Δ8脱氢酶基因。ptd5基因ORF长1410bp，编码469个氨基酸。它在酿酒酵母中表达时，催化DGLA和ETA生成ARA和EPA的效率分别约28.7%和37.2%，表明ptd5是一个位置专一性的Δ5脱氢酶基因。然后，利用克隆的IgASE2、efd2和ptd5基因，分别在酿酒酵母和大豆中构建了ARA和EPA生物合成的Δ8（ω6-Δ8, ω3-Δ8）途径，获得了产ARA和EPA的酿酒酵母工程菌和无选择标记基因的转基因大豆。根据ARA和EPA生物合成的Δ8（ω6-Δ8, ω3-Δ8）途径，将该途径中所需要的三个目的基因IgASE2、efd2和ptd5的表达盒有机集合在一起，构建成酿酒酵母共表达载体pYAE5。将该表达载体pYAE5转化至酿酒酵母INVSc1，构建成酿酒酵母工程菌YAE985。该菌在添加外源底物LA和ALA的诱导培养基中诱导表达后，产生的ARA和EPA分别占总脂肪酸含量的1.6%和2.5%，LA转化成ARA以及ALA转化成EPA的最终转化率分别是10.1%和16.9%。这些结果表明，在酿酒酵母中成功地构建了ARA和EPA生物合成的Δ8（ω6-Δ8, ω3-Δ8）途径。利用RT-PCR（Real Time PCR）对工程菌YAE985的遗传稳定性进行了检测，结果表明：工程菌连续转接20次后，IgASE2、efd2和ptd5基因在转录水平仍然保持1：1：1的关系，说明没有发生遗传重组和目的基因部分丢失的情况，因此酿酒酵母工程菌YAE985具有很好的遗传稳定性。用大豆种子特异性启动子BCSP952分别构建基因IgASE2、efd2和ptd5的表达盒，并克隆进表达载体pBX，构建成通过Δ8（ω6-Δ8, ω3-Δ8）途径生物合成ARA和EPA的无选择标记转基因大豆的表达载体pX9AE5。用根瘤农杆菌介导的方法进行大豆转化，筛选出含有Δ8（ω6-Δ8, ω3-Δ8）生物合成途径的转基因大豆。然后对阳性转化植株进行雌二醇诱导，进一步筛选出无选择标记的转基因大豆。转基因大豆种子中ARA和EPA的含量分别占总脂肪酸含量的6.8%和3.6%。这些结果表明，在无选择标记的转基因大豆中成功地构建了ARA和EPA生物合成的Δ8（ω6-Δ8, ω3-Δ8）途径。最后，为了提高转基因大豆中ARA和EPA的合成水平，本文对BCSP952进行了功能分析。在此基础上，对BCSP952进行改造，以提高BCSP952的强度。为了分析BCSP952的功能，分别构建了BCSP952的5-端缺失启动子片段BCSP666、BCSP471、BCSP285和BCSP156。将它们连接到pBI121质粒的GUS基因上游后转化拟南芥并通过GUS组化检测和GUS酶活性测定来鉴定这些启动子的功能。结果表明：BCSP666的活性与BCSP952活性基本相同，达到BCSP952活性的96.5%；BCSP471的活性次之，约为BCSP952活性的69.4%；BCSP285和BCSP156的活性相对较低，仅为BCSP952活性的15.5%和10.1%；除BCSP156片段外，其余5’-端缺失启动子片段都具有种子特异性。说明：种子特异性元件的种类和数量直接影响启动子的强度；并且，在BCSP952启动子的转录起始位点至上游约-594位这个区段内，种子特异性启动子元件的数量越多，启动子的活性越强，但是超过这个区域，增加这些元件的数量，并不能有效增加启动子的强度。为了提高BCSP952的强度，通过在BCSP952启动子的-140位插入ABRE和Sph元件，构建成启动子BCSP952-aa、 BCSP952-as和BCSP952-ss，并将它们转化至拟南芥中进行功能鉴定。GUS组化检测和GUS活性测定表明：GUS基因只在种子中表达，说明改造后的启动子是种子特异性的启动子；BCSP952-as控制的GUS活性最高，约为BCSP952的180%、BCSP952-aa控制的GUS活性次之，约为BCSP952的112%、BCSP952-ss控制的GUS活性反而降低，约为BCSP952的88%。然后，从每种类型的启动子中选择GUS活性最高的4个株系进行southern杂交和RT-PCR分析。Southern杂交表明，含有BCSP952-ss的一个株系的GUS基因是双拷贝，其余启动子的株系中GUS基因都是单拷贝。RT-PCR分析表明：BCSP952-as控制的GUS基因转录水平最高，BCSP952-aa次之，BCSP952-ss最低，这与测定的GUS活性是一致的。这些结果说明：通过对BCSP952进行改造，提高了BCSP952的强度；并且BCSP952的-140位插入一个ABRE和一个Sph元件时的BCSP952-as最强，其强度比BCSP952提高了80%，在BCSP952的-140位插入两个ABRE元件时的BCSP952-aa次之，其强度比BCSP952提高了12%，在BCSP952的-140位插入两个Sph元件时的BCSP952-ss的强度反而降低。
二、Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）琉璃苣BoD6D载体的构建及转化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 琉璃苣BoD6D的克隆及序列测定 |
| 2.2 酿酒酵母表达载体pYES2-BoD6D的构建 |
| 2.3 BoD6D在酿酒酵母中的表达及产物分析 |
| 2.4 植物表达载体pBI121-BoD6D的获得及拟南芥转化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）ω-3脂肪酸脱饱和酶结构与底物选择性关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略符号 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸简介 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的结构与分类 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的生理功能 |
| 1.1.3 多不饱和脂肪酸的来源 |
| 1.1.4 多不饱和脂肪酸的合成途径 |
| 1.2 ω-3脂肪酸脱饱和酶的研究进展 |
| 1.2.1 ω-3脂肪酸脱饱和酶的重要性 |
| 1.2.2 ω-3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达 |
| 1.2.3 ω-3脂肪酸脱饱和酶的结构与功能关系 |
| 1.2.4 ω-3脂肪酸脱饱和酶底物选择性的研究 |
| 1.3 脂肪酸脱饱和酶的分子改造与研究进展 |
| 1.3.1 脂肪酸脱饱和酶分子改造概述 |
| 1.3.2 基于结构域交换技术研究脂肪酸脱饱和酶 |
| 1.3.3 基于定点突变技术研究脂肪酸脱饱和酶 |
| 1.4 论文的研究目的与意义 |
| 1.5 论文的主要研究内容 |
| 第二章 ω-3脂肪酸脱饱和酶亲本蛋白的选择及其底物选择性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验菌株 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 实验仪器与设备 |
| 2.2.5 PCR引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 ω-3脂肪酸脱饱和酶系统进化树构建与同源性分析 |
| 2.3.2 ω-3脂肪酸脱饱和酶跨膜结构和拓扑结构分析 |
| 2.3.3 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶基因表达载体构建 |
| 2.3.4 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶基因表达载体转化宿主菌 |
| 2.3.5 酿酒酵母的诱导表达 |
| 2.3.6 Western blot分析相对蛋白表达量 |
| 2.3.7 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶活性测定 |
