一、大鼠心肌细胞的培养纯化及其在药理毒理学中的应用（论文文献综述）
崔文平[1]（2021）在《松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究》文中进行了进一步梳理ALV-J作为一种典型的反转录病毒,近些年来在鸡群中多次爆发,给养殖业造成了巨大损失。目前防控ALV-J的种鸡群净化措施存在投入大,周期长等缺点,迫切需要寻求新的方法进行有效防控。前期研究显示松花粉多糖在抗ALV-J试验中具有一定活性,但由于尚未进行深入研究,松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础尚不清楚,无法解释其抗ALV-J的机制,也难以对其活性和质量进行评价控制。同时,作为一种大分子多糖,在动物体内往往存在难以透过胃肠道黏膜吸收,易被免疫系统识别,导致代谢失活的缺点。因此,研究松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础,阐释其构效关系,并进一步构建合适的药物递送系统,提高其体内生物利用度和抗ALV-J活性,为ALV-J防治提供新的方法,具有重要的科学意义和研究价值。一、松花粉多糖抗ALV-J活性单体分离鉴定及构效关系研究单因素试验筛选优化提取工艺,通过总多糖提取产率确定最佳提取条件:提取温度90℃,提取溶液p H 9.0,液固比30:1,获得总多糖的最终提取率为6.5±0.19%。通过DEAE离子交换柱和sephadex G-200分子排阻色谱柱分离多糖,得到三个单体组分（PPP-1、PPP-2和PPP-3）。CCK-8试验显示各组分在800μg/m L以下无明显细胞毒性,体外抗病毒试验表明三个组分抗ALV-J活性顺序为PPP-2>PPP-3>>PPP-1。为进一步研究三个组分抗ALV-J活性的构效关系,对其分子量、单糖组成及三螺旋构象进一步分析。结果表明三个组分分子量分别为463.70、99.41和26.97 k Da,差异显着;PPP-2和PPP-3的单糖组成接近,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量高于PPP-1,而葡萄糖含量显着偏低;刚果红试验显示只有PPP-2具有三螺旋结构,破坏PPP-2三螺旋结构后其活性明显下降。结合文献报道,初步推测松花粉多糖抗ALV-J活性构效关系如下:单糖组成是影响松花粉多糖活性的主要因素,含有酸性单糖的单体组分显示出较好的抗ALV-J活性,空间构象也是影响其活性的重要因素,三螺旋结构的保持可以提高PPP-2抗ALV-J效果,同时分子量也可能对其活性具有一定影响。本部分实验研究了松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础,阐释其构效关系,为进一步研究松花粉多糖抗ALV-J活性提供了物质基础。二、松花粉多糖壳聚糖纳米药物制备及其抗ALV-J活性研究为改善松花粉多糖在体内易代谢失活的缺点,实验借助松花粉多糖和壳聚糖间的静电作用,以及壳聚糖纳米粒自组装原理,制备了松花粉多糖壳聚糖纳米药物（CS-PPPs NPs）来延长松花粉多糖在鸡体内作用时间,提高抗ALV-J活性。通过包封率、载药量及粒径对CS-PPPs NPs的制备条件进行筛选,得出最优制备工艺:壳聚糖浓度为2 mg/m L、多聚磷酸钠与壳聚糖的比例为1:8,多糖占壳聚糖的浓度10.00%,所制备的CS-PPPs NPs包封率可达91.2%,载药量达8.2%,平均粒径264 nm,PDI=0.21。体外释放实验显示所制备CS-PPPs NPs在96 h累计释放率为90%,具有较好的缓释效果;细胞实验表明,纳米粒可以携带药物进入细胞并可以缓慢释放,低于400μg/m L时,对DF-1细胞没有明显毒性作用;体外抗ALV-J活性结果表明,CS-PPPs NPs通过缓释作用延长了作用时间,提高了抗病毒效果。进一步开展实验结果表明,空白壳聚糖纳米粒没有明显的抗病毒效果,松花粉多糖溶液在短期内有较好的抗ALV-J复制的效果,但在长期实验中,PPPs组因代谢排泄效果明显下降。CS-PPPs NPs在体内显示出较好的缓释作用,在长期抗ALV-J复制中具有较好的效果,可以长时间保护鸡体,提高鸡只的免疫力和生长速度。三、基于抗体靶向的壳聚糖纳米药物递送系统增强松花粉多糖抗ALV-J活性研究为提高药物在动物体内抗病毒活性,同时减小对动物本身的毒性,本实验以松花粉多糖（PPPs）作为模型药物,以JE9抗体作为抗ALV-J指示剂,构建了新型靶向抗ALV-J纳米药物递送系统（Ab-CS-PPPs DDS）。实验通过EDC和NHS催化合成连接抗体的纳米药物（Ab-CS-PPPs NPs）,通过红外光谱、透射电镜和粒度分析仪进行表征,结果显示JE9抗体成功与壳聚糖连接,纳米药物连接抗体后,粒径、包封率、载药量及体外释放度均无显着变化。使用FITC荧光探针,考察其在细胞和动物体内对病毒的靶向性,结果显示,感染ALV-J的细胞对Ab-CS-PPPs NPs摄取更快,持续时间更长。体内实验显示,Ab-CS-PPPs NPs在感染ALV-J鸡的肝脏、肾脏、胸腺、脾脏及法氏囊上具有明显的富集性。体内外抗ALV-J实验均显示,偶联抗体后,纳米药物抑制ALV-J复制的效果提高,说明纳米递送系统对ALV-J具有较好的分布和抑制靶向性。毒理研究表明低于400μg/m L时,对DF-1细胞没有明显毒性作用;体内代谢显示偶联抗体后,纳米药物仍然具有良好的缓释作用,体外抗病毒实验结果表明,在100μg/m L的浓度下,Ab-CS-PPPs NPs可以持续抑制ALV-J的复制,在体外显示出良好的抗病毒效果。最后建立后天感染ALV-J雏鸡模型,肌肉注射CS-PPPs NPs及Ab-CS-PPPs NPs,定期观察各组鸡的临床表现及剖检病理变化,对相关指标检测表明在病毒感染的早期,Ab-CS-PPPs NPs可以持续缓慢的释放,维持稳定的药物浓度,通过药物干预可以显着降低组织的病毒载量并对感染ALV-J雏鸡的生长发育有一定的促进作用。总之,该研究通过对松花粉多糖中的单体多糖及单糖组成进行分离鉴定,研究了其抗ALV-J的活性成分,对其构效关系进行了初步分析;借助静电作用和自组装原理制备了包封率和载药量较高、具有缓释长效作用的松花粉多糖壳聚糖纳米药物;同时以松花粉多糖作为抗病毒模型药物,构建了基于抗体靶向的纳米药物递送系统,进一步提高了松花粉多糖抗ALV-J活性,为ALV-J的防治提供了新的思路和方法,同时为其它靶向抗病毒药物的研制及评价提供了参考。
崔玉梅[2]（2021）在《丹参提取物在抗耐药金黄色葡萄球菌感染中的应用》文中研究指明金黄色葡萄球菌是临床细菌感染性疾病和畜牧养殖过程中的主要致病菌之一,其感染后一般表现出发病快和病程短等急性感染症状。近年来,金黄色葡萄球菌的耐药性越来越严重,临床上已经出现了多重耐药金黄色葡萄球菌感染病例。其已对临床上常见的抗生素包括氨基糖苷类、β-内酰胺类、大环内脂类和喹诺酮类等产生了不同程度的耐药性,其中对青霉素类和头孢菌素类的耐药程度更深和范围更广。耐药金黄色葡萄球菌的分离率在畜禽体内及其相关环境中较高,如在奶牛乳房炎致病菌和泌尿系统相关致病菌中,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌占有重要地位。因此,针对畜牧养殖过程中出现的金黄色葡萄球菌感染预防和治疗的相关研究意义重大。在防控细菌感染过程中,掌握细菌致病性和耐药性同样至关重要。在金黄色葡萄球菌感染后期或其进入生长后期主要表达如成孔毒素、超抗原外毒素和细胞毒性酶等破坏宿主细胞获取营养物质或干扰宿主免疫细胞功能的分泌型毒力因子。针对细菌主要毒力因子Hla进行有效抑制可有效缓解金黄色葡萄球菌对机体组织细胞造成损伤。这一抗毒力策略已得到科研人员广泛认可和深入研究。本研究通过筛选发现丹参提取物可有效提高氨基糖苷类和β-内酰胺类等抗生素的体外抗菌活性,同时可显着抑制金黄色葡萄球菌Hla的生物学活性。因此,本研究首先针对丹参进行提取工艺研究,通过超声提取法、单因素考察及正交试验法优选了最佳提取工艺,即用20倍量80%乙醇提取3次,每次1.5 h。通过对丹参中隐丹参酮提取工艺的摸索和优化,初步得到了丹参提取物,其主要成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量分别为0.33%、0.05%、0.44%和9.02%。本研究通过最小抑菌浓度试验、生长曲线试验和时间-杀菌曲线试验等确定了丹参提取物及其有效成分与氨基糖苷类和β-内酰胺类等多种不同抗生素的体外协同抗菌作用。丹参提取物与硫酸庆大霉素、头孢噻吩钠和硫酸多黏菌素B等联合对典型MRSA菌株USA300的协同指数FIC均小于0.5,表明丹参提取物与抗生素的协同抗菌作用具有广谱性。进一步研究确定隐丹参酮或丹酚酸B与硫酸庆大霉素联合具有显着的协同抗菌作用（FIC<0.5）,丹参酮Ⅰ或丹参酮ⅡA与硫酸庆大霉素仅有相加作用或无效。丹参提取物在亚抑菌浓度条件下对金黄色葡萄球菌的体外生长无显着影响,与单独药物处理相比,1/4×MIC的硫酸庆大霉素和丹参提取物联合后10 h之内可将处理孔中的受试菌全部杀死。通过溶血试验、荧光定量PCR试验、蛋白免疫印迹分析和细胞毒性检测等试验确定了丹参提取物可有效抑制Hla的溶血活性和保护细胞损伤作用。结果表明,丹参提取物浓度为8μg/m L及以上时可显着抑制金黄色葡萄球菌培养物上清中Hla和原核表达的重组Hla的溶血活性作用。其主要成分隐丹参酮浓度在2μg/m L时可显着抑制Hla的溶血活性。活死细胞染色试验和LDH试验结果显示当丹参提取物浓度达到128μg/m L时,对金黄色葡萄球菌介导的细胞损伤具有保护作用。本研究在对丹参提取物有效成分全面分析和对主要辅料进行筛选的基础上,参考上市的类似产品的处方组成制备了丹参提取物注射液,最终确定以丹参提取物为主成分,亚硫酸钠为抗氧化剂,苯甲醇为抑菌剂,聚山梨酯-80为增溶剂,成功制成了丹参提取物注射液。并对丹参提取物注射液进行了初步的药效学和毒理学考察。结果显示,丹参提取物注射液具有一定的治疗效果,丹参提取物注射液与硫酸庆大霉素联合后治疗效果更佳,可显着缓解感染小鼠肺组织病理变化,降低肺组织中的菌落定殖以及改善肺组织的炎症程度。小鼠急性毒性试验结果显示,丹参提取物注射给予小鼠腹腔注射5400 mg/kg仍未出现任何动物死亡,处死小鼠并解剖未发现明显的眼观病理变化,说明丹参提取物注射液具有良好的安全性。进一步通过建立金黄色葡萄球菌蛋雏鸡人工感染模型,对丹参提取物注射液与硫酸庆大霉素注射液联合治疗效果进行评价。研究结果表明,丹参提取物注射液中剂量（0.4 m L/kg）和高剂量（0.8 m L/kg）可显着提高硫酸庆大霉素注射液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染蛋雏鸡的治疗效果。为后续开展扩大临床试验和靶动物安全性试验奠定前期试验基础。综上所述,丹参提取物在治疗金黄色葡萄球菌感染中具有重要作用,其可显着提高主要抗生素的抗菌作用,同时降低金黄色葡萄球菌的致病力。初步获得的丹参提取物注射液具有显着的治疗效果,且毒性低。
周永林[3]（2021）在《齐墩果酸抑制β-内酰胺酶和细菌性溶血素活性作用及其机制研究》文中提出近年来抗菌药物在畜牧养殖过程中的广泛应用与细菌耐药性形成已成恶性循环,同时诱导和加速多种耐药菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现和流行,导致抗生素治疗日趋无效。金黄色葡萄球菌是兽医临床上重要的病原菌,可导致乳房炎和肺炎等多种疾病,严重威胁畜禽养殖业的发展。金黄色葡萄球菌可通过分泌β-内酰胺酶对β-内酰胺类抗生素产生抗性,舒巴坦等竞争性酶抑制剂对B类金属β-内酰胺酶抑制作用差,而MRSA如USA300携带多种金属β-内酰胺酶,这使得耐药金黄色葡萄球菌感染的防控难度加大。此外,在NDM-1耐药酶未报道之前,碳青霉烯类抗生素一直被用于治疗临床上严重耐药肠杆菌的感染。然而,随着NDMs和KPCs等碳青霉烯酶的出现和广泛传播,导致所有β-内酰胺类抗生素在碳青霉烯酶阳性菌感染后治疗无效。而且临床上已经出现同时携带ndm和mcr基因的大肠杆菌等革兰氏阴性菌。因此,临床上迫切需要研发广谱β-内酰胺酶抑制剂协同抗菌药物以控制携带β-内酰胺酶耐药菌尤其耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染。细菌性溶血素是细菌在致病过程中所分泌的一类重要毒力蛋白,常见的细菌性溶血素包括金黄色葡萄球菌溶血素Hla,李斯特菌溶血素LLO、肺炎链球菌溶血素PLY和猪链球菌溶血素SLY等。细菌性溶血素可裂解组织细胞和协助细菌逃避机体免疫攻击和获取营养,在细菌感染建立过程中发挥着不可或缺的作用。如金黄色葡萄球菌溶血素敲除菌株在细菌性肺炎、乳房炎和肾炎等模型中毒力显着减弱,甚至缺失。因此,以细菌性溶血素为药物靶点进行抑制剂筛选是抑制细菌致病性的一种有效策略。综上,筛选获得一种可同时抑制耐药酶和毒力因子的天然化合物,这将可能极大的提高耐药致病菌感染的治疗效果,同时减少开发药物的成本。本研究最初的目标是通过酶活性抑制试验从天然化合物中筛选出一种可抑制金黄色葡萄球菌携带的β-内酰胺酶活性的抑制剂。