一、空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究（论文文献综述）
李亚茹,周冬根,夏杏洲,曹怡芳,杨慧宁,胡双芳,肖性龙[1]（2017）在《免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌》文中研究表明建立了免疫磁珠分离（Immunomagnetic separation,IMS）联合实时荧光PCR（real time PCR）快速、灵敏地检测虾中沙门氏菌的方法。用纳米磁珠与抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠,优化反应条件,建立IMS方法。同时针对沙门氏菌ttr基因合成探针和引物,构建real time PCR体系,选4株代表性的沙门氏菌检测其特异性和灵敏度。结果显示,免疫磁珠的最适添加量为100μL,免疫磁珠与样品菌液的最佳反应时间为30 min。建立的免疫磁珠分离-实时荧光PCR（IMS-real time PCR）方法特异性高,对于虾中沙门氏菌的检测限为鼠伤寒沙门氏菌5×101 CFU/25 g,猪霍乱沙门氏菌5×102 CFU/25 g,肠炎沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌1×102CFU/25 g,检测全程可在6 h内完成。对40份实际样品,IMS-real time PCR方法与国标法检测结果完全一致。建立的IMS-Real time PCR方法用时短、灵敏度高,为水产品中沙门氏菌的快速检测提供了技术支撑,对沙门氏菌引起的食源性疾病的预防和控制具有现实意义。
陈金,毕水莲[2]（2015）在《PCR技术检测空肠弯曲菌的研究进展》文中提出空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是一种人畜共患病病原菌,可以使人和动物引发多种疾病。目前,检测C.jejuni采用的国标方法是传统的培养法,但C.jejuni培养条件苛刻,且培养法存在操作繁琐、特异性不强、费时等缺点。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）以其快速、准确、灵敏度高、特异性强的特点,现已广泛应用于C.jejuni的检测,并成为目前快速检测临床与食品中C.jejuni最常用的的方法。本文综述了近年来利用RCR技术,包括常规PCR、多重PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR、PCR-酶联免疫吸附法、最大几率数-PCR、PCR-限制性片段长度多态性、PCR-变性高效液相色谱、PCR-变性梯度凝胶电泳和磁捕获-荧光PCR方法检测C.jejuni的研究进展,并针对这些PCR技术的原理、检测效果、优点和缺点等方面进行了分析比较,为有效控制和预防该菌引起的疾病提供重要信息。
宋丽萍,姜洁,李玮,陶庆会,郭淼,路勇[3]（2015）在《食源性致病菌快速检测技术研究进展》文中研究表明食源性致病菌快速检测技术的发展对于我国应对和控制食源性疾病的爆发至关重要。目前在基层监管执法中应用最为广泛的食源性致病菌快速检测技术主要包括以免疫学为基础的酶联免疫吸附技术和免疫磁珠分离技术;以及以分子生物学技术为基础的PCR技术和环介导等温扩增等技术。本篇综述对上述技术的检测特点和应用情况进行了深入的分析,同时,还对在食源性致病菌快速检测领域极具有发展前景的双功能抗体检测技术和变性高效液相色谱分析技术进行了详细的介绍,最后文章分析了目前食源性致病菌快检的技术瓶颈主要在于所有快检技术的建立很难绕过致病菌富集和分离的过程,这一步骤很大程度上延长了食源性致病菌快检所需的时间。研发高效、快速的致病菌富集分离技术是真正实现食源性致病菌快速检测的关键。
胡元庆,李凤霞[4]（2014）在《食品中空肠弯曲菌检测技术最新进展》文中研究表明空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是人类常见的食源性病原菌,感染后主要引起急性肠炎,并且与格林-巴利综合症密切相关。近年来弯曲菌污染禽肉及牛奶制品引发的食品安全事件呈上升趋势,发达国家尤为突出。高效快速检测动物性食品的加工、贮藏和消费过程中弯曲菌污染情况十分必要,可为有效控制该菌污染食品及人弯曲菌病发生提供技术保障。本文综述了近年来国内外关于食品加工及贮藏过程中弯曲菌污染检测技术的最新成果。
朱佳琪[5]（2013）在《弯曲菌real-time PCR技术的建立及多种定量检测方法的比较》文中提出弯曲菌（Campylobacter spp）是一种重要的食源性病原菌,近几年由弯曲菌引起的急性腹泻病例呈较快上升趋势。研究表明,在人类感染弯曲菌散发病例中,超过90%的病例是由于食用了污染的鸡肉产品及其交叉污染物所致。我国已大体了解了不同宿主及食品中弯曲菌的污染状况,但流行病学定性研究结果提供的干预措施不能量化,获得的政策建议不够精确。因此,需要开展快速、定量的检测方法研究,为弯曲菌污染的定量风险评估、危害分析和防控提供基础数据。1、弯曲菌real-time PCR定量检测方法的建立以弯曲菌16s rRNA基因作为靶基因,建立检测弯曲菌的real-time PCR方法。弯曲菌标准株、分离株均扩增出曲线,而其他常见食源性病原菌均无扩增,表明该方法具有较强的特异性。敏感性试验结果显示,该方法对弯曲菌检测限在10CFU/mL左右。荧光定量PCR方法标准曲线循环阈值（Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,标准曲线为：y=-3.286x+40.878,R2值达到0.999,批内可重复变异系数在0.12%-0.4%之间,批间可重复变异系数为0.17%,重复性好。