| 2.3.8 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶同源建模和分子对接 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶基因的筛选 |
| 2.4.2 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶生物进化、跨膜结构和拓扑结构分析 |
| 2.4.3 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶表达载体构建 |
| 2.4.4 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶诱导表达和鉴定 |
| 2.4.5 候选ω-3脂肪酸脱饱和酶活性及底物选择性分析 |
| 2.4.6 oObFADS17和oRiFADS17同源建模和分子对接 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 影响ω-3脂肪酸脱饱和酶底物选择性的结构域分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 实验仪器与设备 |
| 3.2.5 PCR引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 ω-3脂肪酸脱饱和酶亲本蛋白的确定 |
| 3.3.2 ω-3脂肪酸脱饱和酶功能区域划分依据 |
| 3.3.3 基于重叠延伸PCR方法融合基因的获得 |
| 3.3.4 ω-3脂肪酸脱饱和酶融合基因表达载体构建 |
| 3.3.5 ω-3脂肪酸脱饱和酶融合基因表达载体转化宿主菌 |
| 3.3.6 酿酒酵母的诱导表达 |
| 3.3.7 Western blot分析相对蛋白表达量 |
| 3.3.8 ω-3脂肪酸脱饱和酶的活性测定及分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 ω-3脂肪酸脱饱和酶的序列分析 |
| 3.4.2 12个重组嵌合酶基因的融合 |
| 3.4.3 ω-3脂肪酸脱饱和酶表达载体构建 |
| 3.4.4 ω-3脂肪酸脱饱和酶融合基因的诱导表达和鉴定 |
| 3.4.5 ω-3脂肪酸脱饱和酶的底物选择性分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结构域内调控ω-3脂肪酸脱饱和酶底物选择性关键氨基酸分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 实验菌株 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 实验仪器与设备 |
| 4.2.5 PCR引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 ω-3脂肪酸脱饱和酶多序列比对分析 |
| 4.3.2 结构域内突变体的构建 |
| 4.3.3 结构域内突变体表达载体构建 |
| 4.3.4 结构域内突变体转化宿主菌 |
| 4.3.5 酿酒酵母的诱导表达 |
| 4.3.6 Western blot分析相对蛋白表达量 |
| 4.3.7 结构域内突变体的活性测定及分析 |
| 4.3.8 ω-3脂肪酸脱饱和酶同源建模和分子对接 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 ω-3脂肪酸脱饱和酶的序列分析以及突变位点选择 |
| 4.4.2 突变体表达载体构建 |
| 4.4.3 突变体的诱导表达分析 |
| 4.4.4 完全保守氨基酸突变体底物选择性分析 |
| 4.4.5 完全保守氨基酸突变体三维结构模拟分析 |
| 4.4.6 相对保守氨基酸突变体底物选择性分析 |
| 4.4.7 相对保守氨基酸突变体三维结构模拟分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结构域外调控ω-3脂肪酸脱饱和酶底物选择性关键氨基酸分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 实验菌株 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 实验仪器与设备 |
| 5.2.5 PCR引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 ω-3脂肪酸脱饱和酶多序列比对分析 |
| 5.3.2 全序列突变体表达载体构建 |
| 5.3.3 全序列突变体转化宿主细胞 |
| 5.3.4 酿酒酵母的诱导表达 |
| 5.3.5 Western blot分析相对蛋白表达量 |
| 5.3.6 全序列突变体的活性测定及分析 |
| 5.3.7 ω-3脂肪酸脱饱和酶同源建模和分子对接 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 ω-3脂肪酸脱饱和酶的序列分析以及突变位点选择 |
| 5.4.2 全序列突变体表达载体构建 |
| 5.4.3 全序列突变体的诱导表达分析 |
| 5.4.4 全序列突变体底物选择性分析 |
| 5.4.5 全序列突变体三维结构模拟分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:用于生物信息学分析的ω-3脂肪酸脱饱和酶 |
| 附录Ⅱ:候选ω-3脂肪酸脱饱和酶的氨基酸序列 |
| 附录Ⅲ:12个重组嵌合酶的氨基酸序列 |
| 附录Ⅳ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）三角褐指藻脂肪酸去饱和酶基因家族分析及高产EPA藻株的选育（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1.1 三角褐指藻简介 |
| 1.2 国内外研究状况 |
| 1.3 三角褐指藻转化方法 |
| 1.4 二十碳五烯酸 |
| 1.4.1 二十碳五烯酸简介及功能 |
| 1.4.2 二十碳五烯酸合成途径 |
| 1.5 脂肪酸去饱和酶 |
| 1.5.1 脂肪酸去饱和酶的简介 |
| 1.5.2 脂肪酸去饱和酶作用机制 |
| 1.5.3 脂肪酸去饱和酶发展前景 |
| 1.6 脂肪酸去饱和酶基因家族研究 |
| 1.7 全基因组测序技术 |
| 1.8 三角褐指藻诱变育种研究 |
| 1.9 研究内容 |
| 1.10 研究意义 |
| 1.11 创新点 |
| 1.12 技术路线 |
| 第一章 藻种鉴定、纯化、保藏及基因组大小的预估 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要的仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 藻种培养 |
| 1.2.2 藻种鉴定 |
| 1.2.3 藻种无菌化 |
| 1.2.4 藻种保藏 |
| 1.2.5 三角褐指藻基因组大小的预估 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 形态学鉴定结果 |
| 1.3.2 三角褐指藻的细胞密度与光吸收值的对应关系 |
| 1.3.3 三角褐指藻的生长曲线 |
| 1.3.4 分子生物学的鉴定结果 |
| 1.3.5 三角褐指藻无菌化培养结果 |
| 1.3.6 藻种的保藏结果 |
| 1.3.7 三角褐指藻基因组大小的预估结果 |
| 1.4 讨论与小结 |
| 第二章 三角褐指藻中脂肪酸去饱和酶基因家族分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 三角褐指藻去饱和酶基因家族鉴定 |
| 2.2.2 基因家族成员序列特征分析 |
| 2.2.3 基因家族序列motif分析 |
| 2.2.4 基因在染色体上定位 |
| 2.2.5 基因家族进化树构建和基因结构分析 |
