一、鸡球虫亚单位苗研究进展（论文文献综述）
程振扬[1]（2021）在《柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价》文中研究指明鸡球虫病是一种呈全球性分布的寄生性原虫病,其病原有7种,其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和毒害艾美耳球虫（E.necatrix）的致病性最强,分别引起鸡的急性盲肠球虫病和小肠球虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前,鸡球虫病的防治措施主要有在饲料或饮水添加药物和接种活虫苗两种方法。长期添加药物已引起耐药、污染环境和危害肉蛋品质等问题。活虫苗虽可产生较强的免疫保护效果,但存在着扩散病原、毒力返强等缺点,且生产成本较高,对免疫后鸡群的饲养管理要求较高。而基因工程疫苗可以解决这些难题。本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白Etgam22和Etgam59基因进行了克隆与原核表达,获得的重组蛋白rEtGAM22和rEtGAM59能被柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染鸡的康复血清识别,可提高免疫鸡的平均增重、降低卵囊产量。在此基础上,本研究利用杆状病毒表达系统对Etgam22基因进行表达,通过动物试验评价其对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力,并与原核表达的重组蛋白进行比较,最后通过动物试验评价rEtGAM22和rEtGAM59联合免疫的保护效果,为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析将优化后的Etgam22基因插入转座载体pFastbac1构建重组质粒,命名为pFastbac1-Etgam22;然后将pFastbacl-Etgam22转化到DH1OBac感受态细胞,构建重组杆状病毒穿梭载体,命名为Bacmid-Etgam22;将Bacmid-Etgam22转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,命名为reBac-Etgam22。重组杆状病毒在Sf9细胞诱导表达,获得真核表达蛋白rEtGAM22-e,其大小约35 kDa。用IFA检测结果显示重组蛋白能被抗原核表达蛋白rEtGAM22-p多克隆抗体识别;Western blot检测结果显示重组蛋白可被鼠抗His单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示真核表达蛋白rEtGAM22-e具有良好的反应原性和交叉反应原性。2.真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析以黄羽鸡为试验动物,主要以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数、血清抗体水平等为指标,评价杆状病毒表达蛋白rEtGAM22-e对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果,并与原核表达蛋白rEtGAM22-p和rEtGAM59相比较。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:免疫组成活率均为100%,未免疫攻虫组为90%;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e组平均增重稍次于重组蛋白rEtGAM59组,但高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组病变记分高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组和rEtGAM59组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组卵囊减少率高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组;原核表达蛋白rEtGAM59组ACI最高,为158.83;真核表达蛋白rEtGAM22-e组血清抗体水平显着高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组。（2）对毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但ACI值要低。结论:rEtGAM22和rEtGAM59对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫能产生一定的免疫保护力;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e免疫保护力稍高于原核表达的重组蛋白rEtGAM22-p;重组蛋白rEtGAM59免疫保护效力高于重组蛋白rEtGAM22。3.重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析按上一章方法,评价rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:各试验组存活率均为100%;除rEtGAM22-e单免组外,其余各免疫组的平均增重均显着大于未免疫攻虫组（P<0.05）,且与未免疫未攻虫组相比差异不显着（P>0.05）;联合免疫低剂量组病变记分最低;联合免疫组卵囊减少率相近,分别为46.21%和44.70%,高于单免组;联合免疫组的抗球虫指数分别为153.43和157.65,高于单免组;联合免疫组的血清抗体水平显着高于单免组（P<0.05）。（2）对攻毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但抗球虫指数分别为158.28和160.34。结论:rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫保护效力高于单一重组蛋白免疫,联合免疫剂量100 μg（50+50）的保护效力要好于200 μg（100+100）剂量。
刘悦[2]（2021）在《柔嫩艾美耳球虫配子体基因Etgam56的克隆表达与免疫保护分析》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳球虫感染引起的寄生性原虫病,在全球范围内流行,给家禽养殖业造成重大的经济损失。基于药物防治诱发的耐药虫株和药物残留等问题,现阶段球虫病的防治开始逐渐由依靠化学药物转向免疫预防。球虫生活史复杂,不同发育阶段存在不同抗原,其中有性生殖阶段的配子体抗原,已被报道具有良好的免疫原性。本文克隆了柔嫩艾美耳球虫配子体抗原基因Etgam56,进行了基因序列分析,并对该基因所编码蛋白的特异性、抗原性、表达情况、虫体内定位、免疫保护效果等进行了分析,旨为球虫亚单位疫苗的研究奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因的克隆与序列分析提取柔嫩艾美耳球虫（扬州株）配子体基因组DNA,PCR扩增Etgam56基因的全长为1425 bp,为一个完整阅读框,共编码474个氨基酸,预测蛋白大小为53.74 kDa,等电点（PI）为4.92,抗原决定簇在线软件预测该蛋白含有9个抗原决定簇,并含有一个丝氨酸和酪氨酸富集区和一个脯氨酸和甲硫氨酸富集区。与其他艾美耳球虫配子体基因序列比对结果显示,与毒害艾美耳球虫配子体基因Engam56的同源性最高,为87.9%。综合以上结果以及艾美耳球虫配子体基因高度保守的特点,证实本试验扩增的Etgam56基因为配子体蛋白编码基因。2.柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因的原核表达和抗原性分析经克隆和序列分析后,去除信号肽,根据大肠杆菌的密码子偏嗜性优化基因序列,Etgam56基因连接至pET28a（+）,构建原核表达载体pET28a（+）-Etgam56,优化体外诱导表达条件,Western-blot分析重组蛋白抗原性。结果显示,体外表达重组蛋白的大小约为56 kDa,在0.10 mM IPTG,37℃,3h的诱导条件下表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在。该体外重组表达的蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体、小鼠抗重组蛋白多克隆抗体、鸡柔嫩艾美耳球虫病康复血清和鸡毒害艾美耳球虫病康复血清识别,表明该重组蛋白为特异性表达的蛋白,具有很好的抗原性和交叉反应性。3.柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因在不同发育阶段虫体内的表达与定位分析柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1×104个,经口感染4周龄无球虫感染的黄羽肉鸡,采集感染后 96 h、108 h、120 h、132 h、144 h、156 h、168 h、180 h、192 h 的盲肠组织,一部分用于提取总RNA并转录成cDNA,进行相对定量Real-time PCR;一部分用于制备石蜡切片,常规H.E.染色观察虫体的发育情况,同时,以鼠抗rEtGAM56多克隆抗体为一抗,以FITC标记的羊抗鼠IgG单抗为二抗,进行激光共聚焦免疫荧光定位分析,观察重组蛋白在虫体内的定位。试验结果显示,Etgam56基因在配子体阶段特异性表达,其编码的蛋白位于大配子体内的成壁体上,参与了卵囊壁的形成。4.柔嫩艾美耳球虫重组配子体蛋白rEtGAM56的免疫保护效果分析大量表达与纯化重组蛋白,设置三个不同剂量,免疫6日龄黄羽肉鸡,14日龄加强免疫一次,21日龄时每只鸡攻击1.0×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,通过平均增重、病变记分、卵囊产量等评价指标,对重组蛋白的免疫保护效果进行分析。结果显示,重组蛋白免疫的鸡群能够在一定程度上降低卵囊产量,盲肠病变等,综合分析显示200 μg/只重组蛋白免疫组的保护效果最佳。