对样品分别使用样品直接热裂解法、菌液浓缩热裂解法和基因组试剂盒提取法提取模板DNA,并对不同制备方法的荧光定量PCR结果进行了比较,最终选用菌液浓缩热裂解法提取鸡肉擦拭样品和鸡肛拭样品模板DNA,弯曲菌DNA回收率分别为46%和19.6%,选用基因组试剂盒提取鸡肉淋洗样品模板DNA,该方法的DNA回收率为1.2%。2、选择性CCDA平板菌落计数法和选择性Karmali平板菌落计数法的优化本研究参照翟伟华等建立的禽肉中弯曲菌定量检测方法,对选择性CCDA平板中抗生素进行浓度调整,并比较添加三种不同抗生素浓度的平板对实际样品中弯曲菌检测的影响,结果表明,甲氧苄氨嘧啶、利福平和放线菌酮三种抗生素浓度调整为0.01g/L、0.01g/L和0.1g/L时,更有利于弯曲菌的生长,且平板上杂菌的量也不影响对弯曲菌可疑菌落的判定,采用该浓度抗生素平板与纯培养弯曲菌的符合度为（95+5）%。选择性Karmali平板菌落计数法参照《我国零售鸡肉中弯曲菌污染对人群健康影响的初步定量风险评估项目》中所采用的定量分离样品中弯曲菌方法,通过实际样品检测以验证其有效性。3、real-time PCR法、选择性CCDA和Karmali平板菌落计数法检测整鸡淋洗样品中弯曲菌的比较运用荧光定量PCR方法、CCDA平板菌落计数法和Karmali平板菌落计数法同时对50份鸡肉淋洗样品进行弯曲菌检测。荧光定量PCR方法检测阳性率为92%,检测出弯曲菌数平均值为log2.03CFU/g,与国标方法符合率为28.0%；CCDA平板菌落计数法检测阳性率为36%,检测出弯曲菌数平均值为log1.44CFU/g,与国标方法符合率为60.0%；Karmali平板菌落计数法检测阳性率为56%,检测出弯曲菌数平均值为log2.08CFU/g,与国标方法符合率为56.0%。由于国标方法存在漏检现象,导致三种方法与国标方法符合率均不高。结果显示real-time PCR法阳性检测率高于选择性CCDA平板菌落计数法和Karmali平板菌落计数法,但与国标方法符合率最低；对于鸡淋洗样品而言,Karmali平板菌落计数法阳性检出率和阳性样品弯曲菌数均显着高于CCDA平板菌落计数法。4、real-time PCR法和CCDA平板菌落计数法检测鸡肉擦拭和鸡肛拭样品中弯曲菌的比较运用荧光定量PCR方法和CCDA平板菌落计数法对扬州某农贸市场采集的68份鸡肉擦拭样品进行弯曲菌检测。实时荧光定量PCR检测出弯曲菌阳性样品65份,阳性率为95.6%（65/68）,检测出弯曲菌数平均值为log2.36CFU/100cm2;选择性CCDA平板菌落计数法检测出弯曲菌60份阳性,阳性率为88.2%（60/68）,检测出弯曲菌数平均值为logl.25CFU/100cm2。结果显示两种方法的符合度为89.7%,且real-time PCR法阳性检测率及阳性样品弯曲菌数均高于选择性CCDA平板菌落计数法。运用荧光定量PCR方法和CCDA平板菌落计数法对扬州某农贸市场采集的56份鸡肛拭样品进行弯曲菌检测。实时荧光定量PCR检测出弯曲菌阳性样品54份,阳性率为96.4%（54/56）,检测出弯曲菌数平均值为log6.02CFU/g;选择性CCDA平板菌落计数法检测出弯曲菌42份阳性,阳性率为75.0%（42/56）,检测出弯曲菌数平均值为log3.50CFU/g。结果显示两种方法的符合度为78.8%,且real-time PCR法阳性检测率及阳性样品弯曲菌数均高于选择性CCDA平板菌落计数法。5、CCDA平板菌落计数法和Karmali平板菌落计数法检测鸡肛拭样品中弯曲菌的比较运用选择性CCDA平板菌落计数法和Karmali平板菌落计数法对18份鸡肛拭样品进行弯曲菌检测。选择性Karmali平板菌落计数法检测出9份阳性,阳性率为50%,检测出弯曲菌数平均值为log6.02CFU/g; CCDA平板菌落计数法检测出13份阳性,阳性率为72.2%,检测出弯曲菌数平均值为log6.06CFU/g。结果显示出对于鸡肛拭样品而言,虽然这两种方法检测阳性样品弯曲菌数没有显着差异,但CCDA平板菌落计数法阳性检测率高于选择性Karmali平板菌落计数法。
许紫建[6]（2013）在《猪、鸡弯曲菌的分离鉴定和耐药性分析及空肠弯曲菌LAMP检测方法的研究》文中研究说明弯曲菌（Campylobacter）是一种微需氧、菌体呈弧形或螺旋形的革兰氏阴性细菌，在世界范围内广泛存在，可感染人和动物引起发病，但感染家禽后不引起临床症状，但成为人感染弯曲菌的主要污染源。目前弯曲菌属中已鉴定19个种，其中以空肠弯曲菌（C. jejuni）和结肠弯曲菌（C. coli）对人的感染最为普遍。为调查畜禽肠道内弯曲菌特别是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的流行状况，本试验自北京郊区畜禽养殖场和屠宰场采集畜禽肠道粪便样品，经增菌培养后利用三重PCR进行弯曲菌属、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的检测，进而对PCR检测阳性样品进行弯曲菌的分离鉴定，最后对分离鉴定的弯曲菌分离株进行药敏试验鉴定。本试验共采集鸡肠道和肛门拭子132份，经PCR检测共6份呈空肠弯曲菌阳性，但细菌分离鉴定未获得空肠弯曲菌分离株。采集猪肠道和肛门棉拭子样品241份，PCR检测结肠弯曲菌阳性样品数为178份，阳性率为73.9%，而空肠弯曲菌阳性样品数5份，阳性率仅为2.1%。经分离鉴定后共获得结肠弯曲菌菌株63株，分离率为35.4%，未分离获得空肠弯曲菌菌株。对26种抗生素的药敏试验结果显示结肠弯曲菌分离株对氯霉素（100%）、丁胺卡那（93.7%）、强力霉素（91.5%）、庆大霉素（82.5%）和阿莫西林（82.5%）等抗生素比较敏感，而对头孢哌酮（100%）、头孢氨苄（100%）、头孢拉啶（100%）、头孢唑啉（98.4%）、头孢克肟（92.1%）、萘啶酸（92.1%）、链霉素（90.5%）、环丙沙星（90.3%）、诺氟沙星（88.9%）和青霉素（87.3%）具有显着的耐药性；而且分离株多重耐药现象比较普遍，主要集中于14-20耐。