| 2.2.6 Δ5 去饱和酶基因(PTD5α)编码的蛋白序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 三角褐指藻去饱和酶基因家族(FAD family)鉴定 |
| 2.3.2 基因家族成员的序列特征分析 |
| 2.3.3 FAD基因家族motif分析 |
| 2.3.4 基因在染色体上的定位 |
| 2.3.5 基因家族基因结构分析 |
| 2.3.6 FAD基因家族进化树分析 |
| 2.3.7 PTD5α编码蛋白(ptd5α)基本性质分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 Δ5-去饱和酶基因的克隆及过表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 藻株 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 三角褐指藻RNA的提取 |
| 3.2.2 Δ5-c DNA第一链的合成 |
| 3.2.3 Δ5 去饱和酶基因的克隆 |
| 3.2.4 过表达载体p Pha-T1-Δ5 的构建 |
| 3.2.5 电击转化三角褐指藻 |
| 3.2.6 阳性转化子的筛选及验证 |
| 3.2.7 脂肪酸标准曲线的绘制 |
| 3.2.8 脂肪酸的提取及测定 |
| 3.2.9 荧光定量PCR的检测 |
| 3.2.10 野生藻株与突变藻株基因组重测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Δ5 去饱和酶基因的克隆 |
| 3.3.2 Δ5 基因过表达载体pPha-T1 的构建和鉴定 |
| 3.3.3 阳性转化子的筛选 |
| 3.3.4 阳性转化子的验证 |
| 3.3.5 目的基因的荧光定量检测 |
| 3.3.6 脂肪酸标品的检测 |
| 3.3.7 突变藻株在各个时期脂肪酸含量测定 |
| 3.3.8 野生藻株与突变藻株基因组重测序的结果 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 三角褐指藻ARTP诱变育种 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 藻种准备 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 诱变时间的筛选 |
| 4.2.2 致死率计算 |
| 4.2.3 诱变藻株的初筛 |
| 4.2.4 诱变藻株的复筛 |
| 4.2.5 诱变藻株与野生藻株的脂肪酸的测定 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 致死率统计 |
| 4.3.2 诱变藻株初筛 |
| 4.3.3 诱变藻株复筛 |
| 4.3.4 诱变藻株与野生藻株表型及脂肪酸的测定 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 附录1 测序序列 |
| 附录2 相关试剂及缓冲液配方 |
| 附录3 英文缩写检索 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）家蚕类ω3-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、表达及功能研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试家蚕及取样 |
| 1.2 总RNA及基因组DNA的提取 |
| 1.3 目的基因扩增的引物设计与合成 |
| 1.4 家蚕ω3-脂肪酸脱氢酶基因全长序列克隆 |
| 1.4.1 目的基因片段PCR |
| 1.4.2 目的基因5'端和3'端的RACE扩增 |
| 1.5 目的基因在家蚕不同发育期及不同组织中表达的半定量RT-PCR检测 |
| 1.6 目的基因的重组表达及产物的酶催化功能检测 |
| 1.6.1 重组酿酒酵母工程菌株的构建及诱导表达 |
| 1.6.2 菌体细胞中的脂肪酸检测 |
| 1.7 低温和真菌侵染诱导及RNAi对目的基因表达的影响试验 |
| 1.7.1 低温诱导 |
| 1.7.2 真菌感染 |
| 1.7.3 RNAi处理 |
| 1.7.4 qRT-PCR检测 |
| 1.8 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bm FAD3-like基因的克隆和序列特征 |
| 2.2 Bm FAD3-like基因编码氨基酸的序列分析 |
| 2.3 Bm FAD3-like基因在家蚕不同发育阶段和幼虫组织中的表达谱 |
| 2.4 重组Bm FAD3-like在酿酒酵母中的表达及酶催化活性 |
| 2.4.1 重组Bm FAD3-like的表达 |
| 2.4.2 重组Bm FAD3-like的酶催化活性 |
| 2.5 蚕蛹中Bm FAD3-like基因的诱导表达变化 |
| 2.5.1 低温诱导 |
| 2.5.2 真菌感染诱导 |
| 2.6 蚕蛹经siRNA干涉处理后Bm FAD3-like基因的表达变化 |
| 3 讨论 |
（5）中华绒螯蟹Δ9和Δ6脂肪酸去饱和酶的真核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言（综述） |
| 1.1 多不饱和脂肪酸的研究概述 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的分类及命名 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的主要来源 |
| 1.1.3 多不饱和脂肪酸的生物合成途径 |
| 1.1.4 多不饱和脂肪酸的主要生理功能 |
| 1.2 脂肪酸去饱和酶的研究概述 |
| 1.2.1 脂肪酸去饱和酶的分类、命名及分布 |
| 1.2.2 脂肪酸去饱和酶的结构 |
| 1.2.3 脂肪酸去饱和酶的研究进展 |
| 1.3 酵母表达系统 |
| 1.3.1 酿酒酵母表达系统 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.3 酵母表达外源基因时的影响因素 |
| 1.4 本项研究的目的和意义 |
| 第二章 Δ9脂肪酸去饱和酶在酵母中的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 酿酒酵母Δ9脂肪酸去饱和酶基因表达的构建 |
| 2.3.2 毕赤酵母Δ9脂肪酸去饱和酶基因表达的构建 |
| 2.3.3 酿酒酵母感受态细胞的制备、转化和诱导表达 |
| 2.3.4 毕赤酵母感受态细胞的制备、转化和诱导表达 |
| 2.3.5 酵母表达产物的检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 Δ9脂肪酸去饱和酶酿酒酵母表达载体的构建及表达 |
| 2.4.1.1 中华绒螯蟹Δ9-FAD开放阅读框的PCR扩增 |
| 2.4.1.2 ?9-FAD基因克隆质粒pMD19T-?9-FAD的菌液PCR结果 |
| 2.4.1.3 重组质粒pY-FAD9的构建与鉴定结果 |
| 2.4.1.4 阳性重组酿酒酵母菌株的筛选和鉴定结果 |
| 2.4.1.5 重组pY-FAD9酿酒酵母菌株表达结果 |
| 2.4.2 ?9脂肪酸去饱和酶酿毕赤母表达载体的构建及表达 |
| 2.4.2.1 中华绒螯蟹Δ9-FAD开放阅读框的PCR扩增 |
| 2.4.2.2 ?9-FAD基因克隆质粒pGEMT-?9-FAD的菌液PCR结果 |
| 2.4.2.3 重组质粒pPIC3.5k-?9-FAD的构建与鉴定结果 |
| 2.4.2.4 阳性重组毕赤酵母菌株的筛选和鉴定结果 |
| 2.4.2.5 重组pPIC3.5K-FAD9毕赤酵母菌株表达结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Δ6脂肪酸去饱和酶在酵母中的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 酿酒酵母Δ6脂肪酸去饱和酶基因表达的构建及转化 |