高阳[3]（2021）在《毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究》文中研究表明鸡球虫病是由顶复门（Apicomplexa）、艾美耳属球虫（Eimeria）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,其中毒害艾美耳球虫（E.necatrix）是鸡球虫病的主要病原,主要危害8～18周龄的青年鸡,可引起鸡的急性小肠球虫病,导致育成鸡的大批死亡。近年来,随着饲养周期相对较长的黄羽鸡饲养量不断攀升,以及鸡球虫病活疫苗的使用,毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病越来越多见。目前鸡球虫病的防治主要依赖药物,但随着耐药性虫株、药物残留肉蛋、病原污染环境等问题的出现,迫切需要寻找一种有效、安全的方法来替代抗球虫药。艾美耳球虫为单宿主寄生虫,其发育经历孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖三个阶段。孢子生殖在外界环境中进行,形成具有感染性的孢子化卵囊。裂殖生殖和配子生殖在鸡肠道上皮细胞内进行,最终形成未孢子化卵囊,并随鸡粪便排出体外。孢子化卵囊被鸡食入后,释放出孢子囊,后者在肠道中释放出子孢子。子孢子入侵肠上皮细胞,进行裂殖生殖,产出裂殖子,后者再次侵入肠上皮细胞,开始新一轮的裂殖生殖。经2～3代裂殖生殖后,裂殖子进入配子生殖。由此可见,子孢子与裂殖子入侵宿主细胞是球虫建立和完成寄生生活的关键点。鉴定与解析参与这些关键点的分子及其作用机制,将有助于发现防控鸡球虫的新策略。迄今,关于顶复门原虫入侵宿主细胞的关键分子和机制主要来源于对疟原虫（Plasmodium spp.）和弓形虫（Toxoplasma gondii）的研究,对艾美耳球虫的研究甚少。本文通过对毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组学和蛋白质组的比较分析,鉴定差异表达基因和差异表达蛋白,筛选虫体入侵相关分子,并选择关键基因进行原核表达和功能分析,研究结果将有助于阐明球虫入侵宿主细胞的分子机制以及发现药物治疗靶点或疫苗候选抗原。一、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的转录组学比较研究分离纯化未孢子化卵囊（UO）、子孢子（SZ）和第二代裂殖子（MZ-2）,分别提取RNA,构建测序文库,进行高通量测序。基于PacBio平台三代全长转录组测序,UO、SZ 和 MZ-2 分别获得 9 305 110、8 423 031、6 756 870 条 Subreads,34 932、23040、21 923条转录本,4949,4254,4007个基因;UO发生3’端可变剪接基因数目最多（27.5%）,SZ 和 MZ-2 发生 5’端最多（19.09%、23.93%）;UO、SZ、MZ-2 的 mRNA3’端分别有955、797、840个基因含有单个poly-A位点;分别鉴定到1958（UO）、1743（SZ）、1416（MZ-2）个新基因,26810（UO）、17804（SZ）、17151（MZ-2）个新转录本;转录因子分析显示,UO、SZ和MZ-2分别有194、159和84条转录本支持10个、11个和8个转录因子家族;在UO、SZ、MZ-2中,分别鉴定到5223、3581、2039条长链非编码RNA,3835、4019、2588个融合转录本。基于Illumina平台二代转录组学测序,分别获得 71 298 596（UO）、73 222160（SZ）和 70203 690（MZ-2）条 Raw reads,8376（SZ vs UO）、6905（SZ vs MZ-2）和 7902（MZ-2 vs UO）个差异表达基因;GO富集分析显示,在SZ vs UO间有6237个DEGs显着富集到113条GO条目,在SZ vs MZ-2间有5076个DEGs显着富集到9条GO条目,在MZ-2 vs UO间有5833个DEGs显着富集到102条GO条目;KEGG富集分析显示,在SZ vs UO间有664个DEGs显着富集到13条信号通路,在SZ vs MZ-2间有1324个DEGs显着富集到31条信号通路,在MZ-2 vs UO间有987个DEGs显着富集到14条信号通路。筛选获得了123个差异表达基因与子孢子入侵宿主细胞相关,50个基因在SZ阶段上调表达,73个基因在UO阶段上调表达。二、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的蛋白质组学比较研究分别提取UO、SZ、MZ-2的总蛋白,采用iTRAQ定量标记,进行蛋白质组学测序。共鉴定到983 835个二级谱图,26 410条肽段,3606个蛋白。用GO、KEGG、IPR、KOG四个数据库注释,分别获得1725、2143、2386、1724个蛋白。蛋白差异分析显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间分别鉴定到388、300、592个差异蛋白（DEPs）。GO富集分析,在SZ vs UO间有166个DEPs显着富集到38个GO条目,在MZ-2 vs UO间有105个DEPs显着富集到20个GO条目,在MZ-2 vs UO间有200个DEPs显着富集到11个GO条目。KEGG富集分析显示,在SZ vs UO间有89个差异蛋白显着富集到102条信号通路,在SZ vs MZ-2间有52个DEPs显着富集到72条信号通路,在MZ-2 vs UO间有105个DEPs显着富集到125条信号通路。差异表达蛋白结构域富集分析显示,在SZ vs UO间有47个DEPs富集到66个结构域,在SZ vs MZ-2间有32个DEPs富集到43个结构域,在MZ-2 vs UO间有64个DEPs富集到84个结构域。差异表达蛋白互作分析显示,在SZ vs UO间有273个蛋白686条蛋白互作反应线,在SZ vs MZ-2间有153个蛋白230条蛋白互作反应线,在MZ-2 vs UO间有321个蛋白864条蛋白互作反应线。筛选获得了 103个差异蛋白与虫体入侵相关。三、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组和蛋白组联合分析基于转录组和蛋白组的联合分析结果显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间转录组和蛋白组表达量person关联系数分别为0.086、0.297和0.317;在mRNA水平与蛋白水平上,关联基因除表达趋势一致外还存在多种表达模式。对转录组和蛋白组相互关联的差异表达基因分析显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间的差异表达基因数分别为292、159和391个,这些差异表达基因富集到核酸结合、小分子结合、转移酶活性、辅因子结合、氧化还原酶活性等GO条目,参与内质网中蛋白质加工、氨酰基tRNA的生物合成、谷胱甘肽代谢、丙酸酯代谢、碳代谢、氨基酸生物合成、过氧化物酶体等信号通路。筛选获得了 68个关联的差异表达基因与虫体入侵相关。四、毒害艾美耳球虫SAG、P25和MIC13基因的原核表达及免疫荧光定位分析用RT-PCR克隆3个虫体入侵相关差异表达基因—表面抗原基因（EnSAG）、P25蛋白基因（Enp25）和微线体蛋白13基因（EnMIC13）,并用pET28a（+）载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达。重组蛋白rEnSAG、rEnp25和rEnMIC13 大小分别为 26 kDa、23 kDa 和 19 kDa,其中 rEnSAG 和 rEnMIC13 以包涵体形式存在,rEnp25表达于上清。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后免疫小鼠,制备鼠抗血清。