经筛选发现,齐墩果酸可显着抑制金黄色葡萄球菌携带的β-内酰胺酶的水解活性,同时对主要碳青霉烯酶如NDM-1、KPC-2和VIM-1也有显着的抑制作用,而对头孢菌素酶Amp C和超广谱β-内酰胺酶的抑制作用不显着。此外,加入不同金属离子进行酶活性抑制试验发现,齐墩果酸仅在锌离子存在的缓冲液中对NDM-1的抑制作用受到影响,在其它金属离子存在的缓冲液中无显着影响,提示齐墩果酸并非特异性金属离子螯合剂。本研究进一步通过棋盘法最小抑菌浓度试验、生长曲线试验、时间-杀菌曲线试验和细菌染色试验等验证了齐墩果酸及其类似物可显着增强β-内酰胺类抗生素对β-内酰胺酶阳性金黄色葡萄球菌和碳青霉烯酶阳性肠杆菌的抗菌作用（FIC≤0.33±0.07）,而舒巴坦仅对金黄色葡萄球菌与β-内酰胺类抗生素具有显着的协同效果,而与美罗培南联合对NDM-1阳性大肠杆菌无显着的协同效果。齐墩果酸在远大于32μg/m L浓度条件下对受试菌株的生长无显着影响。此外,本研究结果显示,齐墩果酸单独使用不会诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300和NDM-1阳性大肠杆菌ZJ487对β-内酰胺类抗生素产生耐药性,而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300在β-内酰胺类抗生素压力下可产生严重的耐药性。为确定齐墩果酸联合β-内酰胺类抗生素的体内协同效果,本研究建立了小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染肺炎模型,通过小鼠存活率、肺组织菌落定殖、肺组织β-内酰胺酶活性检测、靶器官病理变化和炎症反应等指标评价齐墩果酸与β-内酰胺类抗生素的体内协同效果。与单独青霉素G钠治疗相比,齐墩果酸联合青霉素G钠治疗后金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率提高50.0%,而舒巴坦联合青霉素G钠治疗后的存活率提高37.5%,略差于齐墩果酸联合组。此外,单独齐墩果酸对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有一定的治疗效果,这提示齐墩果酸在针对金黄色葡萄球菌感染过程还具有其它药理学作用,我们推测其可能抑制了金黄色葡萄球菌致病相关毒力因子。为验证上述推测,本研究通过溶血试验和细胞保护试验等进行了验证,结果显示齐墩果酸及其类似物在4μg/m L浓度条件下可显着抑制多种不同的细菌性溶血素的溶红细胞活性,齐墩果酸可显着降低MH-S细胞和A549细胞由金黄色葡萄球菌溶血素Hla介导的损伤。这一结果进一步证实了齐墩果酸单独使用可降低耐药金黄色葡萄球菌的致病性从而发挥保护作用。本研究通过酶活性抑制试验、溶血试验、荧光定量PCR试验、蛋白免疫印迹试验、分子动力学模拟、氨基酸定点突变和荧光淬灭等试验确定了齐墩果酸不影响金黄色葡萄球菌携带的β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶以及金黄色葡萄球菌溶血素Hla蛋白的分泌和表达,而是与NDM-1蛋白和Hla蛋白通过范德华力直接结合发挥抑制作用。进一步通过对突变子蛋白进行酶活性抑制试验、溶血试验和突变子菌株最小抑菌浓度检测试验确证了分子动力学模拟结果的可靠性。综上所述,作为β-内酰胺酶和细菌性溶血素双靶标抑制剂,齐墩果酸可显着降低由细菌性溶血素对机体造成的损伤和显着恢复β-内酰胺类抗生素的体内外抗菌活性。为基于抑制细菌致病性和耐药性的双靶标抗耐药致病菌感染新药研发奠定了良好的前期试验基础和提供了先导化合物。
王文平[4]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中进行了进一步梳理研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
刘丹[5]（2020）在《多肽提取物对鸡抗氧化、调节免疫及抗球虫感染的研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病作为集约化养殖中最常见的禽类疾病,对禽类养殖业危害极大,造成严重的经济损失,目前人们主要采用西药抗生素、免疫疫苗等方法防治鸡球虫病,但鸡球虫对抗生素的耐药性大,且存在药物残留风险,而免疫疫苗的研发成本高、难度大。研究表明,无化学危害、无药物残留的中药提取物,有望作为药物预防和治疗球虫病。据报道,地鳖和蛴螬肽提取物均具有良好的抗氧化和免疫调节作用。当前将中药提取物作为饲料添加剂,通过增强机体抗氧化应激及提高调节机体免疫功能增强鸡对球虫感染的危害,从而防治和缓解鸡球病成为研究热点。本研究依据地鳖肽抗氧化和蛴螬肽免疫调节作用,将其联合应用探讨多肽提取物对艾美耳球虫感染的肉仔鸡生产性能、抗氧化、免疫调节和抗球虫感染的作用,从营养调控角度来提高在受到应激时家禽的免疫功能。试验一:探讨多肽提取物（地鳖肽和蛴螬肽联合）的体外抗氧化效果。测定多肽提取物的清除自由基能力,抗氧化剂还原能力和抑制脂质过氧化反应能力发现,结果1:1比例组合的多肽提取物对O2-、-DPPH自由基清除作用最强、抗氧化活性接近于阳性药对照组且MDA含量降低。结果表明多肽提取物能清除自由基,抑制脂质过氧化反应,降低自氧化反应,呈现良好体外抗氧化作用。试验二:探讨地鳖肽和蛴螬肽组合的多肽提取物的体外免疫调节作用的效果。采用MTT法测定鸡外周血淋巴细胞转化率和小鼠巨噬细胞（RAW264.7）活力,中性红法和流式细胞术对RAW264.7细胞的吞噬能力进行检测。结果1:1比例组合多肽提取物组鸡外周血淋巴细胞转化率和RAW264.7细胞相对活力最高（分别达到73%和98%）,RAW264.7细胞吞噬能力最强。结果表明多肽提取物能够提高鸡淋巴细胞转化和巨噬细胞吞噬能力,呈现一定免疫调节作用。实验三:探讨地鳖肽和蛴螬肽组合的多肽提取物对艾美耳球虫感染肉仔鸡的生产性能、抗球虫效果、免疫功能、抗氧化功能及肉品质的影响。取1日龄健康肉仔鸡随机分6组,空白组和红对照组鸡饲喂基础日粮,盐霉素组鸡饲喂基础日粮及添加盐霉素（60mg/kg）,地鳖肽组鸡饲喂基础日粮及添加地鳖肽（1OOmg/kg）、蛴螬肽组鸡饲喂基础日粮及添加蛴螬肽（100mg/kg）,联合肽组鸡饲喂基础日粮及添加地鳖肽（100mg/kg）和蛴螬肽（100mg/kg）;14日龄时除空白组外,所有肉仔鸡攻毒柔嫩艾美耳球虫卵囊5×103/只,分别测定肉仔鸡于21日龄和42日龄时鸡生长性能（日增重、采食量、料重比）、免疫器官指数（肝脏、胸腺和法氏囊）、血液生化和抗氧化及免疫功能指标。结果肉仔鸡生长性能差异不显着:鸡感染球虫第7日,联合肽组比红对照组肠道损伤显着降低;鸡感染球虫第4-7日,红对照组鸡排出卵囊数达到约11.95×104个,而联合肽组鸡排出卵囊数显着低于红对照组;红对照组抗球虫指数（ACl）仅为126.44左右,联合肽组ACI为159.79;联合肽组与红对照组相比鸡免疫器官指数均极显着升高;联合肽组与红对照组比42日龄肉仔鸡胸部和腿部肌肉滴水损失均显着下降,肉的颜色红度值（a*）明显升高而亮度值（L*）明显降低,黄度值（b*）差异不显着;联合肽组与红对照组比较21日龄肉仔鸡血清ALP活性均显着降低,TP浓度均显着升高,ALB差异不明显;42d肉仔鸡ALT活性显着降低,ALP和TP无显着差异,ALB浓度显着升高。联合肽组与红对照组比较肉仔鸡血清中抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）活力均极显着升高,MDA含量极显着降低;联合肽组与红对照组比较仔鸡肠道绒毛高度明显升高、隐窝深度显着变浅,绒毛高度与隐窝深度比值极显着增大;联合肽组肉仔鸡血液T和B淋巴细胞转化显着高于红对照组。结果表明多肽提取物可显着降低卵囊排出呈现一定抗球虫效果,提高感染柔嫩艾美耳球虫肉仔鸡的抗氧化功能和调节免疫功能,改善肉品质。综上所述,地鳖肽和蛴螬肽具有一定的体外抗氧化和免疫调节作用,将其联合应用添加到肉仔鸡日粮中通过营养调控,改善感染球虫肉仔鸡的肉品质,提高鸡抗氧化应激和增强机体调节免疫功能,改善仔鸡肠黏膜损伤,对球虫感染鸡起到一定的缓解作用。
叶进燕[6]（2019）在《橙皮素通过靶向髓样分化蛋白2对脂多糖诱导的急性肺损伤的保护作用》文中指出第一部分:橙皮素对体外脂多糖诱导的炎症因子变化的影响目的:研究橙皮素（hesperetin,HES）对体外脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的炎症因子变化的影响。方法:体外培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW 264.7）及人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）,将两种细胞均分为空白对照组（CON组）、脂多糖组（LPS组）、脂多糖+橙皮素（10μM与40μM）预处理组（LPS+HES（10μM）组和LPS+HES（40μM）组）。其中,LPS+HES（10μM）组及LPS+HES（40μM）组分别用终浓度为10μM和40μM的HES预处理RAW264.7和BEAS-2B细胞2小时后,再加入LPS刺激24小时,通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法,测定不同浓度下HES对LPS诱导的炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）与白介素-6（interlukin-6,IL-6）蛋白表达水平的改变情况;同样,LPS+HES（10μM）组及LPS+HES（40μM）组分别用终浓度为10μM和40μM的HES预处理RAW264.7和BEAS-2B细胞2小时后,再加入LPS刺激6小时,用实时荧光定量反转录酶-聚合酶链锁反应（Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-q PCR）检测不同浓度下HES对LPS诱导体外炎症因子TNF-α和IL-6的m RNA表达水平改变情况。结果:在RAW264.7与BEAS-2B两种细胞中,与CON组相比,LPS组强烈诱导TNF-α和IL-6的m RNA表达水平（P<0.01）与蛋白水平（P<0.01）,利用10μM或40μM-HES预处理后可显着抑制两种炎症因子的m RNA表达（P<0.01）与蛋白水平（P<0.01）,但相比10μM,40μM的HES预处理后会具有更良好的抗炎作用。结论:HES可以抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α和IL-6表达水平,并且其抑制活性具有良好的剂量相关性。第二部分:橙皮素对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤保护作用目的:研究橙皮素（HES）对脂多糖（LPS）诱导小鼠急性肺损伤（acute lung injury,ALI）的保护作用。方法:选C57BL/6雄鼠28只,体重22±2克,随机分为空白对照组（CON组）、脂多糖组（LPS组）、脂多糖+橙皮素（25 mg/kg）预处理组（LPS+HES（25 mg/kg）组）及脂多糖+橙皮素（50 mg/kg）预处理组（LPS+HES（50 mg/kg）组）,每组7只。LPS+HES（25 mg/kg）组及LPS+HES（50 mg/kg）组用浓度分别为25 mg/kg和50 mg/kg的HES提前一周每天灌胃小鼠。造模6h后,收集血清、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）与肺组织。通过HE染色观察肺组织病理学变化;采用Bradford蛋白检测试剂盒检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白浓度;用标准血细胞计数器测定支气管BALF中的总细胞计数;用髓过氧化物酶检测试剂盒测定均同质化的肺组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）的活性;采用ELISA法测定BALF和血清中TNF-α,IL-6的表达水平,并用RT-q PCR分析肺组织中TNF-α,IL-6的m RNA表达水平。结果:与CON组小鼠相比,LPS组小鼠肺间质和肺泡间隙被大量炎性细胞浸润、肺泡完整性被破坏、肺泡壁增厚以及肺泡腔充血,同时,用25 mg/kg及50 mg/kg的HES预处理后,LPS诱导的肺组织病理损伤均显着减弱（P<0.01）、小鼠肺水肿情况也明显缓解（P<0.01）;急性肺损伤小鼠中LPS会造成细胞损伤,引起BALF中总蛋白浓度升高、中性粒细胞数增加,而HES有助于降低BALF中的总蛋白浓度、降低中性粒细胞数量（P<0.05）,从而有助于保护肺组织并且发挥抗炎作用;此外,HES降低了由LPS造成的肺组织高水平MPO（P<0.05）;同时,HES也可以明显缓解LPS诱导肺组织、血清与BALF中炎症因子TNF-α、IL-6过量表达,并且,高剂量HES（50 mg/kg）预处理效果显着优于低剂量预处理HES（25 mg/kg）（P<0.05）。结论:HES通过减轻肺水肿程度、降低MPO表达、降低BALF中总蛋白浓度、总细胞数与中性粒细胞数,抑制促炎因子释放等,对LPS诱导的小鼠急性肺损伤发挥保护作用。第三部分:橙皮素对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠的保护机制目的:研究橙皮素（HES）是否通过与髓样分化蛋白2（Myeloid differentiation,MD2）结合,抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）和NF-κB信号通路激活,从而抑制脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）而发挥保护作用。方法:通过Le Dock分子对接软件预测探索HES和MD2之间的结合模式,通过蛋白质印迹法检测MAPK和NF-κB信号通路的相关蛋白的表达,并通过免疫共沉淀技术检测HES是否能抑制MD2和Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）复合。结果:Le Dock分子对接软件显示HES与MD2上的LPS结合位点重叠,免疫共沉淀实验证明HES可以阻断LPS诱导的MD2与TLR4复合。同时,LPS诱导MAPKs通路p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-P38/P38激活（P<0.05）,促进IκB降解,而HES可以显着抑制MAPKs的磷酸化、阻断IκB降解过程（P<0.01）,并且50mg/kg-HES抑制活性大于25mg-HES。结论:HES能直接与MD2结合,阻断LPS诱导的MD2和TLR4结合,从而抑制MAPKs的激活与保护IκB不被降解,最终发挥对LPS诱导ALI小鼠的保护作用。