| 3.3.2 毕赤酵母Δ6脂肪酸去饱和酶基因表达的构建及转化 |
| 3.3.3 酿酒酵母感受态细胞的制备、转化和诱导表达 |
| 3.3.4 毕赤酵母感受态细胞的制备、转化和诱导表达 |
| 3.3.5 酵母表达产物的检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Δ6脂肪酸去饱和酶酿酒酵母表达载体的构建及表达 |
| 3.4.1.1 中华绒螯蟹Δ6-FAD开放阅读框的PCR扩增 |
| 3.4.1.2 ?6-FAD基因克隆质粒pMD19T-?6-FAD的菌液PCR结果 |
| 3.4.1.3 重组质粒pY-FAD6的构建与鉴定结果 |
| 3.4.1.4 阳性重组酿酒酵母菌株的筛选和鉴定结果 |
| 3.4.1.5 重组pY-FAD6酿酒酵母菌株表达结果 |
| 3.4.2 Δ6脂肪酸去饱和酶酿毕赤母表达载体的构建及表达 |
| 3.4.2.1 中华绒螯蟹Δ6-FAD开放阅读框的PCR扩增 |
| 3.4.2.2 ?6-FAD基因克隆质粒pGEMT-?6-FAD的菌液PCR结果 |
| 3.4.2.3 重组质粒pPIC ZαA-?6-FAD的构建与鉴定结果 |
| 3.4.2.4 阳性重组毕赤酵母菌株的筛选和鉴定结果 |
| 3.4.2.5 WesternBlot检测结果 |
| 3.5 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）家蚕类ω3-/Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆、表达及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写说明 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸合成途径的研究进展 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的生物学活性 |
| 1.1.3 生物体内多不饱和脂肪酸的合成 |
| 1.2 α-亚麻酸和 γ-亚麻酸的研究进展 |
| 1.2.1 α-亚麻酸的研究进展 |
| 1.2.2 γ-亚麻酸研究进展 |
| 1.3 脂肪酸脱氢酶基因的研究进展 |
| 1.3.1 脂肪酸脱氢酶的基本概况 |
| 1.3.2 脂肪酸脱氢酶基因研究的常用方法 |
| 1.3.3 ω3-脂肪酸脱氢酶的研究进展 |
| 1.3.4 Δ6-脂肪酸脱氢酶研究进展 |
| 1.3.5 Δ6-脂肪酸脱氢酶的结构与功能 |
| 1.3.6 Δ6-脂肪酸脱氢酶的系统进化研究进展 |
| 1.4 昆虫脂肪酸脱氢酶的研究进展 |
| 1.4.1 昆虫脂肪酸概述 |
| 1.4.2 昆虫脂肪酸脱氢酶概述 |
| 1.4.3 家蚕脂肪酸脱氢酶概述 |
| 1.5 研究背景及意义 |
| 1.5.1 研究的主要内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 酶和试剂 |
| 2.2.3 引物合成和测序 |
| 2.2.4 培养基和溶液配制 |
| 2.2.5 仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 家蚕总RNA和基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因核心片段的获取 |
| 2.3.3 重组质粒的构建与检测 |
| 2.3.4 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因 5’-RACE-Ready cDNA的合成 |
| 2.3.5 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因 5’SMART RACE PCR扩增 |
| 2.3.6 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因 3’-RACE-Ready cDNA的合成 |
| 2.3.7 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因 3’ SMART RACE PCR扩增 |
| 2.3.8 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的表达模式 |
| 2.3.9 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的序列分析 |
| 2.3.10 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的进化树构建 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 家蚕总RNA抽提结果 |
| 2.4.2 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES RACE扩增电泳结果 |
| 2.4.3 BmFAD3-like和BmD6DES RACE全长扩增拼接结果 |
| 2.4.5 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的序列分析 |
| 2.4.6 BmFAD3-like和BmD6DES基因的同源序列比对和进化分析 |
| 2.4.7 BmFAD3-like和BmD6DES基因表达谱分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的原核表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要载体及试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 主要试剂配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因重组表达质粒的构建 |
| 3.3.2 转化细胞的诱导表达 |
| 3.3.3 电泳 |
| 3.3.4 Western bloting检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 原核表达载体的构建 |
| 3.4.2 基因重组质粒的构建 |
| 3.4.3 BmFAD3-like和BmD6DES蛋白诱导及表达形式鉴定 |
| 3.4.4 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES蛋白的Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因在酿酒酵母中的表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 菌株和质粒 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组表达载体的构建 |
| 4.3.2 酿酒酵母感受态细胞的制备及转化(醋酸锂法) |
| 4.3.3 酵母阳性转化子质粒提取及检测 |
| 4.3.4 酿酒酵母工程菌的筛选和诱导表达 |
| 4.3.5 重组基因表达产物样品的气相色谱分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 表达载体构建 |
| 4.4.2 阳性克隆的筛选 |
| 4.4.3 脂肪酸GC检测 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的表达调控研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.2.3 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 低温诱导对家蚕BmFAD3-like和BmD6DES mRNA相对转录水平的影响 |