本试验结果显示猪肠道内普遍存在结肠弯曲菌，而且菌株对多种抗生素产生了显着的耐药性。环介导等温扩增（LAMP）方法是近年来出现的一种简便快速检测病原的方法，为自动物源性产品中快速检测空肠弯曲菌的污染，本试验建立了检测空肠弯曲菌的LAMP方法。首先根据检测空肠弯曲菌的文献报道，选择特异性的mapA基因设计LAMP引物，建立检测空肠弯曲菌的LAMP检测方法。继而对LAMP方法中不同影响因子分别进行筛选和优化，筛选的最佳结果为内外引物浓度分别为1.6μM和0.2μM、Mg2+浓度为8mM、dNTP浓度为1.4mM、Betaine浓度为0.8M、反应时间为60min、反应温度为65℃。最后特异性检测结果显示对其它13种细菌扩增结果均为阴性；敏感性检测结果显示对空肠弯曲菌基因组DNA的检测灵敏度为100fg，对空肠弯曲菌菌液检测灵敏度为7.5cfu。本试验建立的LAMP检测方法为实现快速简便检测空肠弯曲菌奠定了坚实的基础。
郑扬云[7]（2013）在《食品中空肠弯曲菌的污染分布规律及遗传多样性研究》文中研究说明空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是家禽、家畜及某些鸟、兽肠道内的正常寄居菌,消费者食用被污染的食品后可造成食物中毒。本研究通过对全国食品中空肠弯曲菌的污染状况和水平进行调查,同时通过ERIC-PCR（肠杆菌基因间共有重复序列-聚合酶链式反应）的分型方法构建了空肠弯曲菌分离株的指纹图谱,旨在了解其内在关联,为预防和控制食品中空肠弯曲菌的污染提供科学依据。目前空肠弯曲菌的污染调查都局限于单个省市的定性研究,无法全面反映空肠弯曲菌在食品中的污染情况和污染水平。为了解空肠弯曲菌在全国食品中的污染状况,我们于2011年11月～2013年1月运用九管法对全国代表性城市（深圳、韶关、汕头、湛江、河源、海口、三亚、北海、南宁、福州、厦门、兰州、哈尔滨、西安、太原、北京、济南、合肥、南昌、成都、武汉、昆明、上海）的市售生鲜禽畜肉及其制品、生食蔬菜、熟食、水产品、速冻食品、奶制品、食用菌7大类1161份食品样品进行空肠弯曲菌污染的调查。根据生化和多重PCR鉴定结果,获得空肠弯曲菌19株,显示19份阳性样品全部来自于肉与肉制品中的生鲜禽肉类,检出率为1.64%（19/1161）,而其余样品均未分离到空肠弯曲菌；其中肉与肉制品的检出率达6.75%,MPN平均值达8.5,生鲜禽肉类样品是空肠弯曲菌的主要污染对象,加强生鲜禽肉类空肠弯曲菌的监控措施至关重要。国内外研究显示,ERIC-PCR作为一种分子分型手段有着不逊于随机扩增多态性（RAPD）分型、制酶长度多态性分型（RFLP）、脉冲场电泳（PFGE）分型、多位点序列分型（MLST）等其他分型技术的分辨力,而且其稳定性好、操作简单、成本低廉。本研究以ERIC核心序列设计引物,运用L16（54）正交试验,对Mg2+、dNTPs、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素在较大范围水平内进行反应体系条件摸索,得到一个初步的优化体系。在此基础之上对这3个因素（除了引物）和模板浓度、退火温度进一步小范围水平内的微调优化,得到最终的优化体系。最后以优化的ERIC-PCR方法对本实验室分离到的24株空肠弯曲菌菌株分型；同时根据API Campy生化反应结果进行生化分型,比较ERIC-PCR分子分型方法和生化分型方法。优化的反应体系中Mg2+和dNTPs浓度分别为3.0mmol/L、0.25mmol/L, TaqDNA聚合酶量为1.5U/25μL,模板用量在24-120ng/25μL之间,退火温度为35℃,优化的ERIC-PCR方法将24株空肠弯曲菌分菌株分为4簇22个基因型,该方法的分辨系数为0.920,显示了较好的分辨力。生化分型将24株空肠弯曲菌分菌株分为4簇19个生化型,显示了菌株基因的多样性。所建立的ERIC-PCR方法具有较好的稳定性及较高的分辨力,比生化分型能更好的体现菌株的遗传多样性,适用于空肠弯曲菌的分型和溯源。本研究在进行全国食品中空肠弯曲菌的污染调查后,建立起空肠弯曲菌的ERIC-PCR分子分型方法和进行了分离株的分子分型,初步掌握了食品中空肠弯曲菌的污染分布规律,为建立空肠弯曲菌的溯源图谱库打下了良好的基础。本研究对空肠弯曲菌分离株的12种毒力相关基因的分布情况进行了分析,并采用前期建立的ERIC-PCR方法对全国食品中的空肠弯曲菌分离株进行分子分型。毒力相关基因分布情况分析实验显示,毒力基因cadF、racR、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、dnaJ、 ciaB、imaA的携带率都超过50%,pldA和wlaN的携带率均为10%,而virBll的携带率为0。ERIC-PCR分析结果显示19株空肠弯曲菌可分为3簇10个基因型,在簇A中包含15个菌株,相似性在61%-100%。簇B和簇C中分别包含2个菌株,来源于不同地区不同样品,相似性在67%-80%之间,表明这4株菌亲缘关系较远。
王艳玲[8]（2010）在《空肠弯曲菌检测方法研究进展》文中进行了进一步梳理
苏惠玉,谢荣珍,牛建军[9]（2010）在《免疫磁珠捕获结合荧光PCR技术检测食品中黄曲霉菌的研究》文中进行了进一步梳理目的:研究利用免疫磁珠对食品中黄曲霉菌进行捕获的技术,为检测食品中污染的黄曲霉菌提供新方法。方法:应用山羊抗黄曲霉菌血清的免疫磁珠捕获食品中的黄曲霉菌,不需要进行增菌培养,应用磁捕获-荧光聚合酶链式反应（IMC-FPCR）技术快速检测鉴定食品中的黄曲霉菌。结果:IMC-FPCR方法检测黄曲霉菌的最低检测值为2CFU/mL。应用IMC-FPCR对从市场上购买的12种食品进行检测,发现有两份样品含有产毒素相关基因（即为可能的致癌菌株）,检出率为16.7%,其中花生中检出1株黄曲霉菌,面线中检出1株黄曲霉菌。结论:建立了黄曲霉菌的磁捕获-荧光聚合酶链式反应（IMC-FPCR）方法,该方法可用于食品中黄曲霉菌的快速检测及鉴定,实物检测结果提示市场上食品有被真菌污染。