Western blot检测显示,3种重组蛋白均被6 × HIS标签单抗和鼠抗血清特异性识别。用鼠抗血清检测MZ-2中天然蛋白,结果均检测到天然蛋白。免疫荧光定位结果显示,EnSAG蛋白分布在SZ和MZ-2胞质内,Enp25蛋白分布在SZ虫体一端和MZ-2胞质内,EnMIC13蛋白分布在SZ和MZ-2胞质内。实时荧光定量PCR检测显示,EnSAG基因在SZ高表达,Enp25基因在UO高表达,EnMIC13基因在MZ-2高表达。Western blot检测蛋白表达量显示,EnSAG蛋白和Enp25蛋白在SZ和MZ-2均高表达,且在MZ-2表达量最高;EnMIC13蛋白仅在MZ-2表达,但表达量相对较低。五、重组蛋白rEnSAG、rEnP25和rEnMIC13的免疫保护效果评价将3种重组蛋白分别与佐剂混合后,制备免疫原。每种蛋白分别设高、中、低（200、100、50 μg/羽）三个剂量组,同时设未免疫攻虫组（阳性对照组）和未免疫未攻虫组（阴性对照组）。二免后7d,除阴性组外,其余各试验组攻虫。以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率为指标,评价重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,rEnSAG中剂量组、rEnp25高剂量组和rEnMIC13高剂量组的免疫保护效果较好,与阳性对照组相比,免疫组的病变记分降低,卵囊产量减少,平均增重增加。
徐向东[4]（2021）在《鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用》文中指出鸡球虫病是由艾美耳球虫（Eimeria spp.）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,常为混合感染。各种鸡球虫的流行病学、致病性、免疫原性以及对药物敏感性不尽一致。因此,对鸡球虫种类鉴定与流行病学调查有助于鸡球虫病的防控。鸡球虫种类鉴定的传统方法,主要根据卵囊形态、虫体寄生部位、眼观病变特征、潜在期等生物学特征,这不仅要饲养无球虫感染的雏鸡,而且鉴定过程费时费力。为此,本文根据鸡球虫核糖体DNA内转录间隔区1（ITS-1）序列设计7对种特异性引物,建立鉴定鸡球虫种类的单重PCR与多重PCR方法;构建球虫ITS-1重组质粒,以重组质粒DNA为球虫rDNA阳性标准品;最后用多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫流行病学调查。本研究建立的方法为鸡球虫病的防控提供了技术手段。1.鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立根据GenBank中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）巨型艾美耳球虫（E.maxima）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）的ITS-1序列,设计7对种特异性引物,以7种鸡球虫的全基因组DNA为模板,分别进行PCR扩增,优化反应条件,建立7种球虫的单重PCR方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每对引物均能扩增出特异性条带,其大小分别为278bp（柔嫩艾美耳球虫）、383bp（毒害艾美耳球虫）、476bp（堆型艾美耳球虫）、220bp（巨型艾美耳球虫）、390 bp（早熟艾美耳球虫）、350bp（和缓艾美耳球虫）和311 bp（布氏艾美耳球虫）,其最小检测浓度为0.01 ng。在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的方法具有很强特异性和较高敏感性。2.鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立在7种鸡球虫中,柔嫰、堆型和巨型艾美耳球虫在临床上最常见;柔嫰、毒害和布氏艾美耳球虫致病性大,均在盲肠中形成卵囊,且卵囊形态相似;早熟、和缓和堆型艾美耳球虫潜在期相近,卵囊形态相似。快速鉴别这些球虫种类,有助于鸡球虫病的准确诊断与防控。为此,应用上述鸡球虫虫种特异性引物,建立了能同时鉴定3种鸡球虫的多重PCR方法,并分别对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每个多重PCR反应中的3对引物均能扩增出其特异性条带,其最小检测浓度为0.01 ng,其敏感性与单重PCR一致,在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的多重PCR方法具有很强特异性和较高敏感性。3.鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中的应用纯化7种鸡球虫的单重PCR扩增产物,分别连接到pGEM-TEasy载体中,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选及限制性酶切分析,获得含ITS-1序列的重组质粒;对重组质粒中插入的片段进行测序,用MegAgin 7.1.0软件进行序列分析,并采用邻位相连法（Neighbor-joiningmethod,NJ）构建系统发育进化树;分别以含鸡球虫ITS-1序列的重组质粒DNA为模板,对应已知球虫的卵囊DNA为阳性对照,用上述特异性引物进行PCR扩增,验证构建的7种鸡球虫重组质粒作为球虫rDNA阳性标准品的可能性。结果显示,柔嫩、毒害、巨型、堆型、早熟、和缓和布氏艾美耳球虫的ITS-1 片段大小分别为 278 bp、383 bp、220 bp、476 bp、390 bp、350 bp、311 bp,经系统发育进化树分析,均与GenBank中相应虫种处于同一分枝,表明重组质粒DNA可用作球虫rDNA 阳性标准品。4.多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用采用饱和盐水漂浮法和多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫种类调查。结果显示,饱和盐水漂浮法检查,65%（13/20）养殖户和64.5%（20/31）鸡群感染球虫;多重PCR检测,75%（15/20）养殖户和70.9%（22/31）鸡群感染球虫;共检测到7种球虫,柔嫩艾美耳球虫感染率为64.5%（20/31）,毒害艾美耳球虫为38.7%（12/31）,堆型艾美耳球虫为35.5%（11/31）,早熟艾美耳球虫为45.2%（14/31）,巨型耳艾美球虫为19.4%（6/31）,和缓艾美耳球虫为19.4%（6/31）,布氏艾美耳球虫为12.9%（4/31）;优势种为柔嫩艾美耳球虫;布氏艾美耳球虫感染率最低;球虫均为混合感染（100%）,混合感染2种球虫最多,为36.3%（8/22）。地面圈养鸡群的球虫感染率（80.0%）高于笼养（33.3%）。调查结果为该地区鸡球虫病有效防治提供了依据。
戴玉[5]（2020）在《鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究》文中进行了进一步梳理柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）是分布最广、致病力最强的几种球虫之一,严重危害养禽业,造成重大的经济损失。目前药物防治是控制球虫病的有效手段,但随着抗球虫株的产生及绿色食品概念的形成,抗球虫新型疫苗的研究成为热点。E.tenella SAG13表面抗原蛋白是基于DF-1细胞感染模型,通过分泌蛋白质组分析筛选到的一种上调表达蛋白。为探究EtSAG13是否具有分泌特性,以及是否可以作为候选疫苗抗原蛋白,本研究对EtSAG13基因进行原核表达,以E.tenella子孢子cDNA为模板进行扩增,按照GenBank的基因序列合成引物,将合成的EtSAG13基因序列连接到pET28a（+）载体上,构建了pET28a-SAG13重组质粒,并将pET28a-SAG13重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,利用IPTG诱导EtSAG13目的基因的表达;用SDS-PAGE及免疫印迹法对表达蛋白进行分析和鉴定。将EtSAG13表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,进行亚细胞定位,EtSAG13定位在E.tenella子孢子的表面,同时部分蛋白可以分泌到裂殖子细胞外,具有分泌特性。本研究将pET28a-EtSAG13亚单位疫苗组作为试验组,通过鸡球虫攻毒试验,对EtSAG13蛋白重组亚单位疫苗免疫效果进行了评价。将90只个体差异不大的雏鸡随机分成1组（EtSAG13免疫感染球虫组）、2组（不免疫不感染球虫组）、3（不免疫感染球虫组）,每组30只鸡,以比较pET28a-EtSAG13亚单位疫苗的免疫效果。7日龄时,用完全弗氏佐剂充分乳化后的蛋白对1组进行颈部皮下多点注射,免疫剂量为100μg/只,另外两组注射等量PBS;待14日龄时,用不完全弗氏佐剂等比例乳化EtSAG13蛋白进行第二次加强免疫,免疫方法同7日龄;21日龄时,对1、3组接种2万个新鲜的具有感染活性的E.tenella孢子化卵囊。免疫结果表明:pET28a-EtSAG13亚单位疫苗免疫后,鸡体的CD3+CD4+和CD3+CD8+比例显着升高,表明该免疫能诱导显着性的细胞免疫反应和体液免疫反应;在盲肠病变计分（LS）方面,EtSAG13重组蛋白免疫攻虫组（1组）的雏鸡盲肠病变计分显着低于不免疫攻虫组（3组）（p<0.05）;试验组鸡与不免疫攻虫的对照组相比增重明显,且卵囊排出量显着下降,肠道损伤明显减轻;在血清抗体检测中,EtSAG13重组蛋白免疫攻虫组（1组）的雏鸡IgG水平显着高于空白对照组和不免疫攻虫组。试验结果表明,EtSAG13蛋白定位在子孢子表面,并能够分泌到细胞外,具有分泌特性;EtSAG13蛋白亚单位疫苗能够对E.tenella感染提供一定的免疫保护力。本研究鉴定了EtSAG13蛋白的分泌特性和免疫原性,为下一步研究EtSAG13蛋白在入侵过程中的具体分子功能和研制新型鸡球虫疫苗提供基础。