| 5.3.2 真菌侵染对家蚕BmFAD3-like和BmD6DES mRNA相对转录水平的影响 |
| 5.3.3 注射siRNA后对家蚕BmFAD3-like和BmD6DES mRNA相对转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性研究及其在高山被孢霉中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸概述 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的结构与分类 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的功能 |
| 1.1.3 多不饱和脂肪酸的来源 |
| 1.1.4 多不饱和脂肪酸生物合成途径 |
| 1.1.5 多不饱和脂肪酸的发展现状及应用前景 |
| 1.2 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的研究进展 |
| 1.2.1 Δ6 脂肪酸脱饱和酶在多不饱和脂肪酸生物合成途径中的重要性 |
| 1.2.2 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达 |
| 1.2.3 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的结构与功能关系 |
| 1.2.4 Δ6 脂肪酸脱饱和酶对底物的选择性 |
| 1.2.5 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的分子改造研究 |
| 1.3 高山被孢霉脂质合成研究进展 |
| 1.3.1 高山被孢霉简介 |
| 1.3.2 高山被孢霉合成多不饱和脂肪酸 |
| 1.3.3 高山被孢霉的遗传改造 |
| 1.4 本课题的立题依据和意义 |
| 1.5 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的底物选择性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 供试菌株与质粒 |
| 2.2.2 培养基及相关溶液 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 |
| 2.2.5 PCR引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 高山被孢霉总RNA的提取及反转录 |
| 2.3.2 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因的获得 |
| 2.3.3 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因表达载体的构建 |
| 2.3.4 表达载体转化宿主细胞 |
| 2.3.5 酿酒酵母的诱导表达 |
| 2.3.6 SDS-PAGE和Western bolt分析 |
| 2.3.7 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的活性测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 Δ6 脂肪酸脱饱和酶表达载体的构建 |
| 2.4.2 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的诱导表达和鉴定 |
| 2.4.3 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的活性及底物选择性分析 |
| 2.4.4 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因的序列分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 影响 Δ6 脂肪酸脱饱和酶底物选择性的结构区域分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 供试菌株与质粒 |
| 3.2.2 培养基及相关溶液 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器和设备 |
| 3.2.5 PCR引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Δ6 脂肪酸脱饱和酶功能区域划分依据 |
| 3.3.2 基于重叠延伸PCR方法的融合基因的获得 |
| 3.3.3 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合基因表达载体的构建 |
| 3.3.4 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合基因表达载体转化宿主细胞 |
| 3.3.5 酿酒酵母的诱导表达 |
| 3.3.6 SDS-PAGE和Western bolt分析 |
| 3.3.7 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的底物浓度的选择 |
| 3.3.8 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的活性测定及分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的多序列比对分析 |
| 3.4.2 基因重组 |
| 3.4.3 表达载体的构建 |
| 3.4.4 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合基因的诱导表达和鉴定 |
| 3.4.5 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合酶的底物选择性测定 |
| 3.4.6 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合酶的底物浓度的选择 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 影响 Δ6 脂肪酸脱饱和酶活性的关键催化位点分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 供试菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基及相关溶液 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要仪器和设备 |
| 4.2.5 PCR引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 突变质粒的构建 |
| 4.3.2 表达载体转化宿主细胞 |
| 4.3.3 酿酒酵母的诱导表达 |
| 4.3.4 SDS-PAGE和Western bolt分析 |
| 4.3.5 Δ6 脂肪酸脱饱和酶突变体的活性测定 |
| 4.3.6 突变体的三维结构模拟 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 同源序列比对分析及突变位点确定 |
| 4.4.2 突变体构建 |
| 4.4.3 突变基因的表达水平 |
| 4.4.4 MpFADS6中His I和His II区域的突变体的活性分析 |
| 4.4.5 MpFADS6突变体的三维结构模拟分析 |
| 4.4.6 MaFADS6-Ι 中HPGG下游位点的突变体的活性分析 |
| 4.4.7 MaFADS6-Ι 突变体的三维结构模拟分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 细小微胞藻 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因在高山被孢霉中的异源表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 供试菌株和质粒 |