黄蒙蒙[7]（2019）在《丙烯酰胺对斑马鱼胚胎心脏发育毒性的分子毒理学效应及Notch信号通路激活机制》文中研究指明2002年,瑞典科学家在富含碳水化合物的热加工食品中首次发现高含量的丙烯酰胺,由此引发的食品安全问题备受国际关注。丙烯酰胺及其一级代谢产物环氧丙酰胺可以血红蛋白结合物的形式通过胎盘屏障进入胎儿体内,其发育毒性已在欧洲大型母婴队列研究中得以证实。此外,本课题组前期人群队列研究表明,丙烯酰胺的体内暴露水平与心血管疾病的发生率和死亡率呈显着正相关性。心脏是脊椎动物最早形成并发挥功能的器官,特别是早于解毒器官肝脏。因此,本文以斑马鱼胚胎为模型,从急性和亚慢性角度探究丙烯酰胺心脏发育毒性及其致毒机制。主要研究结果如下:首先,丙烯酰胺急性暴露对斑马鱼胚胎具有明显的致死致畸作用,且呈剂量依赖和时间依赖关系。受精后的斑马鱼胚胎暴露于丙烯酰胺72和96小时的半致死剂量(LC50)分别为2.7 mM和2.2 mM,主要表型为心包水肿、心率缓慢、心脏线性化、体长减小和鱼鳔无法发育等。毒性敏感性评估研究表明,发育早期阶段暴露丙烯酰胺,胚胎心脏的畸形表型最为显着。活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和谷胱甘肽硫转移酶（GST）活性等氧化还原指标观测发现,2.0 mM丙烯酰胺暴露组胚胎出现明显的氧化损伤,且活性氧探针染色和油红O染色结果发现,心脏区域出现大量阳性染色信号,而低于2.0 mM暴露组胚胎与对照组相比并无明显差异。该结果意味着氧化损伤可能是高剂量丙烯酰胺的致毒途径,心脏可能是丙烯酰胺致发育毒性的靶器官。其次,丙烯酰胺急性暴露对斑马鱼胚胎具有明确的心脏发育毒性。2.0 mM丙烯酰胺暴露后,胚胎心脏静脉窦-动脉球间距显着变大、心室横截面积和心室容积显着减小;而在功能上,心率、心室收缩分数和红细胞流速均显着下降。整胚原位杂交和定量PCR观测发现,丙烯酰胺暴露导致心管环化不全,腔室膨胀异常;心脏房室发育中心肌蛋白myl7、vmhc和myh6基因表达下调;房室通道分化中bmp4、notch1b和tbx2b基因限制性表达的功能部分或完全丧失;房室瓣膜形成过程中has2、klf2a和nfatc1基因异位表达;心脏疾病相关标志基因nppa和nppb异位高表达,而tnnc1a显着下降。上述结果意味着丙烯酰胺急性暴露抑制房室心肌蛋白的形成、房室通道的分化和瓣膜发育,并出现病理性特征。此外,中胚层心脏前体标志物nkx2.5表达下调,暗示了丙烯酰胺急性暴露对心脏发育的影响可能始于心脏前体时期。第三,丙烯酰胺急性暴露抑制心脏发育过程中细胞的增殖和分化。丙烯酰胺暴露后显着降低了心肌细胞和心内膜细胞的数目。通过增殖标志物PH3免疫荧光和TUNEL凋亡等观测发现,丙烯酰胺并不影响心脏发育过程中细胞凋亡水平,但显着抑制其有丝分裂,这是导致细胞数目减少的可能原因。丙烯酰胺并不影响心脏腔室心肌细胞的特异性分化,但显着抑制房室通道处心内膜细胞从上皮细胞向间质细胞转变的过程。此外,丙烯酰胺暴露导致发育早期心肌和心内膜之间的物理间隙增加,二者之间交错信号（crosstalk）减少,随着暴露时间的延长,心室心肌层和心内膜明显增厚,暗示心脏成熟期发育可能出现异常。第四,丙烯酰胺亚慢性暴露对心脏早期发育过程中的形态和功能虽无明显影响,但显着影响心脏成熟过程中的形态发生和收缩功能。通过Notch信号荧光报告转基因鱼系Tg（TP1:d2GFP）发现,0.5 mM和1.0 mM丙烯酰胺暴露导致心脏发育早期心内膜Notch信号部分失去瞬时动态活性,进而持续高表达至肌小梁形成早期,而心肌层Notch信号在肌小梁形成后期持续高表达,最终导致肌小梁芽增生和无法迁移。通过Notch信号抑制剂DAPT对心内膜Notch信号进行不完全抑制后,新生的肌小梁正常发育并向腔室内部延伸,从而起到拯救效果。以上结果表明,丙烯酰胺亚慢性暴露影响心脏发育早期阶段心内膜失去部分活性,无法实现Notch信号限制性表达,进而导致后期肌小梁过度增殖,而成熟后期心肌Notch信号的高表达属于应激反应。第五,丙烯酰胺亚慢性暴露引起心室壁肌小梁增生且无法迁移而堆积于心室壁,可能原因为:（1）经1.0 mM丙烯酰胺暴露后,Notch下游通路中erbb2在肌小梁形成早期显着上调,而nrg2a在肌小梁形成过程中显着上调,这是肌小梁增生的可能原因;（2）受Erbb2信号调控的N-cadherin蛋白大量聚集且无法重排,大大增加了心肌细胞之间的粘附性,是导致新生肌小梁无法迁移而堆积于心室壁的可能原因;（3）心肌细胞能量代谢和收缩运动所需的线粒体和肌原纤维结构异常,是导致成熟期心室收缩功能下降的可能原因。此外,丙烯酰胺亚慢性暴露可致心脏早期发育关键特异性转录因子nkx2.5和hand2等在心室成熟期高表达,可能为斑马鱼心脏损伤后的特有再生应激反应。综上所述,本研究以斑马鱼胚胎为模型,从毒理学效应、细胞生物学机制以及分子机制等层面系统研究丙烯酰胺急性暴露和亚慢性暴露后对心脏发育的影响及其致毒机理,相关研究成果为完善食品加工污染物发育毒性和毒理学效应评价体系提供科学依据,对于我国食品化学安全危害因素的循证和溯源研究具有重要意义。
黄德玉[8]（2019）在《T-2毒素诱导的细胞线粒体毒性作用研究》文中提出T-2毒素是由镰刀菌（Fusarium）产生的一种次级代谢产物,也是A类单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种。T-2毒素在自然界中分布非常广泛,在田间生长的作物如大麦、小麦、燕麦、黑麦和玉米,以及储存的谷物都是T-2毒素的污染对象。动物在摄入污染了T-2毒素的饲料后能引起多种毒性作用,肠道和肝脏对T-2毒素尤其敏感。T-2毒素能够降低动物的食欲和增重,引起严重的经济损失。T-2毒素还可能通过食物链进入人们的餐桌,因此对动物和食品动物消费者的健康都具有较大的威胁。T-2毒素对食品动物的一个重要毒性作用是生长抑制效应。动物在长期低剂量摄入T-2毒素污染的饲料后会引起慢性毒性作用,包括食欲不振、生长发育迟缓、体重降低等,并导致动物饲料利用率明显降低,给养殖业带来巨大的经济损失。虽然目前对T-2毒素引起的动物生长抑制有一定的研究,但总的来说,T-2毒素对动物生长抑制的作用机制还不清楚。研究表明T-2毒素可能通过改变大脑中五羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）水平,降低动物的食欲;或者通过抑制动物肠上皮细胞的增殖,损害肠道微绒毛,导致肠道营养吸收受阻。本实验室前期对T-2毒素的生长抑制效应也做了研究,结果表明,T-2毒素对生长激素（Growth hormone,GH）的合成和分泌抑制可能是该毒素导致动物生长抑制的一个重要因素。另外,T-2毒素还能够损伤血脑屏障功能,增加其通透性,从而进入大脑并引起垂体的病理损伤。目前虽然观察到了T-2毒素引起的垂体损伤,但是其中的损伤机制还不清楚。氧化应激是指细胞中线粒体或其他来源的活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）产生过量而不能有效被清除,改变了细胞内氧化还原平衡（倾向于氧化）,引起的一系列氧化损伤。研究表明,T-2毒素能够导致不同细胞中ROS显着增加,并引起氧化应激。由于线粒体呼吸链产生了细胞中超过90%的ROS,T-2毒素引起氧化应激的同时还伴随着线粒体功能损伤。本课题以线粒体功能变化和氧化应激为切入点,选用大鼠垂体前叶GH3细胞为模型（该细胞是研究动物生长抑制的经典细胞模型）,深入研究T-2毒素在GH3细胞上引起的线粒体功能变化和氧化应激发生情况,以及更深层次的,T-2毒素是如何诱导线粒体功能变化。1.T-2毒素诱导GH3细胞线粒体功能变化和氧化应激研究本研究首先通过CCK-8实验确定了T-2毒素在GH3细胞中的IC50约为15.67nM,在确保T-2毒素对细胞产生一定毒性,并保持一定的细胞存活率情况下,分别采用低剂量和高剂量（10和40 nM）T-2毒素孵育GH3细胞24 h,检测细胞内氧化应激和线粒体功能各项参数。结果表明,T-2毒素处理GH3细胞后显着增加细胞内ROS和线粒体超氧自由基含量,ROS不仅消耗了细胞内的还原物谷胱甘肽（GSH）,还增加了DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）含量。T-2毒素在诱导氧化应激的同时,还激活了细胞抗氧化系统,包括增加抗氧化酶超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性,上调编码抗氧化酶的基因GPx-1、SOD-2、CAT、Ucp-1、Ucp-2和Ucp-3的表达水平,其中CAT和Ucp-3的表达水平上调了53倍和86倍,表明T-2毒素显着激活了这些抗氧化基因的表达,来抵抗氧化应激引起的损伤效应。T-2毒素诱导了GH3细胞线粒体结构和功能的诸多变化,包括降低线粒体膜电位（ΔΨm）,增加线粒体DNA（mt-DNA）来源的8-OHdG含量,说明T-2毒素引起了mt-DNA氧化损伤。电镜结果显示,T-2毒素明显诱导细胞形态变化,细胞内出现很多空泡,细胞和细胞核体积缩小。线粒体结构也发生了多种变化,如线粒体基质电子密度增加,有的线粒体嵴已经完全消失并形成空泡化线粒体,有的线粒体发生了肿胀,形成巨型线粒体。这些变化说明T-2毒素对线粒体具有明显的毒性作用,能破坏线粒体膜完整性。T-2毒素还引起GH3细胞凋亡,包括诱导凋亡小体形成,抑制抗凋亡基因Bcl-2表达,增加促凋亡基因Bax、p53和caspase-3、caspase-8表达,表明T-2毒素激活caspase依赖的线粒体凋亡通路来诱导GH3细胞凋亡。本研究结果还表明10 nM和40 nM T-2毒素孵育GH3细胞24 h后,显着增加线粒体ATP水平和呼吸链复合物I活性。T-2毒素也增加了呼吸链中编码铁硫蛋白、黄素蛋白和血红素蛋白的基因表达,以及调控线粒体生物合成的转录/激活因子表达（如PGC-1家族成员、核呼吸因子和线粒体转录因子Tfam、Tfb1m和Tfb2m）,这些变化可能源于T-2毒素诱导线粒体应激反应后的一种线粒体功能补偿效应。2.Ndufs3在T-2毒素诱导的线粒体功能变化中的作用研究本研究在GH3细胞中分别沉默和过表达Ndufs3,再利用40 nM T-2毒素孵育GH3细胞24 h,检测线粒体超氧自由基水平、复合物I活性、线粒体ΔΨm和ATP水平。结果表明,在GH3细胞中沉默Ndufs3能够显着抑制复合物I活性,降低线粒体ΔΨm,也能一定程度增加超氧自由基含量,降低ATP水平;而在加入T-2毒素后,沉默Ndufs3能进一步显着增加超氧自由基产生,降低复合物I活性和线粒体ΔΨm,说明Ndufs3表达缺陷能够引起线粒体功能障碍,也会增加GH3细胞对T-2毒素易感性,使线粒体更容易受到T-2毒素损伤。本研究在GH3细胞中过表达Ndufs3后,利用40 nM T-2毒素孵育细胞24 h,检测线粒体变化。结果表明,过表达Ndufs3后,线粒体复合物I活性、超氧自由基水平、线粒体ΔΨm和ATP水平都没有明显变化;而在加入T-2毒素后,过表达Ndufs3对这些参数也没有明显改变,表明在GH3细胞中过表达Ndufs3后加入T-2毒素处理,并不会对线粒体功能提供明显保护作用。3.