赵宁宁[6]（2020）在《鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究》文中研究指明鸡球虫病是危害养鸡业最为严重的寄生虫病之一,每年给养鸡业带来巨大的经济损失。耐药虫株的出现、药物残留、鸡球虫活疫苗生产成本昂贵、散毒等问题,使鸡球虫病的防控面临更严峻的挑战。随着现代生物技术的发展,安全无毒的第三代疫苗被认为是理想的抗球虫疫苗;而筛选鉴定免疫原性强的保护性抗原和种特异性抗原是研发第三代疫苗的基础和关键。本研究应用比较免疫蛋白质组学对E.tenella特异性抗原组进行筛选鉴定;通过免疫原性试验鉴定E.tenella特异性抗原,并对其功能进行研究;为鸡球虫新型亚单位疫苗的研发提供理论依据和新思路。研究内容具体包括以下六个方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制备和鉴定本研究通过口服感染鸡球虫卵囊制备E.tenella和E.maxima高免血清,应用ELISA、Western blot、体外阻断及被动免疫等试验对抗体质量进行评价。ELISA结果显示,随着接种次数的增多,血清抗体滴度升高,且第五次接种8天后血清抗体滴度达到高峰。以制备的高免血清为一抗对裂殖子全蛋白进行Western blot分析,结果显示,E.tenella免疫血清识别的抗原种类和反应强度均高于E.maxima免疫血清。抗体阻断试验显示E.tenella高免血清对E.tenella子孢子入侵的抑制率显着高于E.maxima高免血清。被动免疫结果显示E.tenella免疫血清可提供良好的免疫保护力（ACI=181.26）,而E.maxima免疫血清只能提供有限的免疫保护（ACI=141.36）。以上结果表明本研究制备的E.tenella和E.maxima免疫血清抗体存在较大差异,可以用于后续差异免疫蛋白质组学分析。2、E.tenella特异抗原组的筛选为了系统筛选E.tenella特异性抗原组,本研究选取E.tenella裂殖子进行免疫蛋白质组分析。制备E.tenella裂殖子全蛋白,分别以E.tenella和E.maxima高免血清为一抗对其进行免疫印迹反应,共鉴定了109个差异显着的蛋白质点。选取差异倍数为2.0倍以上的蛋白点进行质谱分析,成功鉴定了36个抗原基因。为了验证组学的可靠性,本研究选取EtHSP60、EtSERPIN1、Etprofilin、EtCCT2、Etpyruvate kinase、EtMIC1、EtRACK和EtG-3-P等八个抗原基因进行原核表达;以重组蛋白质为抗原,E.tenella和E.maxima免疫血清为一抗进行Western blot分析,结果显示与免疫蛋白质组学结果符合率为83.33%。3、差异抗原功能初步分析为了对差异抗原进行初步探究,本研究从抗原基因在不同阶段的转录差异、内源性表达与定位、以及是否参与子孢子入侵等方面进行分析。RT-PCR显示上述8个基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子阶段均转录,且转录水平存在较大差异。EtCCT2、EtHSP60、EtRACK、EtProfilin、EtSERPIN1和EtG-3-P在裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段;EtPyruvate kinase在孢子化卵囊、子孢子和裂殖子具有较高的转录水平;EtMIC1在子孢子和裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段。为了进一步研究其功能,制备了鼠源多克隆抗体;以制备的多抗为一抗对子孢子和裂殖子进行间接免疫荧光分析,结果显示,8种抗原在子孢子和裂殖子虫体内均表达,且EtMIC1、EtHSP60、EtSERPIN1和EtCCT2可以定位在虫体表面,可能为膜抗原。体外阻断入侵试验显示抗EtMIC1和EtSERPIN1多克隆抗体对子孢子入侵有明显的抑制作用,抑制率分别为38.5%和36.7%;而其它多抗的抑制作用不明显。4、柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定为了对E.tenella特异性抗原进行进一步鉴定,本研究评价了E.tenella差异抗原和E.maxima同源抗原对E.tenella的免疫保护效果。成功克隆并表达了巨型艾美尔球虫EmMIC1、EmHSP60、EmSERPIN1、Emprofilin、EmCCT2、Empyruvate kinase、EmRACK和EmG-3-P基因。分别以16个重组蛋白为免疫原免疫雏鸡,评价其对E.tenella的免疫保护效果。结果显示,重组EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1、EtPyruvate kinase和EmPyruvate kinase免疫组可以显着降低由E.tenella感染引起的盲肠病变程度、卵囊排出量和体重减轻程度,可以提供良好的免疫保护力,ACI分别为180.77、171.44、173.69、171.44和167.87。EtG-3-P、EmG-3-P和EtSERPIN1可以提供有限的免疫保护力（ACI:150.94/149.55/152.56）。以上结果显示,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1和Etpyruvate kinase可以提供对E.tenella良好的免疫保护力,而只有巨型艾美尔球虫Empyruvate kinase具有较强的交叉免疫原性。因此,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1可能是E.tenella种特异性抗原,pyruvate kinase可能是E.tenella和E.maxima的共有抗原。5、特异性抗原EtCCT2功能差异分析以上研究结果表明EtCCT2是E.tenella的特异性抗原,功能上可能与EmCCT2存在较大差异。因此,本研究对EtCCT2/EmCCT2的功能进行研究。前期研究结果显示,该蛋白可以定位于虫体的表面,且与入侵无关,因此,我们猜测EtCCT2可能通过与宿主互作发挥其功能。为了验证以上猜想,本研究探究了EtCCT2/EmCCT2与宿主的相互作用。共聚焦观察结果显示EtCCT2与内源性和外源性鸡CCT4（GgCCT4）存在共定位现象;免疫共沉淀实验显示EtCCT2与内源性和外源性GgCCT4共沉淀。该结果表明EtCCT2与GgCCT4存在明显的互作关系。鸡CCT是8聚体的环状蛋白复合物,CCT2的邻位是CCT4和CCT5。那么EtCCT2是否与GgCCT5同样存在相互作用关系。为了进行验证,本研究构建了GgCCT5的真核表达质粒,与EtCCT2共转后发现EtCCT2与GgCCT5存在明显的互作关系。为了进一步研究互作对细胞的影响,我们检测互作复合物的定位情况。结果发现,互作复合物以颗粒状的形式聚集,随着时间的延长互作复合物入核,最终导致核裂解,细胞凋亡增加。EmCCT2功能分析显示,EmCCT2只与GgCCT5互作,不诱导细胞凋亡发生。另外研究发现,鸡柔嫩艾美尔球虫感染和CCT2的表达会调控宿主CCT4的表达水平。因此,EtCCT2可能是柔嫩艾美尔球虫的潜在毒力因子,可以通过与GgCCT互作调控宿主宿主细胞的进程。6、特异性抗原EtMIC1抗原表位及其关键氨基酸的鉴定利用抗EtMIC1单克隆抗体（1-A1和1-H2）,通过分段表达的方式鉴定EtMIC1的抗原表位,并对表位进行种特异性及免疫原性鉴定。通过截短表达的方式,成功鉴定了EtMIC1两个抗原表位(I:91LITFATRSK99和CTR:698ESLISAGE705)。定点突变分析显示所有的表位氨基酸是反应的必须氨基酸。序列比对显示,I表位在七种鸡球虫之间具有较大的差异;Western blot实验表明该单抗与其它种鸡艾美尔球虫表位肽之间无交叉反应原性。为了鉴定表位的免疫原性,以重组的表位肽免疫雏鸡,评价其诱导的抗鸡柔嫩艾美尔球虫的免疫效果。结果显示,I表位肽可以显着减轻柔嫩艾美尔球虫感染引起的盲肠病变、卵囊排出及鸡体重减轻情况,可以提供与EtMIC1几乎同等程度的免疫保护力。另外,I表位肽可以诱导产生高滴度的血清抗体水平,显着提高淋巴细胞转化水平和CD4+细胞的比例。以上结果表明,I表位肽具有良好的免疫原性,具有诱导体液和细胞免疫的能力,可能是柔嫩艾美尔球虫特异性抗原表位。综上所述,本研究通过比较免疫蛋白组学筛选了3个E.tenella特异性抗原和一个E.tenella和E.maxima共同抗原;鉴定了柔嫩和巨型艾美尔球虫CCT2蛋白的功能差异,初步证明该基因可能是E.tenella潜在的毒力因子;鉴定了EtMIC1关键抗原表位。这将为鸡柔嫩艾美尔球虫新型亚单位疫苗的设计和研发提供新的靶点。