尹衍新[10]（2010）在《基于CjaA蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及其单克隆抗体研制》文中研究说明空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,C. jejuni）是全球范围内主要的细菌性肠道病原菌,同时也是一种重要的食源性病原菌。除引起人的急性、自限性腹泻外,特定血清型的空肠弯曲菌感染可能导致严重的全身继发症,如格林-巴利综合症（GBS）。人空肠弯曲菌病散发病例主要是由于食用污染的鸡肉,因此,鸡群中空肠弯曲菌流行病学的调查结果非常有意义。传统的细菌流行病学调查虽然具有良好的特异性,但由于空肠弯曲菌的培养条件苛刻,可能出现漏检情况。血清学检测技术操作简单、敏感性高,是病原微生物感染检测的重要手段。本研究通过表达空肠弯曲菌cjaA基因,纯化重组蛋白His-CjaA、GST-CjaA,以GST-CjaA纯化蛋白为免疫原,His-CjaA为检测原制备针对CjaA的单克隆抗体;同时以纯化的His-CjaA为检测原,建立检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法。一、空肠弯曲菌cjaA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制CjaA蛋白是由空肠弯曲菌cjaA基因编码的膜转运蛋白,是空肠弯曲菌的主要保护性抗原。本研究依据GenBank上公布的cjaA基因序列设计引物,扩增目的基因,先将扩增产物构建到pUCm-T载体上经测序鉴定后,分别将目的基因构建到原核表达质粒pGEX-6p-1和pET（30а）上,构建出重组菌BL21（pGEX-6p-1-cjaA）、BL21（DE3）（pET-cjaA）。经IPTG诱导表达,利用亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白His-CjaA、GST-CjaA与预期大小一致。Western-blot试验结果证明融合蛋白具有良好的免疫生物学活性。融合蛋白GST-CjaA经纯化后,与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后,经皮下多点注射免疫,100μg/只。以后每隔2周,取与一免等剂量的免疫原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下注射加强免疫,加强免疫2次,融合前3 d腹腔注射加强免疫1次,100μg/只。按常规程序融合,以纯化蛋白His-CjaA作为检测抗原,间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得3株稳定分泌CjaA单克隆抗体（McAb）的细胞株,分别命名为2B6、3C2、4F11。单抗腹水效价分别为1×105、2×105、4×105。McAb的抗体亚类测定均为IgG1。Dot-ELISA试验表明:3株单抗只与表达CjaA的重组大肠杆菌以及空肠弯曲菌分离株反应,与其它非空肠弯曲菌不反应。Western-blot试验中,3株单抗均能与融合蛋白His-CjaA发生反应,出现特异性条带。CjaA单克隆抗体的成功研制,为进一步研究CjaA蛋白的生物学特性,建立快速检测方法奠定了基础。二、基于CjaA蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及初步应用NCBI上BLAST结果显示,13株空肠弯曲菌的cjaA基因之间的同源性在98%以上,与2株结肠弯曲菌的cjaA基因同源性在88-89%之间,与1株乌普萨拉弯曲菌的glnH基因的同源性为82%,与其他所有细菌基因库中基因的同源性在70%以下,显示出高度的保守性和特异性。PCR方法检测200株空肠弯曲菌,cjaA基因的携带率为100%。以纯化蛋白His-CjaA作为包被原,优化、确定了ELISA反应条件:抗原的最佳包被液为0.05M pH7.6的Tris盐酸缓冲液;抗原最佳包被浓度为18.76μg/ml,封闭液为10%小牛血清,封闭条件为37℃,2h,最佳血清稀释液为5%小牛血清,血清稀释倍数为1:200,最佳血清作用时间为1.5h,HRP-羊抗鸡IgG的最适工作浓度为1:10000,最佳酶标二抗作用时间为40min,显色时间为3min。应用优化的方法,对65份阴性血清的检测结果进行统计分析, OD490值大于0.46为阳性判定标准。利用建立的间接ELISA方法对人工感染空肠弯曲菌的鸡进行检测,在第3周时所有40只鸡血清中均能检测到空肠弯曲菌抗体阳性,与常规细菌鉴定方法结果一致。对8个鸡群的450份鸡血清样品进行检测,除1个鸡群血清样品阳性率为51.7%（31/60）外,其他血清样品经检测均为阳性。血清学检测方法的建立为开展空肠弯曲菌流行病学研究提供了新方法,同时为深入研究CjaA蛋白的生物学功能、致病机理提供了一种便利的工具。
二、空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究（论文提纲范文）
（1）免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验菌株及样品 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免疫磁珠制备 |
| 1.2.2 免疫磁珠富集条件优化 |
| 1.2.2. 1 免疫磁珠最适添加量的确定 |
| 1.2.2. 2 免疫磁珠与菌液最佳反应时间的确定 |
| 1.2.3 免疫磁珠捕获率 |