| 5.2.2 培养基及相关溶液 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 主要仪器和设备 |
| 5.2.5 PCR引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 质粒的构建 |
| 5.3.2 根癌农杆菌介导的转化 |
| 5.3.3 重组菌株的筛选和鉴定 |
| 5.3.4 重组菌株中MaFADS6-I基因和MpFADS6基因的相对表达水平 |
| 5.3.5 重组菌株的培养条件及脂肪酸提取与检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 二元表达载体的构建 |
| 5.4.2 二元表达载体转化根癌农杆菌 |
| 5.4.3 根癌农杆菌介导转化高山被孢霉及重组菌株的筛选和鉴定 |
| 5.4.4 高山被孢霉重组菌株中MpFADS6基因的相对表达水平分析 |
| 5.4.5 重组菌株的脂肪酸组成分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 高山被孢霉重组菌生产EPA条件优化 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与设备 |
| 6.2.1 供试菌株 |
| 6.2.2 培养基及相关溶液 |
| 6.2.3 主要试剂 |
| 6.2.4 主要仪器和设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 重组菌株的培养条件及脂肪酸提取与检测 |
| 6.3.2 在重组菌株中外源添加游离脂肪酸、牡丹籽油和牡丹籽粕各底物的培养条件 |
| 6.3.3 发酵罐培养重组菌株的培养条件及发酵参数测定 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 重组菌株在变温条件下合成EPA |
| 6.4.2 外源添加游离脂肪酸底物对重组菌合成EPA的影响 |
| 6.4.3 外源添加牡丹籽油底物对重组菌合成EPA的影响 |
| 6.4.4 外源添加牡丹籽粕汁底物对重组菌合成EPA的影响 |
| 6.4.5 分批发酵培养重组菌合成EPA |
| 6.4.6 分批补料发酵培养重组菌合成EPA |
| 6.4.7 分批发酵与分批补料发酵结果的比较 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及pGAPZαA-D6D表达载体的构建（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 工具酶、试剂与培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 目的基因的合成 |
| 2.2 大肠杆菌感受态细胞DH5a的制备 |
| 2.3 目的基因的克隆及鉴定 |
| 2.4 目的基因与p GAPZαA表达载体的连接 |
| 2.5 p GAPZαA-D6D重组质粒的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 深黄被孢霉D6D基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 D6D基因克隆质粒p MD18-T-D6D的PCR鉴定结果 |
| 3.3 D6D基因克隆质粒p MD18-T-D6D的酶切鉴定结果 |
| 3.4 Δ6-脂肪酸脱氢酶基因重组质粒p GAPZα-D6D的PCR鉴定 |
| 3.5 Δ6-脂肪酸脱氢酶基因重组质粒p GAPZα-D6D的酶切鉴定结果 |
| 4 结论与讨论 |
（9）深黄被孢霉诱变菌株Δ5-脂肪酸脱氢酶在大肠杆菌中表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 花生四烯酸的简介 |
| 1.1.1 花生四烯酸的主要分布和来源 |
| 1.1.2 花生烯烯酸的主要功能 |
| 1.1.3 花生四烯酸的应用 |
| 1.2 脂肪酸脱氢酶的简介 |
| 1.2.1 脂肪酸脱氢酶的分类 |
| 1.2.2 脂肪酸脱氢酶的结构 |
| 1.2.3 脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统的研究进展 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统的特点 |
| 1.3.2 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理 |
| 1.3.3 外源基因在大肠杆菌中的高效表达策略 |
| 1.3.4 应用前景及展望 |
| 第二章 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因的克隆及分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基及溶液的配置 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 菌种活化及培养 |
| 2.1.7 深黄被孢霉总 RNA 的提取 |
| 2.1.8 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因 cDNA 的合成 |
| 2.1.9 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因的扩增 |
| 2.1.10 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因 PCR 产物的电泳分析 |
| 2.1.11 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因的回收与纯化 |
| 2.1.12 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因的连接 |
| 2.1.13 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.1.14 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.1.15 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因重组质粒的提取 |
| 2.1.16 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶重组质粒的鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 深黄被孢霉总 RNA 的提取 |
| 2.2.2 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因的 PCR 扩增结果 |
| 2.2.3 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因重组质粒的 PCR 鉴定结果 |
| 2.2.4 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.2.5 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶基因的测序结果分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 深黄被孢霉△5 脂肪酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达和鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒和表达载体的双酶切 |
| 3.2.2 △5 脂肪酸脱氢酶基因以及表达载体的回收与纯化 |
| 3.2.3 重组表达质粒的构建 |