核呼吸因子2在T-2毒素诱导线粒体功能变化中的作用研究本研究首先确定T-2毒素孵育GH3细胞0、2、4、6、8和12 h后,NRF-2的亚细胞定位和表达情况,结果表明NRF-2在所有时间点都一直位于细胞核中,这与NRF-2作为转录因子在细胞核发挥作用的属性是相符的。10 nM和40 nM T-2毒素孵育GH3细胞24 h后,NRF-2的基因和蛋白表达水平都显着增加,具有浓度依赖性,表明T-2毒素能够诱导NRF-2表达。本研究通过RNA干扰沉默NRF-2后,利用40 nM T-2毒素孵育24 h,检测线粒体ROS含量、ATP水平、复合物I活性、mt-DNA拷贝数变化,结果表明,在GH3细胞中沉默NRF-2能够一定程度增加ROS含量、降低ATP水平,抑制mt-DNA拷贝数和复合物I活性;沉默NRF-2并加入T-2毒素处理后则能更大程度地增加ROS含量和抑制mt-DNA拷贝数,并逆转T-2毒素诱导的ATP水平和复合物I活性增加,并且具有显着性,这些结果表明NRF-2确实参与调控了T-2毒素诱导的线粒体功能变化,而NRF-2能够促进GH3细胞线粒体功能。通过染色质免疫共沉淀并结合PCR和高通量测序（ChIP-Seq）,本研究确定了NRF-2在GH3细胞中是通过调控下列靶基因来控制线粒体功能。NRF-2能够结合到线粒体转录因子Tfam、Tfb1m和Tfb2m,复合物I铁硫蛋白亚基Ndufs3和Ndufs7,复合物I组装因子Ndufaf1、Ndufaf2和Ndufaf4,复合物IV组装因子COA5,以及其他基因如DNM1L、AR、DIAPH2、DDX55、FGF14、FAT3、NSFL1C、ZSCAN23、MYO3A和PEX5的启动子区。生物信息学分析表明,这些靶基因启动子区都含有NRF-2串联排列的GGAA或TTCC核心结合位点,NRF-2能够结合到这些位点增加靶基因的转录活性。本研究设计了扩增靶基因启动子的引物,对ChIP得到的DNA样品进行PCR和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。对PCR产物跑胶并测序,结果表明,PCR产物跑胶后,NRF-2组都有条带,且条带大小与Input组相同,并且与预期大小一致。测序结果表明,这些扩增片段属于靶基因启动子片段,与预期的扩增片段相符,表明NRF-2确实能够结合到这些靶基因的启动子区。qRT-PCR结果也表明,相对于IgG阴性对照抗体对靶基因位点的富集,NRF-2目的抗体对靶基因启动子位点的富集都有显着性提高,进一步验证了ChIP-Seq结果的可靠性。在GH3细胞中沉默NRF-2后,用40 nM T-2毒素孵育细胞24 h,检测靶基因表达,结果表明,T-2毒素处理GH3细胞后这些靶基因的表达水平都显着增加,但是沉默NRF-2能够显着降低这些靶基因的表达,表明NRF-2确实参与调控了这些基因的表达。4.T-2毒素诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬研究为了深入研究T-2毒素是否能够激活GH3细胞自噬和线粒体自噬,为细胞提供保护作用,本研究首先利用双荧光标记的自噬标志物LC3（mRFP-eGFP-LC3）和mKeima荧光蛋白标记的线粒体（Mito7-mKeima）确定T-2毒素能否诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬。通过腺相关病毒在GH3细胞中稳定表达mRFP-eGFP-LC3蛋白,利用10和40 nM T-2毒素孵育细胞24 h,通过共聚焦显微镜观察细胞自噬。结果表明,T-2毒素处理GH3细胞24 h后,细胞内形成了明显的LC3自噬斑点,而对照组荧光均匀分布于细胞质中,表明T-2毒素能够诱导GH3细胞自噬。40 nM T-2毒素处理细胞后,有的自噬小体已经形成了下一阶段的自噬溶酶体。通过慢病毒在GH3细胞中稳定表达Mito7-mKeima融合蛋白,利用10和40 nM T-2毒素处理细胞24 h,通过荧光显微镜观察线粒体自噬。结果表明,10和40 nM T-2毒素处理细胞后,mKeima蛋白的红色荧光强度明显增加,表明T-2毒素也能够诱导GH3细胞线粒体自噬。电镜结果也显示,T-2毒素处理的GH3细胞中能够观察到膜结构包裹的异常线粒体,可以判断这是T-2毒素处理细胞后形成的线粒体自噬体。为了确定T-2毒素诱导的GH3细胞自噬和线粒体自噬是否依赖于Atg5自噬基因,本研究在GH3细胞中沉默Atg5,利用40 nM T-2毒素孵育GH3细胞24h,检测细胞自噬和线粒体自噬。结果表明,40 nM T-2毒素处理正常GH3细胞后能明显增加LC3自噬斑点,而处理Atg5沉默的细胞后,LC3自噬斑点明显减少。类似地,40 nM T-2毒素处理正常GH3细胞24 h后,mKeima红色荧光明显增强;但是在Atg5沉默细胞中,T-2毒素增强的mKeima红色荧光明显减弱,这些结果表明沉默Atg5可以抑制T-2毒素诱导的GH3细胞自噬和线粒体自噬。本文也利用qRT-PCR和Western Blot检测了自噬蛋白LC3和Atg3和线粒体自噬关键基因Pink1、Parkin和NIX的表达水平。在蛋白水平上,10和40 nM T-2毒素处理GH3细胞24 h后,显着增加Pink1和Parkin蛋白表达。40 nM T-2毒素显着增加LC3-II/LC3-I比值。10 nM T-2毒素也显着增加Atg3蛋白表达。在基因水平上,10 nM T-2毒素处理GH3细胞后没有明显改变Pink1和Parkin表达,但是显着增加了NIX表达,而40 nM T-2毒素都显着增加了这三个基因的表达。在利用10和40 nM T-2毒素孵育GH3细胞24 h后,本研究检测cAMP-PKA-CREB信号通路激活,结果表明,10和40 nM T-2毒素处理GH3细胞后显着增加了cAMP水平和PKA激酶活性;而用PKA激酶抑制剂H89预处理细胞后能够显着抑制PKA活性增加。40 nM T-2毒素显着增加总CREB水平,10和40 nM T-2毒素都显着增加磷酸化CREB（p-CREB）水平,但是H89也抑制了CREB和p-CREB蛋白表达的增加。这些结果表明在GH3细胞中,T-2毒素能增加cAMP水平,cAMP进一步活化PKA,进而磷酸化CREB形成p-CREB,激活cAMP-PKA-CREB信号通路。在GH3细胞中沉默Nrf2后用40 nM T-2毒素处理细胞24 h,检测Pink1的表达,结果表明,沉默Nrf2后能显着降低T-2毒素诱导的Pink1表达增加。同时用H89预处理细胞后能够显着降低Nrf2和Pink1表达,说明PKA激酶能够调控Nrf2表达,而Nrf2又能够调控下游的Pink1,表明cAMP-PKA-CREB-Nrf2-Pink1这条信号通路在GH3细胞中能够调控线粒体自噬。为了确定线粒体自噬是否能够保护GH3细胞线粒体功能,并降低T-2毒素诱导的细胞凋亡。本研究在GH3细胞中沉默线粒体自噬基因Pink1和NIX来抑制线粒体自噬活性,然后用T-2毒素处理细胞,检测线粒体融合与分裂基因Drp-1、Fis-1和Mfn-1表达、线粒体ATP水平和细胞凋亡。结果表明,10和40 nM T-2毒素孵育细胞24 h后,Drp-1、Fis-1和Mfn-1基因表达都呈浓度依赖性增加,ATP水平也显着增加,并诱导了细胞凋亡。但是,在GH3细胞中沉默Pink1或NIX,或同时沉默Pink1和NIX都能显着降低T-2毒素诱导的Drp-1、Fis-1和Mfn-1基因上调和ATP增加,并显着增加T-2毒素诱导的细胞凋亡,说明抑制线粒体自噬能够抑制线粒体融合与分裂活动和线粒体能量产生,也能促进细胞死亡。综上所述,本文研究了T-2毒素在GH3细胞诱导的线粒体氧化应激、线粒体结构和功能变化、呼吸链核心铁硫蛋白亚基Ndufs3和线粒体生物合成调控因子NRF-2在T-2毒素引起的线粒体功能变化中的作用、T-2毒素诱导的GH3细胞自噬和线粒体自噬以及线粒体自噬在线粒体功能和细胞存活中的作用。本文从线粒体的角度,为T-2毒素引起的动物生长抑制的分子机制提供了新的依据。
高修歌[9]（2018）在《马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性及毒性机制的研究》文中研究表明马度米星铵（maduramicin）是聚醚类抗生素的一种,因其具有抗球虫谱广、效价高、用量少、价格低廉、促进增重且球虫不易产生耐药性等诸多优点,广泛用于防治肉鸡球虫病。但其安全范围极窄,推荐剂量与中毒剂量非常接近,常导致靶动物肉鸡及非靶动物猪、牛、羊、兔和人的中毒,心肌和骨骼肌是其毒性损伤的靶器官,现有研究多见于中毒案例报道和临床病理组织学观察,其引起心肌和骨骼肌毒性损伤的机制尚不清楚,探究马度米星铵如何引起鸡心肌的损伤将为防控马度米星铵导致的肉鸡心脏毒性提供理论支撑,为促进该类药物的合理使用提供参考依据。为此,本文以鸡原代心肌细胞为体外研究模型,首先采用转录组学分析马度米星铵引起的差异表达基因,进一步利用生物信息学分析预测其毒性机制,细胞炎症反应、细胞凋亡、离子紊乱及胞浆空泡化可能是其主要机制,然后对预测机制进行了试验确证,进而阐明了马度米星铵通过巨泡式死亡和细胞凋亡引起鸡原代心肌细胞的严重损伤。主要研究内容如下:1.马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性的转录组学分析为系统揭示马度米星铵引起的鸡心肌毒性机制,本章以鸡原代心肌细胞为体外模型,采用RNA-seq在转录水平解析马度米星铵对鸡心肌细胞转录谱的影响,结合生物信息学分析预测其毒性机制。分别以0、0.05、0.1、0.5、1和5 μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24、48和72 h,CCK-8法测定细胞毒性,筛选最佳曝露方案用于RNA-seq分析;0和5μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h,提取总RNA,在Illumina Hiseq 4000平台进行测序,对原始数据进行过滤得到有效数据,与参考基因组进行比对,并采用FPKM法计算基因表达量;筛选差异表达基因并采用RT-qPCR进行验证,利用GO数据库对差异表达基因进行富集分析,采用KEGG数据库对差异基因进行功能注释。结果显示RNA-seq产生足够的高质量有效数据,与空白对照组比较,5 μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h共产生1442个显着差异基因,其中810条基因上调表达,632条基因下调表达;RT-qPCR证明RNA-seq所得差异表达基因准确可靠;GO富集结果显示差异基因主要富集到细胞质、能量代谢及胞浆内物质转运等多条生物功能条目;KEGG注释结果表明差异表达基因主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞凋亡、钙离子信号通路及胞浆内空泡形成有关。结果提示,马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性作用可能主要涉及炎症反应、细胞凋亡、胞浆内离子紊乱等多条代谢途径的调控。2.转录组学分析结果的验证为进一步确定马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性的作用机制,本章重点验证RNA-seq和生物信息学分析结果的准确性,开展了一系列验证性试验阐释马度米星铵引起鸡心肌细胞死亡的发生机制。分离培养鸡原代心肌细胞,0～5μg/mL马度米星铵处理细胞12～24 h后,采用ELISA、流式细胞术、Western blot、比色法、透射电子显微镜等方法分析相关炎症因子释放、细胞凋亡、凋亡蛋白表达、胞浆Ca2+水平、Na+-K+/Ca2+-ATP酶活性和胞浆空泡化。结果显示:马度米星铵可以显着提高鸡心肌细胞促炎因子TNF-α和IL-8的释放（P<0.05）,马度米星铵呈浓度依赖性的增加细胞凋亡率（P<0.05）,并显着提高caspase-3的活性（P<0.05）。胞浆内Ca2+水平及心肌细胞Ca2+-ATP酶活性显着增加（P<0.01）,胞浆内过量的Ca2+来源于内质网钙库及胞外介质。马度米星铵导致鸡心肌细胞内空泡增加,空泡呈透明、单层膜、大小不一、基本不含胞浆内容物等特征。以上结果说明:炎症反应、细胞凋亡、胞内离子紊乱及胞浆空泡化共同介导马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性损伤。3.马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞凋亡的机制为探究细胞凋亡在马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞毒性中的作用,阐述细胞凋亡发生的机制。本章以原代培养的鸡心肌细胞为体外模型,20 μM的z-VAD-fmk和500 mM的NAC预处理细胞1 h后,不同浓度的马度米星铵（0、0.05、0.5和5μg/mL）处理细胞24～72 h,显微镜观察细胞形态改变;MTT法分析细胞活性;DAPI染色观察细胞核形态;Annexin V-FITC/PI染色后采用流式细胞仪检测凋亡率;RT-qPCR分析凋亡基因变化;比色法检测凋亡蛋白活性;JC-1染色后经流式细胞仪和荧光显微镜分析线粒体膜电位变化;DCFH-DA染色后荧光显微镜观察ROS改变;比色法测定胞内GSH的含量。