| 1.2.3. 1 免疫磁珠对4株沙门氏菌捕获率的比较 |
| 1.2.3. 2 背景菌对免疫磁珠捕获率的影响 |
| 1.2.4 实时荧光PCR检测 |
| 1.2.4. 1 DNA模板制备及引物、探针的合成 |
| 1.2.4. 2 实时荧光PCR反应体系 |
| 1.2.5 免疫磁珠-实时荧光PCR方法特异性 |
| 1.2.6 免疫磁珠-实时荧光PCR方法灵敏度 |
| 1.2.7 实际样品检测 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 免疫磁珠最适添加量的确定 |
| 2.2 免疫磁珠与菌液最佳反应时间的确定 |
| 2.3 免疫磁珠对4株沙门氏菌的捕获率比较 |
| 2.4 背景菌对免疫磁珠捕获率的影响 |
| 2.5 IMS-Real time PCR方法的特异性 |
| 2.6 IMS-Real time PCR方法检测虾中沙门氏菌检测限的确定 |
| 2.7 实际样品检测结果比较 |
| 3 结论 |
（2）PCR技术检测空肠弯曲菌的研究进展（论文提纲范文）
| 1引言 |
| 2空肠弯曲菌PCR检测方法研究现状 |
| 2.1常规PCR方法 |
| 2.2多重PCR(multiplexPCR)方法 |
| 2.3巢式PCR(nested-PCR)方法 |
| 2.4实时荧光定量PCR(real-timePCR)方法 |
| 2.5PCR-酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA) |
| 2.6最大几率数(mostprobablenumber,MPN)-PCR方法 |
| 2.7PCR-限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)方法 |
| 2.8PCR-变性高效液相色谱(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)方法 |
| 2.9PCR-变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)方法 |
| 2.10磁捕获-荧光PCR(immunomagneticcapturefluorescentPCR,IMC-FPCR)方法 |
| 3空肠弯曲菌PCR检测方法的对比 |
| 4结论与展望 |
（3）食源性致病菌快速检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 1引言 |
| 2免疫学检测技术 |
| 2.1酶联免疫吸附技术(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA) |
| 2.2免疫磁珠分离技术(immunomagneticseparation,IMS) |
| 2.3双功能抗体检测技术(bi-functionalantibodiesassay) |
| 3分子检测技术研究进展 |
| 3.1 PCR |
| 3.2 LAMP |
| 3.3 DHPLC |
| 4讨论 |
（4）食品中空肠弯曲菌检测技术最新进展（论文提纲范文）
| 1 常规分离鉴定方法 |
| 2 核酸检测方法 |
| 2.1 基因芯片 |
| 2.2 多重PCR |
| 2.3 套式PCR |
| 2.4 PCR-ELISA |
| 2.5 Real-time PCR |
| 3 免疫学检测方法 |
| 3.1 IMC-FPCR |
| 3.2 ELISA |
| 4 噬菌体受体蛋白捕获技术 |
| 5 展望 |
（5）弯曲菌real-time PCR技术的建立及多种定量检测方法的比较（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 第一章 综述 弯曲菌检测技术研究进展 |
| 1 传统的检测方法 |
| 1.1 基于生化反应的常规检测方法 |
| 1.2 MPN法 |
| 1.3 平板菌落计数法 |
| 1.4 螺旋接种法 |
| 2 免疫学检测方法 |
| 3 分子生物学检测方法 |
| 3.1 核酸探针检测技术 |
| 3.2 NASBA技术 |
| 3.3 DNA环介导恒温扩增技术 |
| 3.4 PCR技术 |
| 3.4.1 常规PCR方法 |
| 3.4.2 多重PCR方法 |
| 3.4.3 PCR-ELISA方法 |
| 3.4.4 巢式PCR方法 |
| 3.4.5 磁捕获-PCR方法 |
| 3.4.6 荧光定量PCR方法 |
| 4 展望 |
| 第二章 弯曲菌real-time PCR技术的建立及多种定量检测方法的比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 分子生物学软件 |
| 1.4 鸡肉淋洗样品采集与处理 |
| 1.5 鸡肉擦拭样品采集与处理 |
| 1.6 鸡肛拭样品采集与处理 |
| 2 方法 |
| 2.1 弯曲菌荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.1.1 引物、探针的设计与合成 |
| 2.1.2 荧光定量PCR反应体系 |
| 2.1.3 标准曲线的制备 |
| 2.1.4 特异性试验 |
| 2.1.5 灵敏性试验 |
| 2.1.6 重复性试验 |
| 2.1.7 模板DNA制备 |
| 2.1.8 模拟样品弯曲菌DNA回收效率试验 |
| 2.2 选择性CCDA平板菌落计数法 |
| 2.2.1 选择性CCDA平板定量检测方法 |
| 2.2.2 选择性CCDA平板定量检测方法的优化 |
| 2.3 Karmali平板菌落计数法 |
| 2.3.1 试剂和选择性培养基Karmali的配制 |
| 2.3.2 可疑弯曲菌菌落形态 |
| 2.4 弯曲菌鉴定 |
| 2.4.1 平板菌落计数法弯曲菌鉴定 |