| 3.2.4 连接产物转化大肠杆菌感受态 |
| 3.2.5 重组表达质粒的提取 |
| 3.2.6 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.7 重组表达质粒转化表达宿主菌 |
| 3.2.8 重组表达质粒的诱导表达以及 SDS-PAGE 分析 |
| 3.2.9 表达产物的 Western bloting 鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的双酶切 |
| 3.3.2 表达宿主菌的菌液 PCR 鉴定 |
| 3.3.3 重组表达质粒的诱导表达的 SDS-PAGE 分析 |
| 3.3.4 表达产物的 WB 分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）花生四烯酸和二十碳五烯酸合成途径的构建及大豆种子特异性启动子的改造（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 多不饱和脂肪酸概述 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的命名和主要类型 |
| 1.1.2 PUFAs 的来源 |
| 1.1.3 PUFAs 的生理功能 |
| 1.1.4 PUFAs 的合成途径 |
| 1.1.4.1 植物中 PUFAs 的生物合成 |
| 1.1.4.2 动物中 PUFAs 的生物合成 |
| 1.1.4.3 微生物中 PUFAs 的生物合成 |
| 第二节 脂肪酸脱氢酶和脂肪酸延长酶的研究进展 |
| 1.2.1 脂肪酸脱氢酶的研究进展 |
| 1.2.1.1 脂肪酸脱氢酶的分类和基本特征 |
| 1.2.1.2 植物中的 PUFAs 脱氢酶 |
| 1.2.1.3 动物中的 PUFAs 脱氢酶 |
| 1.2.1.4 低等真核生物中的 PUFAs 脱氢酶 |
| 1.2.2 脂肪酸延长酶的研究进展 |
| 1.2.2.1 脂肪酸延长酶系统的组成及延长过程 |
| 1.2.2.2 哺乳动物体内的延长酶 |
| 1.2.2.3 植物体内的延长酶 |
| 1.2.2.4 微生物体内的延长酶 |
| 第三节 PUFAs 代谢工程的研究进展 |
| 1.3.1 用微生物生产 PUFAs 的代谢工程 |
| 1.3.2 用植物生产 PUFAs 的代谢工程 |
| 1.3.2.1 转基因植物生产 GLA 和 SDA |
| 1.3.2.2 转基因植物生产 VLC-PUFAs |
| 1.3.3 用转基因油料作物生产 PUFAs 的前景 |
| 第四节 开发无选择标记的转基因植物的研究进展 |
| 1.4.1 转基因植物概况 |
| 1.4.2 开发无选择标记的转基因作物的意义 |
| 1.4.3 开发无选择标记的转基因作物的策略 |
| 1.4.3.1 共转化 |
| 1.4.3.2 转座子介导方法 |
| 1.4.3.3 位点特异性重组 |
| 第五节 种子特异性启动子的研究进展 |
| 1.5.1 已经克隆的种子特异性启动子 |
| 1.5.2 种子特异性启动子序列结构特点 |
| 1.5.3 与种子特异性启动子有关的反式作用因子 |
| 1.5.4 种子特异性启动子功能的研究方法 |
| 1.5.4.1 研究方法 |
| 1.5.4.2 种子特异性启动子功能研究的报告基因 |
| 1.5.4.3 种子特异性启动子功能研究的受体植物 |
| 1.5.5 种子特异性启动子的应用展望 |
| 第六节 选题依据和技术路线 |
| 1.6.1 选题依据 |
| 1.6.2 工作背景 |
| 1.6.3 主要研究内容 |
| 1.6.4 技术路线 |
| 第二章 Δ9 延长酶、Δ8 脱氢酶和Δ5 脱氢酶基因的克隆、序列分析及功能鉴定 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 培养基配制 |
| 2.2.2 试剂的配制 |
| 2.2.3 藻类基因组 DNA 的提取 (CTAB 法) |
| 2.2.4 总 RNA 的提取 |
| 2.2.5 DNA 和 RNA 的定量分析 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 大肠杆菌的转化 |
| 2.2.8 质粒 DNA 的提取 |
| 2.2.9 酿酒酵母感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.10 Δ9 延长酶基因 IgASE2 的克隆 |
| 2.2.10.1 球等鞭金藻 H29 的培养 |
| 2.2.10.2 球等鞭金藻 H29 总 RNA 的提取及反转录反应 |
| 2.2.10.3 IgASE2 基因核心区的扩增与纯化 |
| 2.2.10.4 重组质粒 pT-ASEC 的构建 |
| 2.2.10.5 大肠杆菌的转化与筛选 |
| 2.2.10.6 IgASE2 基因 5’区序列的克隆 |
| 2.2.10.7 IgASE2 基因 3’区序列的克隆 |
| 2.2.10.8 全长 IgASE2 基因的扩增及序列分析 |
| 2.2.11 IgASE2 基因的功能分析 |
| 2.2.11.1 表达载体 pYASE 的构建 |
| 2.2.11.2 酿酒酵母工程菌的构建与筛选 |
| 2.2.11.3 酿酒酵母工程菌的诱导表达 |
| 2.2.11.4 酿酒酵母工程菌总脂肪酸的提取与甲酯化 |
| 2.2.11.5 总脂肪酸的检测与分析 |
| 2.2.12 Δ8 脱氢酶基因 efd 2 克隆 |
| 2.2.12.1 小眼虫藻培养 |
| 2.2.12.2 小眼虫藻总 RNA 的提取及反转录反应 |
| 2.2.12.3 efd2 基因 ORF 的扩增与纯化 |
| 2.2.12.4 重组质粒 pT-EFD 的构建与鉴定 |
| 2.2.12.5 efd2 基因 ORF 的序列分析 |
| 2.2.13 efd2 基因的功能分析 |
| 2.2.13.1 表达载体 pYEFD 的构建 |
| 2.2.13.2 酿酒酵母工程菌的构建与筛选 |
| 2.2.13.3 酿酒酵母工程菌的诱导表达 |
| 2.2.13.4 酿酒酵母工程菌总脂肪酸的提取与甲酯化 |
| 2.2.13.5 总脂肪酸的检测与分析 |
| 2.2.14 Δ5 脱氢酶基因 ptd5 克隆与功能鉴定 |
| 2.2.14.1 三角褐指藻培养 |
| 2.2.14.2 ptd5 基因的克隆与表达载体 pYPTD5 的构建 |
| 2.2.14.3 酿酒酵母工程菌的构建、筛选与诱导表达 |
| 2.2.14.4 酿酒酵母工程菌总脂肪酸的提取与甲酯化 |
| 2.2.14.5 总脂肪酸的检测与分析 |
| 第三节 结果与分析 |
| 2.3.1 IgASE2 基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.1.1 IgASE2 基因的克隆策略 |
| 2.3.1.2 球等鞭金藻总 RNA 的提取 |
| 2.3.1.3 IgASE2 基因核心区序列的克隆 |
| 2.3.1.4 IgASE2 基因 5’区序列的克隆 |
| 2.3.1.5 IgASE2 基因 3’区序列的克隆 |
| 2.3.1.6 全长 IgASE2 基因的克隆 |
| 2.3.1.7 IgASE2 基因的序列分析 |
| 2.3.1.8 IgASE2 基因的系统进化分析 |
| 2.3.2 IgASE2 基因的功能分析 |
| 2.3.2.1 IgASE2 基因酿酒酵母表达载体 pYASE 的构建 |
| 2.3.2.2 酿酒酵母工程菌 YASE9 的构建与诱导表达 |
| 2.3.2.3 通过 GC 和 GC-MS 鉴定 IgASE2 的功能 |
| 2.3.3 efd2 基因的克隆与功能分析 |
| 2.3.3.1 小眼虫藻 H277 总 RNA 的提取 |
| 2.3.3.2 efd2 基因 ORF 的克隆 |
| 2.3.3.3 efd2 基因的序列分析 |
| 2.3.3.4 efd2 基因表达载体 pYEFD 的构建与鉴定 |
| 2.3.3.5 efd2 基因的诱导表达与功能分析 |