结果显示:不同浓度的马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h,细胞损伤严重且细胞活性下降显着（P<0.05）。马度米星铵诱导细胞凋亡率升高,同时caspase-3/8/9基因和蛋白表达水平显着上调（P<0.05）。细胞内线粒体膜电位显着降低（P<0.05）。细胞内ROS水平显着升高,GSH水平显着下降（P<0.05）。z-VAD-fmk预处理可在一定程度削弱马度米星铵诱导的细胞凋亡及鸡心肌细胞毒性。NAC预处理未能减弱马度米星铵引起的细胞凋亡但可降低细胞毒性。综上所述,caspase依赖和非依赖的细胞凋亡途径参与了马度米星铵诱导的鸡心肌细胞死亡,氧化应激加剧了马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性,抑制细胞凋亡和ROS产生一定程度上可削弱马度米星铵诱导的心肌细胞毒性。4.马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞发生巨泡式死亡的机制非caspase依赖的细胞死亡方式存在于马度米星铵诱导的鸡心肌细胞毒性作用中,本章进一步解析马度米星铵诱导非凋亡性细胞死亡的形态学特征和分子机制,以期阐明马度米星铵致心肌细胞损伤的机制。以鸡原代心肌细胞为体外研究模型,0、0.05、0.5和5 μg/mL的马度米星铵处理鸡心肌细胞12～72 h,光学显微镜观察胞浆内空泡形态学特征,透射电子显微镜观察空泡的超微结构;以5 μg/mL的马度米星铵处理鸡心肌细胞12 h,采用激光共聚焦显微镜连续观察心肌细胞内空泡形成的规律;以Dextran 488-FITC、ER Tracker、Mito Tracker、Lyso Tracker等荧光探针染色马度米星铵处理12 h的鸡心肌细胞,激光共聚焦显微镜分析胞浆内空泡与胞浆内细胞器的定位关系。以z-VAD-fmk、3-MA、CQ及Bafilomycin A1预孵育鸡心肌细胞1 h,经不同浓度马度米星按处理12～24 h后,光学显微镜或透射电子显微镜观察空泡变化,CCK-8法测定细胞活性变化,琼脂凝胶电泳法观察DNA ladder是否形成,Western blot分析LC3-Ⅰ/Ⅱ、p62、H-Ras、K-Ras、Rac 1等蛋白的表达变化。结果显示,马度米星铵引起鸡心肌细胞出现浓度和时间依赖性的细胞质空泡化现象,胞浆内大量的空泡特征不同于细胞凋亡、自噬等的典型形态学特征,这种空泡来源于细胞巨胞饮,而不是线粒体、内质网或溶酶体的肿胀。z-VAD-fmk和3-MA/CQ不能抑制马度米星铵引起的鸡心肌细胞空泡化,亦不能保护心肌细胞活性（P>0.05）。而Bafilomycin A1可以显着抑制胞浆内空泡的产生且可以显着保护细胞活性（P<0.01）。马度米星铵可以影响LC3-Ⅰ/Ⅱ和p62蛋白的表达,但抑制表达后并不能改善马度米星按引起的细胞损伤。马度米星铵处理鸡心肌细胞后,K-Ras和Rac 1蛋白表达量均显着变化。上述结果表明,马度米星铵可引起不同于凋亡及细胞自噬的巨泡式细胞死亡,这种细胞死亡依赖空泡型H+-ATP酶的活化及Ras-Racl信号通路的参与。综上所述,本文发现马度米星铵可导致鸡原代心肌细胞的毒性损伤,引起鸡原代心肌细胞转录谱的显着改变;差异表达基因主要集中于细胞炎症反应、细胞凋亡、离子紊乱及胞浆空泡化;caspase依赖和非依赖的细胞凋亡途径介导了马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性,巨泡式细胞死亡-methuosis主导了马度米星铵的心肌细胞毒性作用。本研究完善了马度米星铵致鸡心肌损伤的机制,为兽医临床防控马度米星铵心脏毒性提供一定参考依据,具有重要理论和现实意义。
赵清[10]（2018）在《变质与未变质僵蚕毒性物质基础解析与炮制原理炮制减毒机理研究》文中研究表明目的:中药炮制是一项古老的制药技术,中药经过炮制后能起到减毒增效的作用。应用辅料和加热炮制是传统炮制技术的两大法宝。中药僵蚕始载于《神农本草经》,具有息风止痉、化痰散结之功效,药用历史久远,临床应用范围广泛。但本品为富含蛋白质、多糖和油脂的动物类中药,在贮存和保管的过程中极易发生霉变、虫蛀等质量变异情况。被霉菌污染的僵蚕,如果未经质控和处理,一旦被患者服用,很容易诱发不良反应。不仅如此,即使是未变质的正常僵蚕,临床上也有引发不良反应的诸多报道。但是目前僵蚕引发不良反应的机理尚不明确。为了对僵蚕进行脱毒和阐明僵蚕的毒性物质基础,本研究需要探明几个问题,即僵蚕存放时容易感染哪些霉菌,这些霉菌又会产生哪些毒素,这些毒素作用于人或实验动物时会引起哪些毒性反应,这些毒素是否具有热不稳定性,通过不同加热炮制的方法能否使变质僵蚕快速脱毒等,同样,未变质僵蚕的毒性物质基础是什么,毒性剂量情况如何,这些物质是否也具有热不稳定性,加热炮制能否使其毒性降低等。材料与方法:为了回答上述几个问题,本研究首先对七个产地收集到的十二批僵蚕进行了外观性状检查研究,以发霉的僵蚕作为继生真菌来源,采用固体培养,传代纯化,基因鉴别的方式对变质僵蚕的真菌种属进行了鉴别研究。对鉴定完毕的单一菌种进行固体或液体大规模培养,所得培养基经过有机试剂萃取后,对毒性明显的特定提取部位进行化学成分分离纯化和波谱结构分析。鉴定出的毒素,通过医学实验动物急性毒性试验和细胞毒性实验来阐明毒力的大小和对组织及细胞的损伤方式。所获得的化学物质以固体或溶于特定试剂中形成的液体方式进行炮制加热的测试,采用高效液相色谱法、液质联用分析技术来测定其加热前后含量的变化,以及表征加热前后离子碎裂方式的差异。变质僵蚕经过特定辅料和加热方式解毒后,采用薄层色谱分析法,对其脂溶性毒性成分和僵蚕本身所含极性较小的化学成分进行轮廓表征和对比,找寻差异物质。对僵蚕的不同提取部位进行了毒性筛选。在毒性部位中获得的含量较高的毒性物质,进行结构解析和鉴别。这些毒性物质经过加热炮制后,测定其含量的变化,以判断其是否具有热不稳定性。此外,对僵蚕及其各种炮制品的抗惊厥作用进行了较为全面的考查,以验证古人对僵蚕炮制作用的认识--“生品偏于息风止痉,麸炒后偏于化痰散结”是否具有科学性。最后,对僵蚕特异性富集的小分子生物碱1-DNJ对抗小鼠糖尿病心肌病的作用机制进行了初步研究。以db/db小鼠为模型来检测糖尿病心肌在初始阶段N-糖基化的变化,并明确1-DNJ治疗前后心肌糖基化的差异。采用亲水色谱固相萃取富集和LC-MS/MS鉴定技术来表征蛋白质糖基化的变化。同时,用LCA凝集素印迹和FITC标记的凝集素亲和组织化学分析N-聚糖α-1,6-岩藻糖基化改变。结果:1.从变质僵蚕中获得的继生真菌,经过纯化和基因鉴别,发现是产黄青霉和黄曲霉。2.产黄青霉经过扩大培养,从其液体培养基当中得到展青霉素、青霉酸、细胞松弛素B和麦角甾醇等物质。文献查阅验证,这些物质都具有一定的毒性。炮制加热前后的含量测定结果显示,细胞松弛素和麦角甾醇等物质具有热不稳定性,加热炮制可以使其毒性降低。3.黄曲霉产生的黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2经过特定辅料和加热方式处理后,含量有所降低。4.从球孢白僵菌液体培养基中得到的化学成分白僵菌素和细胞松弛素,同样具有热不稳定性,采用特定加热方式处理后,这两种化合物含量降低的都较为明显。5.对正常僵蚕不同极性部位进行了毒性筛选,发现水提取部位的毒性最为明显。通过对水提取部位化学成分的进一步分离纯化,发现球孢白僵菌代谢产物草酸盐对实验动物的毒性和刺激性最为明显,且在水提取物中的含量较高。这些草酸盐同样具有热不稳定性,加热炮制可以使其含量适当降低。6.僵蚕及其不同炮制品提取物均具有一定的抗惊厥作用,但此作用不及阳性对照药卡马西平、阿普唑仑等明显。僵蚕提取物在对抗硝酸士的宁和青霉素点燃杏仁核惊厥模型作用较为明显,无力对抗戊四氮致惊厥和电惊厥模型。分子生物学实验结果显示,僵蚕提取物能够降低关键通路分子GRP78,CAP3的表达,提升CHOP10的表达。7.僵蚕中的1-DNJ能够抑制糖尿病小鼠心肌纤维化,降低db/db小鼠心肌蛋白N-糖基化表达和α1,6-岩藻糖基化表达。结论:1.僵蚕变质程度较明显时应弃之不用。2.药材中混有少量变质僵蚕时,应当及时挑拣出去。如果僵蚕表面和外观性状质变不明显,应当及时对僵蚕进行处理。僵蚕极易被黄曲霉污染,此外,产黄青霉等霉菌也会污染僵蚕。通过对比和筛选,采用生姜汁及生姜挥发油,结合麦麸来共同炮制变质僵蚕,可以起到快速脱毒的作用。3.黄曲霉、产黄青霉以及球孢白僵菌,这些真菌菌株产生的某些次生代谢产物都具有一定的热不稳定性,可以采用加热炮制的方法来降低其含量。4.微波加热炮制法对某些真菌次生代谢产物能起到高温破坏的作用,具有一定的减毒作用。5.僵蚕虽然具有一定的抗惊厥作用,但是在对抗某些刺激方式导致的机体惊厥效果不明显。并且本研究的结果与古人对僵蚕炮制作用认识之“生品僵蚕偏于息风止痉,炮制后偏于化痰散结”并不完全一致,说明古人的理解还需要通过进一步实验研究来加以验证。6.僵蚕中的1-DNJ具有明显的降血糖作用,此化合物对抗小鼠糖尿病心肌病的纤维化作用通过抑制心肌蛋白质N-糖基化和α-1,6-岩藻糖基化来实现,但是对关键糖基转移酶表达量的测定发现,该化合物也许是通过降低关键通路中底物的浓度作用来实现的。
二、大鼠心肌细胞的培养纯化及其在药理毒理学中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠心肌细胞的培养纯化及其在药理毒理学中的应用（论文提纲范文）
（1）松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 J亚群禽白血病病毒(ALV-J)研究进展 |
| 1.1 ALV-J流行病学特点 |
| 1.2 ALV的理化特征与基因结构特点 |
| 1.2.1 形态学特征 |
| 1.2.2 ALV的理化特性 |
| 1.2.3 ALV基因结构 |
| 1.3 ALV的复制 |
| 1.4 ALV-J的致瘤特点 |
| 1.5 ALV-J致病性及危害 |
| 1.6 ALV-J的检测和诊断 |
| 1.6.1 血清学检测 |
| 1.6.2 免疫荧光技术(IFA) |
| 1.6.3 免疫组化技术 |
| 1.6.4 病毒基因检测 |
| 1.7 ALV-J的防控 |
| 1.7.1 免疫接种 |
| 1.7.2 药物治疗 |
| 1.7.3 种群净化措施 |
| 2 松花粉概述 |
| 3 多糖 |
| 3.1 多糖提取方法 |
| 3.1.1 经典法 |
| 3.1.2 超声波法 |
| 3.1.3 酶法 |
| 3.1.4 其他方法 |
| 3.2 多糖分离纯化 |
| 3.2.1 分级沉淀 |
| 3.2.2 柱分离 |
| 3.2.3 膜分离 |
| 3.3 多糖的生理功能 |
| 3.3.1 抗肿瘤作用 |
| 3.3.2 免疫增强作用 |
| 3.3.3 抗病毒作用 |
| 3.3.4 其他功能 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 松花粉多糖抗ALV-J活性单体分离鉴定及构效关系研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 马尾松花粉粗多糖提取 |
| 2.1.1 花粉除脂 |
| 2.1.2 多糖提取纯化 |
| 2.1.3 苯酚-硫酸法测定多糖含量 |
| 2.2 单体多糖分离纯化 |
| 2.3 单体多糖活性体外评价 |
| 2.3.1 细胞复苏及培养 |
| 2.3.2 细胞毒性试验 |
| 2.3.3 体外抗病毒活性 |
| 2.3.3.1 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.3.3.2 ELISA法检测细胞上清p27 抗原 |
| 2.3.3.3 qPCR方法检测病毒拷贝量 |
| 2.4 多糖及单体组分表征 |
| 2.4.1 单体多糖分子量测定 |
| 2.4.2 单体多糖红外光谱表征 |
| 2.4.3 单体多糖单糖组成测定 |
| 2.4.4 单体多糖三螺旋结构测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 脱蛋白纯化表征 |
| 3.2 总多糖提取条件筛选 |
| 3.3 单体多糖的分离纯化 |
| 3.4 不同pH条件下单体多糖提取效率比较 |
| 3.5 细胞毒性试验 |
| 3.6 多糖组分体外抗病毒活性评价 |
| 3.6.1 多糖组分对p27 抗原表达的影响 |
| 3.6.2 qPCR方法检测多糖组分病毒拷贝量 |
| 3.7 单体多糖分子量及其分布 |
| 3.8 单体多糖红外光谱分析 |
| 3.9 单糖组成的测定 |
| 3.10 单糖组成相对含量 |
| 3.11 三螺旋结构的测定 |
| 3.12 NaOH处理PPP-2 抗病毒活性研究 |
| 4 讨论 |