汪飞燕[7]（2020）在《毒害艾美耳球虫配子体抗原的免疫保护分析》文中进行了进一步梳理鸡是具有重要经济意义的家禽品种,其生长速度快,成熟早,产代间隔短,便于人们在短期内获得量多且质优的家禽产品。在许多发达国家和发展中国家,家禽是动物蛋白的主要来源。然而,鸡球虫病的广泛传播不仅危害了动物福利,也限制了全球养鸡业的发展,毒害艾美耳球虫（E.necat）rix是鸡球虫病的重要病原,在临床上常危害8～18周龄的鸡,引起鸡的急性小肠球虫病。近年来,在我国随着生长周期较长的黄羽鸡饲养数量的不断攀升,以及采用地面平养方式,使得由毒害艾美耳球虫引起的球虫病呈上升趋势,给养鸡业带来很大的经济损失,因此开展球虫病的防治研究至关重要。已有报道,柔嫩艾美耳球虫天然配子体抗原的单克隆抗体可以有效抑制配子体的受精过程,首次证实了艾美耳球虫配子生殖阶段抗原的免疫原性,且在近几年得到了广泛的研究。本文分析了毒害艾美耳球虫不同感染剂量下的卵囊产量情况;同时,克隆表达了毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam56;通过免疫保护性试验证实,体外重组表达的全长配子体蛋白rEnGAM56（rEnGAM56-F）对毒害艾美耳球虫的感染具有一定的免疫保护效果;同时将本研究室前期已验证并高效表达的rEnGAM56截短重组蛋白（rEnGAM56-T）进行免疫保护试验,探索并比较两种重组蛋白的免疫保护效果。最后,选取3种配子体抗原联合免疫鸡群,包括rEnGAM22、rEnGAM56-T和rEnGAM59,结果显示三种蛋白同时免疫的保护效果高于两种或一种蛋白免疫,进而为球虫多价亚单位疫苗的研制和开发奠定基础。1.不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响为研究不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响,设4个感染剂量组:500、2 500、5 000和10 000个孢子化卵囊/鸡;一个无感染阴性对照组,每组5只23日龄雏鸡。经鸡嗉囊接种卵囊。感染后鸡粪便中出现卵囊起至第16天,每天用麦克马斯特氏法对各组粪便中的卵囊进行计数;在感染后第16天扑杀鸡,取盲肠进行卵囊计数。结果显示,各试验组鸡均未发生死亡,但10 000个卵囊感染组的临床症状最为严重;感染后144 h粪便中查有卵囊,500、2 500和5 000个卵囊感染组均出现2个排卵囊峰值,10 000个卵囊感染组只出现1个峰值;各感染组在第7～13天产出的卵囊量均占总产量的94.74%以上;每只鸡粪便中排出的卵囊数随感染剂量的增加而增加,但单个卵囊的产量随感染剂量的增加而减少;感染后第16天,盲肠中卵囊数不到总卵囊量的1%。试验结果显示,在疫苗生产或增殖传代时,感染剂量可选择10000个卵囊/鸡,在感染后第7～13天收集粪便中卵囊。2.毒害艾美耳球虫Engam56基因的克隆与序列分析分离纯化毒害艾美耳球虫配子体,提取基因组DNA,分3段扩增Engam56基因,插入到T载体,挑取阳性克隆测序,将3段核苷酸序列进行拼接,获取Engam56基因全长序列。试验结果表明,Engam56基因全长为1 407 bp,编码468个氨基酸,且为一个完整的开放阅读框,前20个氨基酸为信号肽,预测分子量大小约为58.0 kDa。抗原决定簇在线分析软件预测此编码蛋白共含有10个抗原决定簇,与巨型艾美耳球虫配子体蛋白EmGAM56和EmGAM82相类似,Engam56基因编码的蛋白也含有一个酪氨酸-丝氨酸和一个脯氨酸-甲硫氨酸富集区。其中,酪氨酸-丝氨酸富集区（第246～323位）位于1个完整的抗原决定簇中,且为10个抗原决定簇中最长;脯氨酸-甲硫氨酸富集区（第338～454位）内含有1个抗原决定簇。序列比对结果显示,Engam56与其他艾美耳属配子体蛋白编码基因的同源性为59.3%到99.2%。综合以上序列分析结果,扩增的Engam56基因确为配子体蛋白编码基因,且基因保守性较高。3.毒害艾美耳球虫Engam56基因的原核表达与鉴定经软件预测全长Engam56基因编码的氨基酸序列,去除信号肽,根据大肠杆菌的最适氨基酸密码子,优化合成,选取BamH I和Xho I酶切位点,插入原核表达载体pET28a（+）,命名为pET28a（+）-Engam56。常规转化表达菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。试验结果显示,重组表达的蛋白大小约为58.0 kDa左右,且主要在包涵体中表达。Western blot检测结果显示,重组表达的蛋白能够被6×HIS标签单抗特异性识别,同时能被鼠抗重组蛋白多抗和毒害艾美耳球虫病鸡康复血清识别,证实此体外重组表达的蛋白为特异性表达的蛋白,且具有较好的免疫原性。4.毒害艾美耳球虫重组配子体抗原rEnGAM56的免疫保护分析黄羽肉鸡为试验动物,以病变记分、平均增重、卵囊产量,体液抗体水平和细胞因子变化等作为评价指标,将全长Engam56基因的重组蛋白rEnGAM56-F与研究室前期已成功诱导表达的截短Engam56基因的重组蛋白rEnGAM56-T同时进行免疫保护试验,并进行比较分析。结果显示,综合病变记分、平均增重、卵囊产量,rEnGAM56-T低剂量组（50μg）的免疫效果最佳;综合体液抗体水平和细胞因子水平,rEnGAM56-T中剂量组的效果最佳,其次为rEnGAM56-T低剂量组。结论:rEnGAM56-F和rEnGAM56-T重组蛋白对鸡群均具有一定的免疫保护效果,综合检测指标,重组蛋白rEnGAM56-T免疫效果优于rEnGAM56-F,以rEnGAM56-T中剂量组和低剂量组的免疫保护效果最佳。5.毒害艾美耳球虫三种重组配子体抗原的联合免疫保护分析黄羽肉鸡为试验动物,以攻虫前后的平均增重、相对增重率;攻虫后的病变记分与卵囊减少率等作为评价指标,初步研究了重组蛋白rEnGAM22、rEnGAM56-T、rEnGAM59的免疫保护效果,并检测了重组蛋白诱导产生的特异性抗体水平。结果显示,综合病变记分、平均增重,卵囊产量,rEnGAM（22+59+56-T）组的效果最佳,其次为rEnGAM22组和rEnGAM（22+56-T）组。而在体液抗体水平和细胞因子变化检测中,rEnGAM（22+59+56-T）组最佳,其次为rEnGAM（22+56-T）组和rEnGAM22组。结论:验证了蛋白联合免疫的效果优于蛋白单独免疫,其中3种蛋白联合免疫的效果优于2种蛋白,本试验研究为球虫多价亚单位疫苗的研制奠定了理论基础。
华恩玉[8]（2020）在《堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究》文中认为鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,据不完全统计每年球虫病给家禽养殖业造成的经济损失超过30亿美元。长期以来,鸡球虫病的防控主要依赖药物。但随着球虫耐药性的不断增强以及药物残留危害食品安全,鸡球虫病的防控措施由药物防治转向疫苗免疫预防。目前,用于临床的鸡球虫病疫苗主要是活虫苗,亚单位疫苗仅见有一种,即由分离于巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）配子体的3种蛋白研制而成。堆型艾美耳球虫（E.acervulina）是养鸡场流行最广泛的鸡球虫之一,可引起鸡的亚临床球虫病,影响鸡的生长发育,降低饲料利用率。迄今,国内外对堆型艾美耳球虫配子体蛋白及其基因少有报道,其重组蛋白的免疫保护力也尚无见有报道。为此,本文对堆型艾美耳球虫配子体蛋白56基因（Eagam56）与82基因（Eagam82）进行了克隆和序列分析,分别构建了 2个基因的原核表达质粒,诱导表达后鉴定了重组蛋白的免疫原性,并经动物免疫保护试验评价了重组蛋白对堆型艾美耳球虫的免疫保护力,研究结果将为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.堆型艾美耳球虫Eagam56基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam56基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam56表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后进行诱导表达,表达产物分别进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam56基因全长为1323 bp,具有一个大小为1323 bp的完整开放阅读框,编码440个氨基酸;与Genbank上的Eagam56基因序列对比,其同源性为99.9%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam56基因含有10个抗原决定簇,其中3个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约49 kDa,以可溶蛋白形式居多,可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM56具有良好的免疫原性和交叉抗原性。