| 2.4.2 国标方法鉴定弯曲菌 |
| 2.5 real-time PCR法、选择性CCDA平板菌落计数法与Karmali平板菌落计数法检测整鸡淋洗样品中弯曲菌的比较 |
| 2.6 real-time PCR法与选择性CCDA平板菌落计数法检测鸡肉擦拭和肛拭样品中弯曲菌的比较 |
| 2.7 选择性CCDA平板菌落计数法与Karmali平板菌落计数法检测鸡肛拭样品中弯曲菌的比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 弯曲菌荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.1.1 实时荧光定量PCR标准曲线的制备 |
| 3.1.2 实时荧光定量PCR的特异性试验 |
| 3.1.3 实时荧光定量PCR的灵敏度试验 |
| 3.1.4 实时荧光定量PCR的重复性试验 |
| 3.1.5 DNA模板的制备 |
| 3.1.6 模拟样品弯曲菌DNA回收效率试验 |
| 3.2 弯曲菌选择性CCDA平板定量检测方法的优化 |
| 3.2.1 不同浓度抗生素CCDA培养基分离禽肉中弯曲菌的效果比较 |
| 3.2.2 弯曲菌定量检测方法计数的吻合度 |
| 3.3 real-time PCR法、选择性CCDA平板菌落计数法与Karmali平板菌落计数法检测整鸡淋洗样品中弯曲菌的比较 |
| 3.4 real-time PCR法与选择性CCDA平板菌落计数法检测鸡肉擦拭和肛拭样品中弯曲菌的比较 |
| 3.5 选择性CCDA平板菌落计数法与Karmali平板菌落计数法检测鸡肛拭样品中弯曲菌的比较 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）猪、鸡弯曲菌的分离鉴定和耐药性分析及空肠弯曲菌LAMP检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 弯曲菌简介 |
| 1.2 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分型 |
| 1.2.1 生物学分型 |
| 1.2.2 血清学分型 |
| 1.2.3 基因分型[20] |
| 1.3 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的流行病学现状 |
| 1.3.1 国内外流行现状 |
| 1.3.2 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的耐药性调查研究 |
| 1.3.3 空肠弯曲菌检测方面的研究进展 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 研究内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 实验技术路线 |
| 1.6 研究目标 |
| 第二章 猪、鸡弯曲菌的分离鉴定及耐药性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.1.4 样品采集与处理 |
| 2.1.5 细菌分离鉴定与药敏试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 弯曲菌 PCR 检测结果 |
| 2.2.2 弯曲菌分离鉴定结果 |
| 2.2.3 畜禽带菌情况和药敏试验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 空肠弯曲菌 LAMP 检测方法的研究 |
| 3.1 试剂与器材 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验器材 |
| 3.2 LAMP 引物筛选及体系的优化方法 |
| 3.2.1 模板的制备 |
| 3.2.2 引物设计及筛选 |
| 3.2.3 引物浓度的优化 |
| 3.2.4 Mg~(2+)浓度优化 |
| 3.2.5 dNTP 浓度优化 |
| 3.2.6 甜菜碱浓度优化 |
| 3.2.7 Bst DNA Polymerase 浓度优化 |
| 3.2.8 时间对 LAMP 的影响 |
| 3.2.9 温度对实验的影响 |
| 3.2.10 优化反应条件和反应体系后 LAMP 检测方法的建立 |
| 3.2.11 LAMP 的灵敏度实验 |
| 3.2.12 LAMP 特异性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 引物选择结果 |
| 3.3.2 引物优化结果 |
| 3.3.3 MgSO4 浓度的优化结果 |
| 3.3.4 dNTP 浓度的优化结果 |
| 3.3.5 甜菜碱浓度的优化结果 |
| 3.3.6 Bst DNA Polymerase 酶用量的优化结果 |
| 3.3.7 时间对 LAMP 影响的结果 |
| 3.3.8 温度对实验影响的结果 |
| 3.3.9 优化反应条件和反应体系后建立的 LAMP 检测方法 |
| 3.3.10 空肠弯曲菌 LAMP 灵敏度检测结果 |
| 3.3.11 LAMP 方法特异性检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（7）食品中空肠弯曲菌的污染分布规律及遗传多样性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 空肠弯曲菌在食品中的污染状况 |
| 1.2.1 禽肉 |
| 1.2.2 猪肉、牛肉 |
| 1.2.3 其它食品 |
| 1.3 分子检测方法研究进展 |
| 1.3.1 多重PCR |
| 1.3.2 荧光定量PCR |
| 1.3.3 LAMP法 |
| 1.3.4 其它 |