| 第三章 松花粉多糖壳聚糖纳米药物制备及抗ALV-J活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与动物 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 松花粉多糖壳聚糖纳米药物(CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.1.1 壳聚糖空白纳米药物(CS NPs)制备 |
| 2.1.2 载药纳米药物(CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.2 CS-PPPs NPs体外表征 |
| 2.2.1 透射电镜表征 |
| 2.2.2 粒径及分布表征 |
| 2.2.3 包封率测定 |
| 2.2.4 载药量测定 |
| 2.2.5 体外释放试验 |
| 2.3 CS-PPPs纳米药物体外评价 |
| 2.3.1 细胞毒性试验 |
| 2.3.2 细胞荧光标记试验 |
| 2.3.3 体外抗病毒活性试验 |
| 2.4 纳米药物体内评价 |
| 2.4.1 纳米药物体内代谢行为研究 |
| 2.4.2 ALV-J体内感染模型建立及分组 |
| 2.4.3 泄殖腔排毒监测 |
| 2.4.4 大体剖检 |
| 2.4.5 组织病理观察 |
| 2.4.6 mRNA水平检测血浆病毒载量 |
| 2.4.7 免疫器官指数 |
| 2.4.8 白细胞检测 |
| 2.4.9 外周血淋巴细胞转换率(LTR)测定 |
| 2.4.10 血清中IL-2和IFN-γ分泌量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流出曲线图 |
| 3.2 制备工艺筛选 |
| 3.2.1 壳聚糖浓度筛选 |
| 3.2.2 TPP比例筛选 |
| 3.2.3 多糖占壳聚糖浓度筛选 |
| 3.3 体外释放试验 |
| 3.4 纳米药物体外评价 |
| 3.4.1 纳米药物细胞毒性试验 |
| 3.4.2 体外荧光标记 |
| 3.4.3 体外抗病毒活性试验 |
| 3.5 纳米药物体内试验 |
| 3.5.1 纳米药物体内代谢行为研究 |
| 3.5.2 临床症状 |
| 3.5.3 泄殖腔排毒监测 |
| 3.5.4 大体剖检 |
| 3.5.5 组织病理观察 |
| 3.5.6 纳米药物对ALV-J在鸡体复制的影响 |
| 3.5.7 免疫器官指数 |
| 3.5.8 白细胞检测 |
| 3.5.9 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血淋巴细胞转换率测定 |
| 3.5.10 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血中细胞因子浓度影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 基于抗体靶向的壳聚糖纳米药物递送系统增强松花粉多糖抗ALV-J活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与动物 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 基于抗体靶向的松花粉多糖壳聚糖纳米药物(Ab-CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.1.1 壳聚糖抗体(Ab-CS)复合物的制备 |
| 2.1.2 Ab-CS-PPPs NPs制备 |
| 2.2 Ab-CS-PPPs NPs理化表征 |
| 2.2.1 红外光谱表征 |
| 2.2.2 透射电镜(TEM)表征 |
| 2.2.3 粒径及分布表征 |
| 2.2.4 包封率及载药量测定 |
| 2.2.5 体外释放试验 |
| 2.3 Ab-CS-PPPs NPs体内外ALV-J靶向试验 |
| 2.3.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞靶向研究 |
| 2.3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内靶向组织分布研究 |
| 2.3.3 Ab-CS-PPPs NPs体内靶器官抑制ALV-J复制研究 |
| 2.4 Ab-CS-PPPs NPs毒理及代谢研究 |
| 2.4.1 细胞毒性研究 |
| 2.4.2 Ab-CS-PPPs NPs体内代谢研究 |
| 2.5 Ab-CS-PPPs NPs体内外抗病毒活性研究 |
| 2.5.1 Ab-CS-PPPs NPs体外抗病毒活性表征 |
| 2.5.2 ALV-J体内感染模型建立及分组 |
| 2.5.3 泄殖腔排毒监测 |
| 2.5.4 大体剖检及组织病理观察 |
| 2.5.5 血浆病毒载量检测 |
| 2.6 Ab-CS-PPPs NPs缓解ALV-J免疫抑制研究 |
| 2.6.1 免疫器官指数 |
| 2.6.2 白细胞及外周血淋巴细胞转换率(LTR)测定 |
| 2.6.3 血清中IL-2和IFN-γ分泌量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ab-CS-PPPs NPs理化表征 |
| 3.1.1 Ab-CS复合物制备及红外表征 |
| 3.1.2 Ab-CS-PPPs NPs粒径、包封率及载药量表征 |
| 3.1.3 Ab-CS-PPPs NPs形态及粒径表征 |
| 3.1.4 体外释放试验 |
| 3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内外ALV-J靶向试验 |
| 3.2.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞靶向研究 |
| 3.2.2 Ab-CS-PPPs NPs体内靶向组织分布研究 |
| 3.2.3 Ab-CS-PPPs NPs体内靶器官抑制ALV-J复制研究 |
| 3.3 Ab-CS-PPPs NPs毒理及代谢研究 |
| 3.3.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞毒性试验 |
| 3.3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内代谢行为研究 |
| 3.4 Ab-CS-PPPs NPs体内外抗病毒活性研究 |
| 3.4.1 体外抗病毒活性 |
| 3.4.2 临床症状 |
| 3.4.3 泄殖腔排毒监测 |
| 3.4.4 大体剖检 |
| 3.4.5 组织病理观察 |
| 3.4.6 血浆病毒载量 |
| 3.5 Ab-CS-PPPs NPs缓解ALV-J免疫抑制研究 |
| 3.5.1 免疫器官指数 |
| 3.5.2 白细胞检测 |
| 3.5.3 抗体纳米药物对感染ALV-J鸡外周血LTR测定 |
| 3.5.4 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血中细胞因子浓度测定 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）丹参提取物在抗耐药金黄色葡萄球菌感染中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 金黄色葡萄球菌对主要抗菌药物的耐药性研究进展 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类抗生素耐药性研究 |
| 1.2 金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素耐药性研究 |
| 1.3 金黄色葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药性研究 |
| 1.4 金黄色葡萄球菌对四环素类抗生素耐药性研究 |
| 1.5 金黄色葡萄球菌对喹诺酮类抗菌药物耐药性研究 |
| 第2章 金黄色葡萄球菌致病性相关毒力因子研究进展 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌表面蛋白研究概况 |
| 2.2 金黄色葡萄球菌细胞毒素研究概况 |
| 2.3 金黄色葡萄球菌超级抗原外毒素 |
| 2.4 金黄色葡萄球菌毒力因子乙酰基转移酶A(Oat A) |
| 第3章 丹参提取物主要化学成分药理学作用研究进展 |
| 3.1 丹参提取物主要脂溶性丹参酮类化合物 |
| 3.2 丹参提取物主要水溶性丹酚酸类化合物 |
| 3.3 丹参提取工艺研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 丹参的提取工艺研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 丹参提取物与不同抗生素的体外协同抗菌作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 丹参提取物抗金黄色葡萄球菌溶血素的作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 丹参提取物注射液制备工艺研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 丹参提取物注射液与硫酸庆大霉素联用的药效学和毒理学研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 丹参提取物注射液对雏鸡人工感染耐甲氧金黄色葡萄球菌的治疗试验研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间取得的主要成果 |
| 致谢 |
（3）齐墩果酸抑制β-内酰胺酶和细菌性溶血素活性作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 革兰氏阴性菌耐药性研究进展 |
| 1.1 肠杆菌科细菌耐药性研究现状 |
| 1.2 铜绿假单胞菌耐药性研究现状 |
| 1.3 不动杆菌耐药性研究现状 |
| 第2章 金黄色葡萄球菌耐药性研究进展 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性研究 |
| 2.2 金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药性研究 |
| 2.3 金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类抗生素耐药性研究 |
| 2.4 金黄色葡萄球菌对四环素类抗生素耐药性研究 |
| 2.5 金黄色葡萄球菌对磷霉素耐药性研究 |
| 2.6 金黄色葡萄球菌对氯霉素耐药性研究 |
| 2.7 金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类抗生素耐药性研究 |
| 2.8 金黄色葡萄球菌对磺胺类抗生素耐药性研究 |
| 2.9 金黄色葡萄球菌对其它抗生素耐药性研究 |
| 第3章 细菌性溶血素研究进展 |
| 3.1 金黄色葡萄球菌溶血素在其致病过程中的作用研究 |
| 3.2 单增李斯特菌溶血素(LLO) |
| 3.3 肺炎球菌溶血素(PLY) |
| 3.4 猪链球菌溶血素(SLY) |
| 3.5 产气荚膜梭菌溶血素(PFO) |
| 3.6 大肠杆菌溶血素 |
| 第4章 主要五环三萜类化合物的药理学作用研究进展 |
| 4.1 齐墩果酸 |
| 4.2 熊果酸 |
| 4.3 山楂酸 |
| 4.4 科罗索酸 |
| 4.5 其它五环三萜化合物 |
| 第5章 新型抗耐药菌感染药物研究进展 |
| 5.1 现有抗生素的改造和联合使用研究 |
| 5.2 新型抗菌药物的研究 |
| 5.3 天然化合物在抗耐药菌感染中的替代策略研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 广谱β-内酰胺酶抑制剂的筛选 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 齐墩果酸与β-内酰胺类抗生素的体外协同作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 齐墩果酸与β-内酰胺类抗生素的体内协同作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 齐墩果酸抑制细菌性溶血素活性作用的发现 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 齐墩果酸抑制Β-内酰胺酶和细菌性溶血素活性作用机制的确证 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 本硕博连读期间发表学术论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）多肽提取物对鸡抗氧化、调节免疫及抗球虫感染的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文略缩词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 地鳖的研究进展 |