2.堆型艾美耳球虫Eagam82基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam82基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam82表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后,对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam82基因全长为1704bp,具有一个大小为1704bp的完整开放阅读框,编码568个氨基酸;与Genbank上的Eagam8基因序列对比,其同源性为99.4%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam82基因含有15个抗原决定簇,其中2个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约82 kDa,以可溶蛋白形式为多;可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM82具有良好免疫原性和交叉抗原性。3.重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力以黄羽肉鸡为试验动物,以鸡的增重、相对增重率、卵囊减少率、病变记分、抗球虫指数（ACI）以及血清抗体水平等为评价指标,评价重组蛋白rEaGAM56、rEaGAM82以及2种重组蛋白联合应用的免疫保护效果。结果显示,rEaGAM56与rEaGAM82高（200 μg/鸡）、中（100 μg/鸡）剂量免疫组以及联合免疫组,鸡临床症状减轻。随着免疫剂量的增加,鸡的相对增重率与卵囊减少率增加,平均肠道病变记分减少。联合免疫高剂量组（各100 μg/鸡重组蛋白）的相对增重率与卵囊减少率达73.74%和74.27%。rEaGAM56、rEaGAM82、联合免疫高剂量组的 ACI 分别为 148.24、143.92 和 148.74。rEaGAM56的免疫保护力较rEaGAM82的强,rEaGAM56和rEaGAM82免疫鸡后均能产生血清抗体。结论:两种重组蛋白免疫均能产生一定的免疫保护力。
余水兰[9]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究》文中研究说明鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种家禽传染性寄生虫病。由于使用药物防治球虫病会产生耐药性及药物残留的问题,因此迫切需要免疫预防替代药物成为球虫病控制的主导途径。由早熟株卵囊组成的减毒活疫苗是目前应用最广泛的球虫病疫苗,但球虫活疫苗对免疫鸡的生长具有潜在不良影响。研究发现免疫增强剂不仅可增强球虫活疫苗的免疫效果,同时也可降低接种疫苗带来的不良影响。与母株相比,球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低等独特的生物学特性,但其早熟的分子机制不明。为此,本研究一方面通过笼养试验和平养试验研究盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖等对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强效果和免疫鸡增重的影响,以筛选获得每种免疫增强剂的有效剂量,为筛选球虫活疫苗的免疫增强剂奠定基础;另一面通过RNA-seq技术筛选柔嫩艾美耳球虫早熟株与母株孢子化卵囊的转录组差异,并对其中两个差异表达基因——柔嫩艾美耳球虫颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）的功能和特性进行初步分析,为探讨早熟性状产生的分子机制奠定基础。1.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验通过笼养试验评价盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖的不同剂量对柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的免疫增强效果,以筛选每种免疫增强剂的有效剂量。3日龄雏鸡进行首次免疫并服用免疫增强剂,10日龄时仅用卵囊进行二免,17日龄时用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体水平等作为评判指标。结果显示,0.05 mg～0.1 mg盐酸左旋咪唑、2.5 mg～5 mg黄芪多糖、2.5 mg～7.5 mg壳寡糖、1.25 mg酵母多糖以及10 mg地衣芽孢杆菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有免疫增强和促生长双重作用。2.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验通过平养试验对笼养试验中所获得的5种免疫增强剂的有效剂量进一步验证。3日龄雏鸡用柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊进行免疫并服用免疫增强剂,24日龄用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体、CD4和CD8分子、细胞因子（TNF-α、TGF-β1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10）水平等作为评价指标。结果显示,0.1 mg盐酸左旋咪唑可明显促进鸡CD4、CD8因子的增殖和TNF-α、IL-2的分泌,明显提高柔嫩艾美耳球虫的免疫效果,且有促生长的作用。2 mg和6 mg地衣芽孢杆菌、5 mg和7.5 mg壳寡糖、2.5 mg酵母多糖均可明显促进鸡CD8分子的增殖和TNF-α的分泌,具有免疫增强和促生长的作用。5 mg黄芪多糖对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有促生长作用,但免疫增强效果不显着,黄芪多糖对球虫具有免疫增强作用的有效剂量仍需进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析继续对本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育,经过11次的早熟株选育,潜在期由126 h缩短到107 h,缩短了19 h,与同源母株的潜在期141 h相比,缩短了34 h。通过RNA-seq技术比较了该早熟株与母株之间孢子化卵囊的转录组差异,筛选两个虫株之间的差异表达基因。结果共鉴定出差异表达基因6602个,早熟株上调表达基因3888个,下调表达基因2714个。这些差异基因主要与阳离子结合、未折叠蛋白结合、磷酸酯水解酶活性等功能相关,参与细胞内吞作用、泛素介导的蛋白水解、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工等通路。利用qPCR对转录组数据分析获得的22个差异表达基因和5个非差异表达基因进行验证,结果显示27个基因的mRNA转录水平均与RNA-seq结果一致。研究结果为探索球虫早熟性状产生的分子机制奠定基础。4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析根据转录组学结果,选取两个早熟株下调基因——柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）进行特性和功能的初步研究。结果显示,EtRON2的mRNA转录水平在孢子化卵囊中最高,未孢子化卵囊和第二代裂殖子次之,子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子、胞内子孢子和第二代裂殖子顶端棒状体的位置,以及未成熟裂殖体的细胞质中;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON3转录水平在孢子化卵囊阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,第二代裂殖子和子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子和胞内子孢子顶端棒状体的位置,第二代裂殖子的胞质以及未成熟裂殖体的表面;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON2和EtRON3在早熟株孢子化卵囊中转录水平均明显低于母株,与转录组学分析的结果一致,这提示EtRON2和EtRON3与早熟性状的产生有着一定的关系。但是EtRON2和EtRON3在球虫入侵以及发育调节中的作用仍需深入研究。