| 1.4 分子分型技术研究 |
| 1.4.1 多位点序列(MLST)分型 |
| 1.4.2 脉冲场电泳(PFGE)技术 |
| 1.4.3 限制酶长度多态性(RFLP) |
| 1.4.4 随机扩增多态性(RAPD) |
| 1.4.5 肠道基因间重复序列(ERIC) |
| 1.5 空肠弯曲菌侵袭过程中毒力相关基因 |
| 1.5.1 粘附基因cadF |
| 1.5.2 粘附定植相关基因racR |
| 1.5.3 鞭毛蛋白基因flaA |
| 1.5.4 细胞致死性扩张毒素基因cdt |
| 1.5.5 LOS合成相关基因wlaN |
| 1.5.6 质粒基因virB11 |
| 1.5.7 侵入抗原蛋白基因ciaB |
| 1.5.8 磷脂酶活性蛋白基因pldA |
| 1.5.9 热休克蛋白基因dnaJ |
| 1.5.10 侵袭相关ATP酶基因imaA |
| 1.6 展望 |
| 2 本研究的主要研究内容及目标 |
| 2.1 本研究的主要目的 |
| 2.2 本研究的内容和技术路线 |
| 2.2.1 全国食品中空肠弯曲菌的污染调查 |
| 2.2.2 建立空肠弯曲菌的ERIC-PCR分型方法 |
| 2.2.3 全国食品中空肠弯曲菌的毒力相关基因分析和ERIC-PCR分型 |
| 2.2.4 技术路线 |
| 2.3 课题资助 |
| 第二章 全国食品中空肠弯曲菌污染的分布规律 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 样品来源 |
| 1.1.3 培养基和试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 空肠弯曲菌的MPN检测和分离鉴定 |
| 1.2.2 空肠弯曲菌的PCR分子鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 食品样品中空肠弯曲菌的污染状况 |
| 2.2 禽畜类肉与肉制品中空肠弯曲菌的检出情况及MPN值 |
| 2.3 Multiplex PCR分子鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 样品处理、增菌及分离 |
| 3.2 空肠弯曲菌的鉴定 |
| 3.3 市售食品中空肠弯曲菌的污染情况和MPN值 |
| 第三章 空肠弯曲菌的ERIC-PCR分型和生化分型的比较研究 |
| 1材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 培养基和试剂 |
| 1.1.3 主要器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验菌株DNA的提取 |
| 1.2.2 实验引物的设计和合成 |
| 1.2.3 ERIC-PCR体系试验范围的摸索 |
| 1.2.4 ERIC-PCR条件优化试验 |
| 1.2.5 ERIC-PCR反应体系的稳定性试验 |
| 1.2.6 ERIC-PCR反应体系的应用 |
| 1.2.7 空肠弯曲菌分离株的生化分型 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 正交试验结果 |
| 2.2 ERIC-PCR体系优化试验 |
| 2.2.1 模板量的确定 |
| 2.2.2 Mg~(2+)浓度的确定 |
| 2.2.3 TaqDNA酶量的确定 |
| 2.2.4 dNTPs浓度的确定 |
| 2.2.5 退火温度的确定 |
| 2.3 ERIC-PCR体系的建立及稳定性 |
| 2.4 ERIC-PCR反应体系的应用 |
| 2.5 空肠弯曲菌分离株生化分型的结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 空肠弯曲菌分离株的ERIC-PCR分型和毒力相关基因分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 分离株来源 |
| 1.1.2 试剂和仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 DNA的提取 |
| 1.2.2 空肠弯曲菌分离株的ERIC-PCR分子分型 |
| 1.2.3 毒力基因PCR扩增 |
| 2 结果 |
| 2.1 空肠弯曲菌的ERIC-PCR分子分型 |
| 2.2 毒力相关基因分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本研究取得的主要结论及创新点 |
| 5.1.1 主要结论 |
| 5.1.2 创新点 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生在学期间发表的相关学术论文 |
| 致谢 |
（8）空肠弯曲菌检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 传统检测方法 |
| 2 直接涂片染色检查法 |
| 3 一些改良的培养方法 |
| 4 免疫学方法 |
| 5 PCR及与PCR有关的方法 |
（9）免疫磁珠捕获结合荧光PCR技术检测食品中黄曲霉菌的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 菌种与培养基 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 真菌培养 |
| 1.4.2 免疫磁珠捕获方法的建立 |
| 1.4.3 IMC-FPCR检测黄曲霉菌 |
| 1.4.4 IMC-FPCR检测灵敏度 |
| 1.4.5 IMC-FPCR法检测实物样品 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 食品中真菌的培养结果 |