| 1 地鳖的主要成分 |
| 2 地鳖的药理作用 |
| 第二节 蛴螬的研究进展 |
| 1 蛴螬的主要化学成分 |
| 2 蛴螬的药理作用 |
| 第三节 生物活性肽的研究进展 |
| 1 生物活性肽的分类 |
| 2 生物活性肽的功能 |
| 第四节 鸡球虫病的研究进展 |
| 1 鸡球虫的发育和宿主特异性 |
| 2 鸡球虫病的致病机理 |
| 3 鸡球虫病的危害 |
| 4 鸡球虫病药物防治的应用 |
| 第五节 研究的目的和意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 第一节 多肽提取物的体外抗氧化作用的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二节 多肽提取物免疫调节作用的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三节 多肽提取物对鸡抗氧化和调节免疫及抗球虫感染的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）橙皮素通过靶向髓样分化蛋白2对脂多糖诱导的急性肺损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 :橙皮素对体外脂多糖诱导的细胞因子变化的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 :橙皮素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 :橙皮素对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠的保护作用机制 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 展望与不足 |
| 综述 橙皮苷和橙皮素在疾病治疗和预防方面作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（7）丙烯酰胺对斑马鱼胚胎心脏发育毒性的分子毒理学效应及Notch信号通路激活机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 食品加工污染物丙烯酰胺 |
| 1.1.1 食品中丙烯酰胺的发现 |
| 1.1.2 丙烯酰胺人群暴露评估 |
| 1.1.3 丙烯酰胺体内代谢途径 |
| 1.2 丙烯酰胺发育毒性和心脏毒性 |
| 1.2.1 食品毒理学发展 |
| 1.2.2 丙烯酰胺毒理学研究 |
| 1.2.3 丙烯酰胺的发育毒性 |
| 1.2.4 丙烯酰胺的心脏毒性 |
| 1.3 斑马鱼作为模式生物的优势 |
| 1.3.1 斑马鱼模型 |
| 1.3.2 斑马鱼心脏发育 |
| 1.3.3 斑马鱼模型在心脏发育毒性评估中的优势 |
| 1.4 Notch信号通路与心脏发育 |
| 1.4.1 Notch信号通路 |
| 1.4.2 Notch信号通路在早期心脏发育中的作用 |
| 1.4.3 Notch信号通路在肌小梁形成过程中的作用 |
| 1.4.4 Notch信号通路在心脏再生过程中的作用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 丙烯酰胺致斑马鱼胚胎发育毒性和氧化应激研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 丙烯酰胺致斑马鱼胚胎发育毒性 |
| 2.3.2 丙烯酰胺致斑马鱼急性毒性敏感性评估 |
| 2.3.3 丙烯酰胺致斑马鱼胚胎氧化应激 |
| 第三章 丙烯酰胺致斑马鱼胚胎心脏发育毒性分子毒理学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 丙烯酰胺对胚胎心脏早期形态和功能的影响 |
| 3.3.2 丙烯酰胺对胚胎心脏房室心肌和瓣膜发育的影响 |
| 3.3.3 丙烯酰胺对ALPM区域心脏前体的影响 |
| 第四章 丙烯酰胺致斑马鱼心脏发育毒性的细胞机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 丙烯酰胺对心肌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.3.2 丙烯酰胺对心脏房室分化和形态发生的影响 |
| 4.3.3 丙烯酰胺对心脏房室通道分化的影响 |
| 第五章 丙烯酰胺干扰Notch信号动态活性致心室肌小梁增生研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 丙烯酰胺影响胚胎心脏成熟过程中的形态和功能 |
| 5.3.2 丙烯酰胺干扰心室肌小梁形成过程中Notch信号通路 |
| 5.3.3 Notch信号通路抑制剂拯救丙烯酰胺导致的心室肌小梁发育不良 |
| 第六章 丙烯酰胺促进心室肌小梁增生并抑制其迁移机制研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 6.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 丙烯酰胺对心室肌小梁形成相关基因的影响 |
| 6.3.2 丙烯酰胺对心肌细胞之间N-cadherin蛋白的影响 |
| 6.3.3 丙烯酰胺对心肌细胞亚结构的影响 |
| 6.3.4 丙烯酰胺对心脏特异性转录因子的影响 |
| 第七章 总结、创新点与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要的研究成果 |
| 致谢 |
（8）T-2毒素诱导的细胞线粒体毒性作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.2.1 单端孢霉烯族毒素概述 |
| 1.2.2 T-2毒素概述 |
| 1.2.3 T-2毒素分子作用靶点研究进展 |
| 1.2.4 T-2毒素诱导线粒体损伤和氧化应激研究进展 |
| 1.2.5 转录因子NRF-2的研究进展 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 2 T-2毒素诱导GH3细胞线粒体氧化应激和功能变化研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 细胞培养 |
| 2.1.6 CCK-8法检测T-2毒素对GH3细胞活力影响 |
| 2.1.7 细胞内氧自由基检测 |
| 2.1.8 ELISA法检测细胞内8-OHdG含量 |
| 2.1.9 细胞GSH含量检测 |
| 2.1.10 抗氧化酶SOD活性检测 |
| 2.1.11 细胞线粒体膜电位ΔΨm检测 |
| 2.1.12 细胞mt-DNA拷贝数检测 |
| 2.1.13 细胞线粒体ATP水平检测 |
| 2.1.14 细胞呼吸链复合物I酶活性检测 |
| 2.1.15 透射电镜观察GH3细胞形态 |
| 2.1.16 细胞凋亡检测 |
| 2.1.17 qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达 |
| 2.1.18 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 GH3细胞的培养 |
| 2.2.2 细胞总RNA质量鉴定 |
| 2.2.3 T-2毒素对GH3细胞毒性 |
| 2.2.4 T-2毒素诱导GH3细胞线粒体氧化应激 |
| 2.2.5 T-2毒素诱导GH3细胞线粒体功能变化 |
| 2.2.6 T-2毒素激活线粒体依赖的细胞凋亡 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 T-2毒素诱导GH3细胞氧化应激并激活抗氧化系统 |
| 2.3.2 线粒体是T-2毒素另一个重要的分子作用靶点 |
| 2.3.3 T-2毒素激活GH3细胞线粒体生物合成 |
| 2.4 小结 |
| 3 线粒体呼吸链核心铁硫蛋白亚基Ndufs3的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 细胞复苏、传代和冻存 |
| 3.1.7 利用siRNA干扰Ndufs3基因表达 |
| 3.1.8 Ndufs3过表达实验 |
| 3.1.9 Western blot方法测定蛋白表达水平 |
| 3.1.10 qRT-PCR检测RNA干扰水平 |
| 3.1.11 检测线粒体超氧自由基、ΔΨm和ATP水平 |
| 3.1.12 统计学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 siRNA转染效果和RNA干扰Ndufs3效果评价 |
| 3.2.2 敲低Ndufs3增加线粒体超氧自由基产生 |
| 3.2.3 敲低Ndufs3抑制线粒体呼吸链复合物I活性 |
| 3.2.4 敲低Ndufs3降低细胞线粒体ΔΨm |
| 3.2.5 敲低Ndufs3不改变线粒体ATP水平 |
| 3.2.6 通过pcDNA-3.1~+载体在GH3细胞中过表达Ndufs |
| 3.2.7 pcDNA3.1~+-Ndufs3重组载体构建 |
| 3.2.8 Ndufs3过表达验证 |
| 3.2.9 过表达Ndufs3不改变线粒体超氧自由基 |
| 3.2.10 过表达Ndufs3不影响线粒体ΔΨm |
| 3.2.11 过表达Ndufs3不改变线粒体ATP产生 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 Ndufs3能够维持GH3细胞线粒体功能稳定 |
| 3.3.2 Ndufs3过表达不能保护线粒体功能 |
| 3.4 小结 |
| 4 核呼吸因子2在T-2毒素诱导线粒体功能变化中的作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.1.6 细胞复苏、传代和冻存 |
| 4.1.7 间接免疫荧光试验 |
| 4.1.8 抑制剂筛选调控NRF-2的信号通路 |
| 4.1.9 慢病毒构建NRF-2沉默细胞株 |
| 4.1.10 染色质免疫共沉淀 |
| 4.1.11 Western blot和qRT-PCR确定NRF-2干扰效率 |
| 4.1.12 ROS、ATP、复合物I活性和mt-DNA拷贝数检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 NRF-2在GH3细胞中定位在细胞核 |
| 4.2.2 T-2处理GH3细胞后增加NRF-2表达 |
| 4.2.3 调控NRF-2表达的上游信号通路 |
| 4.2.4 敲低NRF-2改变GH3细胞线粒体功能 |
| 4.2.5 ChIP结合PCR和高通量测序确定NRF-2靶基因 |
| 4.2.6 敲低NRF-2抑制靶基因的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 T-2毒素诱导NRF-2核内表达 |
| 4.3.2 NRF-2参与了T-2毒素诱导的线粒体功能变化 |
| 4.3.3 NRF-2控制线粒体靶基因的表达进而影响线粒体功能 |
| 4.3.4 NRF-2通过其他形式来影响线粒体 |
| 4.3.5 NRF-2可能参与的其他功能 |
| 4.4 小结 |
| 5 T-2毒素诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 溶液配制 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 细胞复苏、传代和冻存 |
| 5.1.6 通过腺相关病毒在GH3中稳定表达mRFP-GFP-LC |
| 5.1.7 GH3细胞中细胞自噬的观察 |
| 5.1.8 RNA干扰线粒体自噬基因Atg5、Pink1和NIX |
| 5.1.9 GH3细胞中稳定表达Mito7-mKeima蛋白 |
| 5.1.10 通过Mito7-mKeima确定线粒体自噬 |
| 5.1.11 透射电镜观察线粒体自噬 |
| 5.1.12 qRT-PCR检测线粒体融合与分裂基因表达 |
| 5.1.13 线粒体ATP和细胞凋亡分析 |
| 5.1.14 siRNA转染GH3细胞沉默Nrf2基因 |
| 5.1.15 统计学分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 AAV病毒包装和感染GH3细胞 |
| 5.2.2 T-2毒素能够诱导GH3细胞自噬 |
| 5.2.3 Atg5介导T-2毒素诱导的GH3细胞自噬 |