陈欢[10]（2020）在《鸡球虫重组双价疫苗的制备及其效果评价》文中认为田间鸡球虫感染多为混合感染,为了更好防控鸡巨型和柔嫩艾美球虫的混合感染,本试验制备了巨型和柔嫩艾美鸡球虫共同抗原IMP1C与免疫佐剂EDA结合的双价亚单位疫苗,并对其产生的免疫效果进行评价。方法:将巨型艾美尔球虫和柔嫩艾美尔球虫的共同抗原IMP1C分别与EDA分子佐剂结合,构建p ET28a-EDA-Et IMP1C、p ET28a-EDA-Em IMP1C、p ET28a-Em IMP1C-EDA-Et IMP1C及p ET28a-EDA四种重组质粒并进行原核表达。将表达后的蛋白按150μg/只的剂量对试验鸡（12只/组）进行三次肌肉注射,并分次采取免疫后一周的血清进行IL-12、IL-2、IFN-γ、Ig G等细胞因子的检测,采取三免的全血进行CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群检测。在三次免疫后,对试验鸡分组饲喂2×104个柔嫩艾美尔球虫及巨型艾美尓球虫孢子化卵囊,攻毒后第5天剖解观察病变并制作病理切片,收集攻毒后5～10天的粪便采用麦克马斯特计数法对球虫卵囊计数,观察并记录死亡数量,称量攻毒前后体重。结果:（1）成功构建原核表达载体并表达出相应蛋白,蛋白经Ni2+柱层析法及尿素透析法纯化,p ET28a-EDA-Et IMP1C及p ET28a-EDA-Em IMP1C蛋白大小为38k Da,p ET28a-Em IMP1C-EDA-Et IMP1C蛋白大小为63.8k Da,p ET28a-EDA蛋白大小为10.8k Da。（2）在细胞免疫方面,Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组血清中IL-2、IFN-γ的含量均高于EDA-Et IMP1C组和EDA-Em IMP1C组,全血中CD4+T淋巴细胞数量最高的为Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组,蛋白免疫组CD8+T淋巴细胞差异不明显（P>0.05）,但均明显高于EDA佐剂组及PBS空白组（P<0.05）;血清中IL-12浓度最高的为Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组,其次为EDA-Et IMP1C组和EDA-Em IMP1C组,但均明显高于EDA佐剂组及PBS空白组（P<0.05）。（3）在体液免疫方面,Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组Ig G抗体经1:1600的比例稀释,浓度仍高于EDA-Et IMP1C组和EDA-Em IMP1C组。（4）Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组试验鸡体增重明显,抗柔嫩艾美尔球虫组增重率为82.11%,抗巨型艾美尔球虫组增重率为85.86%;空盲肠道病变程度轻,抗柔嫩艾美尔球虫组肠道病变计分为1.19,抗巨型艾美尔球虫组肠道病变计分为0.89;卵囊排出量少,抗柔嫩艾美尔球虫组球虫卵囊排出减少率为84.01%,抗巨型艾美尔球虫组球虫卵囊排出减少率为79.12%;抗柔嫩艾美尔球虫指数为176,抗巨型艾美尔球虫指数为183。结果表明:抗巨型及柔嫩艾美尔球虫双价疫苗组能够成功激活体液及细胞免疫,并产生交叉免疫保护,抵抗巨型及柔嫩艾美尔球虫感染的效果较单价疫苗组更佳。
二、鸡球虫亚单位苗研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡球虫亚单位苗研究进展（论文提纲范文）
（1）柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫免疫机理 |
| 2 鸡球虫病疫苗类型 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）柔嫩艾美耳球虫配子体基因Etgam56的克隆表达与免疫保护分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1.鸡球虫疫苗的研究进展 |
| 2.卵囊壁蛋白的研究进展 |
| 3.配子体蛋白的结构特点与功能 |
| 4.天然配子体蛋白的抗球虫作用 |
| 5.体外重组配子体蛋白的抗球虫作用 |
| 6.结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因的克隆与序列分析 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因的原核表达和抗原性分析 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因在不同发育阶段虫体内的表达与定位分析 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫重组配子体抗原rEtGAM56免疫保护效果分析 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 一、鸡球虫入侵相关分子的研究进展 |
| 1 鸡球虫病病原 |
| 2 鸡球虫入侵宿主细胞过程 |
| 3 鸡球虫入侵关键分子 |
| 二、转录组学与蛋白组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 1 转录组学测序技术 |
| 2 蛋白质组学测序技术 |
| 3 转录组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 4 蛋白质组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的转录组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的蛋白质组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组和蛋白组的联合分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毒害艾美耳球虫SAG、P25和MIC13基因的原核表达及免疫荧光定位分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组蛋白RENSAG、RENP25和RENMIC13的免疫保护效果评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一: 转录组筛选子孢子入侵相关基因 |
| 附录二: 蛋白组筛选入侵相关差异蛋白 |
| 附录三: 转录组和蛋白组关联分析筛选入侵相关差异基因 |
| 攻读博士期间发表文章 |
| 致谢 |
（4）鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述: 鸡球虫病研究概述与进展 |
| 1 鸡球虫病的病原生物学 |
| 2 鸡球虫病的临床症状与眼观病变 |
| 3 鸡球虫病的防控 |
| 4 鸡球虫种类的鉴定方法 |
| 5 本研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.2 鸡球虫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫分子生物学研究进展 |
| 1.2.2 鸡球虫分泌蛋白研究概况 |
| 1.2.2.1 微线蛋白 |
| 1.2.2.2 蛋白激酶 |
| 1.2.2.3 棒状体蛋白 |
| 1.3 鸡球虫病防治概况 |
| 1.3.1 药物防治 |
| 1.3.2 疫苗研究进展 |
| 1.3.2.1 鸡球虫免疫机制 |
| 1.3.2.2 传统疫苗和商品化疫苗 |
| 1.3.2.3 新型疫苗研究进展 |
| 1.3.3 鸡球虫免疫应答的研究进展 |
| 1.4 EtSAGs家族蛋白 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株和载体 |
| 2.1.2 试验动物与虫株 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 鸡球虫复壮与传代 |
| 2.2.3 鸡球虫的收集与孢子化卵囊的收集 |
| 2.2.4 EtSAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建 |
| 2.2.4.1 EtSAG13 基因克隆与转化 |
| 2.2.4.2 EtSAG13 基因片段PCR产物的回收 |
| 2.2.4.3 EtSAG13 目的基因片段和载体双酶切和胶回收 |
| 2.2.4.4 目的基因酶切产物与pET-28a(+)载体的连接 |
| 2.2.4.5 重组质粒转化入Top10 感受态细胞 |
| 2.2.4.6 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.2.4.7 重组质粒DNA的提取与鉴定 |