| 2.3.4 三角褐指藻 ptd5 基因的克隆与功能鉴定 |
| 2.3.4.1 三角褐指藻 RNA 的提取 |
| 2.3.4.2 ptd5 基因 ORF 的克隆与序列分析 |
| 2.3.4.3 表达载体 pYPTD5 的构建与鉴定 |
| 2.3.4.4 ptd5 基因的诱导表达与功能验证 |
| 第四节 讨论 |
| 2.4.1 IgASE2 基因的克隆与序列分析 |
| 2.4.2 IgASE2 基因的功能分析 |
| 2.4.3 efd2 基因的克隆与功能分析 |
| 2.4.4 ptd5 基因的克隆与功能鉴定 |
| 第五节 小结 |
| 第三章 ARA 和 EPA Δ８合成途径的构建 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和大豆种子 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 培养基配制 |
| 3.2.2 试剂的配制 |
| 3.2.3 质粒 DNA 提取 |
| 3.2.4 大豆基因组 DNA 提取 (异丙醇法) |
| 3.2.5 PCR 反应体系 |
| 3.2.6 酶切体系 |
| 3.2.7 酶切片段去磷酸化 |
| 3.2.8 DNA 连接体系 |
| 3.2.9 大肠杆菌的转化和筛选 |
| 3.2.10 酿酒酵母的转化和筛选 |
| 3.2.11 脂肪酸的提取与分析 |
| 3.2.12 Real-time PCR 方法 |
| 3.2.13 根瘤农杆菌的转化 |
| 3.2.13.1 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.13.2 农杆菌的转化与鉴定 |
| 3.2.14 大豆的转化 |
| 3.2.14.1 重组农杆菌的活化 |
| 3.2.14.2 大豆子叶节的获得 |
| 3.2.14.3 大豆子叶节的转化及再生培养 |
| 3.2.15 β-雌二醇诱导方法 |
| 3.2.16 转基因植株的 PCR 检测 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.3.1 在酿酒酵母中构建 ARA 和 EPA 合成的Δ8 途径 |
| 3.3.1.1 酿酒酵母共表达载体 pYAE5 的构建策略 |
| 3.3.1.2 酿酒酵母表达载体 pYAE 的构建 |
| 3.3.1.3 酿酒酵母表达载体 pYAE5 的构建 |
| 3.3.1.4 酿酒酵母工程菌株 YAE985 的诱导表达与 PUFAs 分析 |
| 3.3.1.5 酿酒酵母工程菌 YAE985 的遗传稳定性分析 |
| 3.3.2 在大豆中中构建 ARA 和 EPA 合成的Δ8 途径 |
| 3.3.2.1 表达载体 pXB 的构建 |
| 3.3.2.2 无选择标记的共表达载体 pX9AE5 的构建 |
| 3.3.2.3 转基因大豆的组织培养 |
| 3.3.2.4 转基因大豆的筛选和鉴定 |
| 3.3.2.5 转基因大豆选标记转基因的删除和鉴定 |
| 3.3.2.6 无筛选标记转基因大豆的脂肪酸分析 |
| 第四节 讨论 |
| 3.4.1 产 ARA 和 EPA 酿酒酵母工程菌的构建与 PUFAs 分析 |
| 3.4.2 无筛选标记的共表达载体 pX9AE5 的构建 |
| 3.4.3 无筛选标记转基因大豆的遗传转化与筛选 |
| 3.4.4 无筛选标记转基因大豆的 PUFAs 分析 |
| 第五节 小结 |
| 第四章 大豆种子特异性启动子 BCSP952 的改造 |
| 第一节 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和拟南芥种子 |
| 4.1.2 质粒 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 4.2.1 培养基配制 |
| 4.2.2 试剂的配制 |
| 4.2.3 质粒 DNA 提取 |
| 4.2.4 拟南芥基因组 DNA 提取 |
| 4.2.5 PCR 反应 |
| 4.2.6 重叠 PCR |
| 4.2.7 酶切反应 |
| 4.2.8 DNA 连接反应 |
| 4.2.9 大肠杆菌的转化和筛选 |
| 4.2.10 根瘤农杆菌的转化 |
| 4.2.11 拟南芥的转化：花蕾转化法 |
| 4.2.11.1 重组农杆菌的活化 |
| 4.2.11.2 拟南芥的培养 |
| 4.2.11.3 拟南芥的转化及转化子筛选 |
| 4.2.12 转基因拟南芥的 GUS 酶活性分析 |
| 4.2.12.1 组织化学检测 (Histochemical analysis) |
| 4.2.12.2 荧光光度检测 (Fluorometric analysis) |
| 4.2.13 Southern 杂交 |
| 4.2.14 Real-Time PCR |
| 第三节 结果与分析 |
| 4.3.1 启动子 BCSP952 的缺失分析 |
| 4.3.1.1 BCSP952 启动子 5’端缺失的植物表达载体的构建 |
| 4.3.1.2 农杆菌的转化与鉴定 |
| 4.3.1.3 拟南芥的转化与筛选鉴定 |
| 4.3.1.4 转基因拟南芥的 GUS 活性检测 |
| 4.3.2 启动子 BCSP952 的改造 |
| 4.3.2.1 BCSP952 启动子的改造及其植物表达载体的构建 |
| 4.3.2.2 农杆菌的转化与鉴定 |
| 4.3.2.3 拟南芥的转化与筛选鉴定 |
| 4.3.2.4 转基因拟南芥的 GUS 活性检测 |
| 4.3.2.5 转基因拟南芥的 Southern 杂交分析 |
| 4.3.2.6 转基因拟南芥中 GUS 的表达分析 |
| 第四节 讨论 |
| 4.4.1 启动子 BCSP952 缺失突变分析 |
| 4.4.2 启动子 BCSP952 的改造 |
| 第五节 小结 |
| 4.5.1 BCSP952 缺失突变分析 |
| 4.5.2 BCSP952 的改造 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 相关工作的前景展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
四、Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]琉璃苣BoD6D载体的构建及转化[J]. 巩元勇,赵丽华,闫飞,郭书巧,束红梅,倪万潮. 生物技术通报, 2021(03)
- [2]ω-3脂肪酸脱饱和酶结构与底物选择性关系的研究[D]. 戎春驰. 江南大学, 2019(05)
- [3]三角褐指藻脂肪酸去饱和酶基因家族分析及高产EPA藻株的选育[D]. 叶浩盈. 福建师范大学, 2019(12)
- [4]家蚕类ω3-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、表达及功能研究[J]. 于海彦,周志峰,贾俊强,桂仲争. 蚕业科学, 2017(04)
- [5]中华绒螯蟹Δ9和Δ6脂肪酸去饱和酶的真核表达[D]. 杨青. 上海海洋大学, 2017(02)
- [6]家蚕类ω3-/Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆、表达及功能研究[D]. 于海彦. 江苏科技大学, 2017(01)
- [7]Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性研究及其在高山被孢霉中的应用[D]. 史海粟. 江南大学, 2016(02)
- [8]深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及pGAPZαA-D6D表达载体的构建[J]. 葛德鹏,全越,卢刚,王长远. 农产品加工(学刊), 2014(13)
- [9]深黄被孢霉诱变菌株Δ5-脂肪酸脱氢酶在大肠杆菌中表达[D]. 朱祺. 黑龙江八一农垦大学, 2013(10)
- [10]花生四烯酸和二十碳五烯酸合成途径的构建及大豆种子特异性启动子的改造[D]. 黎明. 南开大学, 2012(08)