| 5.2.4 表达Mito7-mKeima的慢病毒包装和感染GH3细胞 |
| 5.2.5 T-2毒素能够诱导GH3细胞线粒体自噬 |
| 5.2.6 Atg5介导T-2毒素诱导GH3细胞线粒体自噬 |
| 5.2.7 透射电镜观察T-2毒素诱导GH3细胞线粒体自噬 |
| 5.2.8 T-2毒素诱导线粒体自噬关键基因表达 |
| 5.2.9 cAMP-PKA-CREB-Nrf2-Pink1调控GH3细胞线粒体自噬 |
| 5.2.10 抑制线粒体自噬降低GH3细胞线粒体功能 |
| 5.2.11 抑制线粒体自噬促进T-2毒素诱导的细胞凋亡 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 T-2毒素诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬 |
| 5.3.2 cAMP-PKA-CREB-Nrf2-Pink1是调控线粒体自噬的通路 |
| 5.3.3 线粒体自噬保护GH3细胞线粒体功能并降低细胞死亡 |
| 5.4 小结 |
| 6 全文创新性总结 |
| 7 单端孢霉烯族毒素引起的线粒体毒性研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性及毒性机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号及缩略语 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 马度米星铵概述 |
| 1.1 马度米星铵 |
| 1.2 理化性质 |
| 1.3 药理作用 |
| 1.4 临床应用 |
| 1.5 中毒现象 |
| 1.6 毒性机制 |
| 2 细胞死亡 |
| 2.1 细胞凋亡 |
| 2.1.1 概述 |
| 2.1.2 凋亡特征 |
| 2.1.3 发生机制 |
| 2.2 细胞自噬 |
| 2.2.1 概述 |
| 2.2.2 自噬特征 |
| 2.2.3 发生机制 |
| 2.3 其它细胞死亡类型 |
| 3 转录组学 |
| 3.1 转录组学测序技术 |
| 3.2 RNA-seq与毒理学研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性的转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 药物配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡原代心肌细胞的分离培养 |
| 1.2.2 细胞活性测定 |
| 1.2.3 总RNA提取及质量测定 |
| 1.2.4 cDNA文库构建及RNA-seq测序 |
| 1.2.5 测序数据分析 |
| 1.2.6 差异表达基因鉴定 |
| 1.2.7 RT-qPCR验证差异表达基因 |
| 1.2.8 差异表达基因聚类分析、功能注释和富集分析 |
| 1.2.9 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马度米星铵的细胞毒性 |
| 2.2 RNA-seq与差异表达基因鉴定结果 |
| 2.3 RT-qPCR验证RNA-seq所得差异表达基因 |
| 2.4 差异基因的功能注释和富集分析 |
| 2.5 马度米星铵改变促炎因子基因的表达模式 |
| 2.6 凋亡相关基因参与马度米星铵引起的细胞毒性 |
| 2.7 马度米星铵改变离子转运相关基因的表达 |
| 2.8 马度米星铵引起胞内空泡形成相关基因的表达变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 马度米星铵改变鸡原代心肌细胞转录表达谱 |
| 3.2 GO分析差异基因的生物学功能 |
| 3.3 KEGG分析差异基因的代谢通路 |
| 3.4 差异表达基因的深度挖掘 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 转录组学分析结果的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.2 药物配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡原代心肌细胞分离培养 |
| 1.2.2 ELISA |
| 1.2.3 流式细胞术 |
| 1.2.4 Western blot |
| 1.2.5 蛋白提取 |
| 1.2.6 蛋白浓度测定 |
| 1.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 1.2.8 胞浆内Ca~(2+)水平测定 |
| 1.2.9 Na~+-K~+/Ca~(2+)-ATPases活性测定 |
| 1.2.10 光学显微镜观察 |
| 1.2.11 透射电子显微镜观察 |
| 1.2.12 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马度米星铵促进炎症反应 |
| 2.2 马度米星铵引起细胞凋亡 |
| 2.3 马度米星铵扰乱胞浆内离子平衡 |
| 2.4 胞浆内Ca~(2+)来源研究 |
| 2.5 马度米星铵引起细胞质内大量空泡形成 |
| 3 讨论 |
| 3.1 马度米星铵促进鸡原代心肌细胞炎症反应 |
| 3.2 马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞凋亡 |
| 3.3 马度米星铵引起鸡原代心肌细胞内离子紊乱 |
| 3.4 马度米星铵引起鸡原代心肌细胞空泡化 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 马度米星铵致鸡原代心肌细胞凋亡的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂与仪器 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 药物配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 光学显微镜观察 |
| 1.2.2 荧光显微镜观察 |
| 1.2.3 RT-qPCR |
| 1.2.4 Caspase-3/8/9活性检测 |
| 1.2.5 Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术分析 |
| 1.2.6 细胞线粒体膜电位(ΔΨm)检测 |
| 1.2.7 GSH测定 |
| 1.2.8 MTT法测定细胞活性 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马度米星铵对鸡心肌细胞形态的影响 |
| 2.2 马度米星铵诱导鸡心肌细胞凋亡 |
| 2.3 马度米星铵对凋亡相关基因的影响 |
| 2.4 马度米星铵增强凋亡蛋白活性 |
| 2.5 z-VAD-fmk对马度米星铵诱导鸡心肌细胞毒性和凋亡的影响 |
| 2.6 马度米星铵降低鸡心肌细胞的线粒体膜电位 |
| 2.7 马度米星铵诱导ROS产生和细胞内GSH水平降低 |
| 2.8 NAC对马度米星铵引起的鸡心肌细胞凋亡和细胞毒性的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 马度米星铵诱导鸡心肌细胞发生凋亡 |
| 3.2 Caspase3/8/9和Bcl-2家族基因参与马度米星铵引起的细胞凋亡 |
| 3.3 线粒体途径介导了马度米星铵的诱导的细胞凋亡 |
| 3.4 氧化应激参与马度米星铵诱导的细胞损伤 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 马度米星铵致鸡原代心肌细胞巨泡式死亡的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 药物配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡原代心肌细胞分离培养 |
| 1.2.2 细胞形态观察 |
| 1.2.3 CCK-8测定细胞活性 |
| 1.2.4 透射电子显微镜观察 |
| 1.2.5 激光共聚焦显微镜观察 |
| 1.2.6 DNA ladder测定 |
| 1.2.7 Western blot分析 |
| 1.2.8 LDH释放度测定 |
| 1.2.9 ATP水平测定 |
| 1.2.10 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马度米星铵引起鸡心肌细胞空泡化 |
| 2.2 马度米星铵诱导心肌细胞空泡化的融合过程 |
| 2.3 马度米星铵诱导的空泡与细胞器的定位关系 |
| 2.4 z-VAD-fnk对鸡心肌细胞空泡化的影响 |
| 2.5 DNAladder观察 |
| 2.6 3-MA和CQ对鸡心肌细胞空泡化和细胞毒性的影响 |
| 2.7 马度米星铵对自噬蛋白表达的影响 |
| 2.8 马度米星铵对LDH和ATP的影响 |
| 2.9 Bafilomycin A1对鸡心肌细胞空泡化和细胞毒性的影响 |
| 2.10 马度米星铵对Ras-Rac1信号通路的影响 |
| 2.11 马度米星铵对鸡心肌细胞的微观形态影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 马度米星铵诱导细胞空泡化的特征 |
| 3.2 细胞空泡化与细胞凋亡 |
| 3.3 细胞空泡化与细胞自噬 |
| 3.4 细胞空泡化与细胞巨泡式死亡 |
| 3.5 细胞空泡化的发生机制 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术成果 |
（10）变质与未变质僵蚕毒性物质基础解析与炮制原理炮制减毒机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 变质僵蚕继生真菌的培养与纯化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 辅料吸附与炮制加热对僵蚕中四种黄曲霉毒素含量的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 产黄青霉代谢产物的毒性研究和炮制减毒研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四章 球孢白僵菌代谢产物的分离纯化与鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第五章 僵蚕水提物急性毒性试验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第六章 不同炮制方法对僵蚕抗惊厥作用的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第七章 僵蚕提取物的抗惊厥作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第八章 自制僵蚕1-DNJ提取物降低心肌蛋白N-糖基化对db/ db小鼠糖尿病心肌病纤维化的抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、大鼠心肌细胞的培养纯化及其在药理毒理学中的应用（论文参考文献）
- [1]松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究[D]. 崔文平. 山东农业大学, 2021
- [2]丹参提取物在抗耐药金黄色葡萄球菌感染中的应用[D]. 崔玉梅. 吉林大学, 2021(01)
- [3]齐墩果酸抑制β-内酰胺酶和细菌性溶血素活性作用及其机制研究[D]. 周永林. 吉林大学, 2021(01)
- [4]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
- [5]多肽提取物对鸡抗氧化、调节免疫及抗球虫感染的研究[D]. 刘丹. 北京农学院, 2020(02)
- [6]橙皮素通过靶向髓样分化蛋白2对脂多糖诱导的急性肺损伤的保护作用[D]. 叶进燕. 苏州大学, 2019(06)
- [7]丙烯酰胺对斑马鱼胚胎心脏发育毒性的分子毒理学效应及Notch信号通路激活机制[D]. 黄蒙蒙. 浙江大学, 2019(01)
- [8]T-2毒素诱导的细胞线粒体毒性作用研究[D]. 黄德玉. 华中农业大学, 2019(01)
- [9]马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性及毒性机制的研究[D]. 高修歌. 南京农业大学, 2018(07)
- [10]变质与未变质僵蚕毒性物质基础解析与炮制原理炮制减毒机理研究[D]. 赵清. 辽宁中医药大学, 2018(07)