| 2.2 免疫磁珠捕获目的菌结果 |
| 2.3 荧光PCR法检测目的菌结果 |
| 2.4 灵敏度实验结果 |
| 2.5 IMC-FPCR法检测实物样品结果 |
| 3 结论 |
（10）基于CjaA蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及其单克隆抗体研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 空肠弯曲菌检测技术进展 |
| 1. 基于生化反应的常规检测方法 |
| 2. 常规检测方法的改良 |
| 3. 基于免疫学技术的新型检测方法 |
| 3.1 常规免疫学检测方法 |
| 3.2 免疫磁珠 |
| 3.3 电化学免疫传感器 |
| 4. 基于分子生物学的新型检测方法 |
| 4.1 核酸探针 |
| 4.2 PCR 技术 |
| 4.3 NASBA 技术 |
| 4.4 LAMP 技术 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 空肠弯曲菌cjaA 基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR 扩增cjaA 基因 |
| 1.2.2 PCR 产物的克隆、鉴定 |
| 1.2.3 重组原核表达质粒pGEX-6p-1-cjaA、pET-cjaA 的构建与鉴定 |
| 1.2.4 cjaA 基因在重组菌中的表达及蛋白纯化 |
| 1.2.5 抗血清制备 |
| 1.2.6 表达产物的免疫生物学活性测定 |
| 1.2.7 免疫原和检测原的制备 |
| 1.2.8 动物免疫 |
| 1.2.9 细胞融合 |
| 1.2.10 阳性克隆的筛选 |
| 1.2.11 单抗腹水制备 |
| 1.2.12 单抗生物学特性鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 cjaA 基因的扩增及重组质粒构建 |
| 2.2 重组菌表达产物的SDS-PAGE 分析 |
| 2.3 多抗血清效价 |
| 2.4 表达产物的免疫生物学活性测定 |
| 2.5 单克隆抗体筛选方法的建立 |
| 2.6 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.7 单抗生物学特性 |
| 2.8 单抗特异性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于CjaA 蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA 方法建立及初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 CjaA 蛋白同源性分析 |
| 1.2.2 200 株空肠弯曲菌中cjaA 基因检测 |
| 1.2.3 His-CjaA 蛋白阳性血清制备 |
| 1.2.4 间接ELISA 检测空肠弯曲菌抗体方法的建立与优化 |
| 1.2.5 间接ELISA 方法阳性临界值的确定 |
| 1.2.6 特异性试验 |
| 1.2.7 鸡人工感染空肠弯曲菌后不同时间血清抗体测定 |
| 1.2.8 重复性试验 |
| 1.2.9 间接ELISA 方法的初步应用 |
| 2 结果 |
| 2.2.1 CjaA 蛋白同源性分析 |
| 2.2.2 200 株空肠弯曲菌中cjaA 基因检测结果 |
| 2.2.3 His-CjaA 阳性血清的制备 |
| 2.2.4 间接ELISA 方法的建立与优化 |
| 2.2.5 间接ELISA 方法操作程序的确定 |
| 2.2.6 间接ELISA 方法阳性临界值的确定 |
| 2.2.7 特异性实验 |
| 2.2.8 鸡人工感染空肠弯曲菌抗体测定 |
| 2.2.9 重复性实验 |
| 2.2.10 间接ELISA 方法的初步应用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间发表的文章目录 |
四、空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究（论文参考文献）
- [1]免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌[J]. 李亚茹,周冬根,夏杏洲,曹怡芳,杨慧宁,胡双芳,肖性龙. 现代食品科技, 2017(11)
- [2]PCR技术检测空肠弯曲菌的研究进展[J]. 陈金,毕水莲. 食品安全质量检测学报, 2015(09)
- [3]食源性致病菌快速检测技术研究进展[J]. 宋丽萍,姜洁,李玮,陶庆会,郭淼,路勇. 食品安全质量检测学报, 2015(09)
- [4]食品中空肠弯曲菌检测技术最新进展[J]. 胡元庆,李凤霞. 食品工业科技, 2014(13)
- [5]弯曲菌real-time PCR技术的建立及多种定量检测方法的比较[D]. 朱佳琪. 扬州大学, 2013(04)
- [6]猪、鸡弯曲菌的分离鉴定和耐药性分析及空肠弯曲菌LAMP检测方法的研究[D]. 许紫建. 河北农业大学, 2013(03)
- [7]食品中空肠弯曲菌的污染分布规律及遗传多样性研究[D]. 郑扬云. 广东工业大学, 2013(10)
- [8]空肠弯曲菌检测方法研究进展[J]. 王艳玲. 职业与健康, 2010(14)
- [9]免疫磁珠捕获结合荧光PCR技术检测食品中黄曲霉菌的研究[J]. 苏惠玉,谢荣珍,牛建军. 食品科学, 2010(10)
- [10]基于CjaA蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及其单克隆抗体研制[D]. 尹衍新. 扬州大学, 2010(02)