| 2.2.4.8 阳性克隆质粒测序鉴定 |
| 2.2.5 EtSAG13 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.5.1 EtSAG13 重组蛋白的原核表达 |
| 2.2.5.2 EtSAG13 重组蛋白SDS-PAGE和 Western blot检测 |
| 2.2.5.3 重组EtSAG13 蛋白纯化 |
| 2.2.6 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定 |
| 2.2.6.1 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.6.2 EtSAG13 的亚细胞定位分泌蛋白鉴定 |
| 2.2.7 SAG13 蛋白免疫保护效果评价 |
| 2.2.7.1 动物试验设计与免疫程序 |
| 2.2.7.2 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果评价 |
| 2.2.7.2.1 存活率 |
| 2.2.7.2.2 增重效果 |
| 2.2.7.2.3 卵囊排出量 |
| 2.2.7.2.4 盲肠病变计分 |
| 2.2.7.2.5 抗球虫指数(ACI)评价 |
| 2.2.7.2.6 血清和粘膜抗体检测 |
| 2.2.7.2.7 细胞免疫水平的检测 |
| 2.2.7.2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建 |
| 3.2 EtSAG13 重组克隆载体的测序结果 |
| 3.3 EtSAG13 多克隆抗体的制备及鉴定结果 |
| 3.3.1 SDS-PAGE与 Western Blot验证EtSAG13 蛋白的原核表达 |
| 3.3.2 EtSAG13 原核重组蛋白的大量诱导及纯化 |
| 3.3.3 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定结果 |
| 3.3.4 E.tenella虫体EtSAG13 蛋白间接免疫荧光定位结果 |
| 3.4 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果的评价 |
| 3.4.1 体重增长情况 |
| 3.4.2 盲肠病变计分 |
| 3.4.3 卵囊排出量 |
| 3.4.4 抗球虫指数(ACI)结果 |
| 3.4.5 血清抗体水平检测结果 |
| 3.4.6 粘膜抗体水平检测结果 |
| 3.4.7 CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EtSAG13 重组蛋白分泌蛋白鉴定 |
| 4.2 原核表达EtSAG13 蛋白的意义及其免疫保护效果 |
| 4.3 血液抗体和粘膜抗体以及T淋巴细胞在抗球虫感染免疫保护中的作用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（6）鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 病原生物学 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病流行病学及危害 |
| 1.2 鸡球虫免疫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫抗原的种类 |
| 1.2.2 天然免疫反应 |
| 1.2.3 细胞免疫 |
| 1.2.4 体液免疫 |
| 1.3 鸡球虫病防控研究进展 |
| 1.3.1 鸡球虫病的药物防控 |
| 1.3.2 鸡球虫病的疫苗防控 |
| 1.4 蛋白质组学在球虫疫苗研发中的应用 |
| 1.4.1 蛋白质组学概述 |
| 1.4.2 蛋白质组学技术 |
| 1.4.3 免疫蛋白质组学 |
| 1.4.4 蛋白质组学在鸡球虫抗原鉴定中的应用 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验质粒、菌株、虫体、细胞 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器、设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 高免血清的制备 |
| 2.2.2 子孢子的分离纯化 |
| 2.2.3 裂殖子的分离纯化 |
| 2.2.4 裂殖子蛋白质的抽提 |
| 2.2.5 免疫差异蛋白质双向电泳 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 反转录合成c DNA |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.2.9 基因PCR扩增及产物回收 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.11 Blunt载体的制备 |
| 2.2.12 重组质粒的构建 |
| 2.2.13 原核表达 |
| 2.2.14 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.15 His重组蛋白的纯化 |
| 2.2.16 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.17 组织蛋白抽提 |
| 2.2.18 Western blot实验 |
| 2.2.19 酵母表面展示 |
| 2.2.20 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.21 多抗抑制子孢子入侵实验 |
| 2.2.22 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.23 抗球虫指数ACI计算 |
| 2.2.24 细胞转染 |
| 2.2.25 免疫共沉淀 |
| 2.2.26 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备与鉴定 |
| 3.1.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备 |
| 3.1.2 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体外鉴定 |
| 3.1.3 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体内鉴定 |
| 3.2 柔嫩艾美尔球虫差异蛋白质组的筛选、鉴定 |
| 3.2.1 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白双向电泳分析 |
| 3.2.2 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白免疫蛋白质组学分析结果 |
| 3.2.3 柔嫩艾美尔球虫免疫差异基因的鉴定 |
| 3.2.4 柔嫩艾美尔球虫免疫差异蛋白质表达、纯化 |
| 3.2.5 免疫蛋白质组学可靠性检测 |
| 3.3 差异抗原功能初步分析 |
| 3.3.1 差异抗原多克隆抗体的制备 |
| 3.3.2 差异抗原不同发育阶段转录谱分析 |
| 3.3.3 差异抗原在不同阶段的表达和定位分析 |
| 3.3.4差异抗原多克隆抗体体外抑制子孢子入侵实验 |
| 3.4 柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定 |
| 3.4.1 巨型艾美尔球虫同源基因的克隆、表达 |
| 3.4.2 重组抗原免疫保护力评价 |
| 3.4.3 重组抗原诱导体液免疫的能力 |
| 3.5 特异性抗原CCT2 的功能研究 |
| 3.5.1 EmCCT2 多抗的制备 |
| 3.5.2 CCT2 多抗对子孢子入侵的抑制作用 |
| 3.5.3 EtCCT2 与宿主细胞的相互作用 |
| 3.5.4 EtCCT2 对宿主细胞的影响 |
| 3.5.5 EmCCT2与EtCCT2 的功能差异 |
| 3.5.6 EtCCT2对GgCCT4 表达的影响 |
| 3.5.7 柔嫩艾美尔球虫感染对宿主CCT4 表达的影响 |
| 3.6 特异性抗原EtMIC1 表位及其关键氨基酸序列的鉴定 |
| 3.6.1 表位的鉴定 |
| 3.6.2 表位关键氨基酸的鉴定 |
| 3.6.3 不同种艾美尔球虫表位种特异性鉴定 |
| 3.6.4 感染初期EtMIC1 亚细胞定位结果 |
| 3.6.5 EtMIC1 表位及结构域免疫保护力评价 |
| 3.6.6 EtMIC1 表位诱导体液免疫和细胞免疫的能力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫蛋白质组学具有筛选高效抗原的优势 |
| 4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美尔球虫表面抗原 |
| 4.3 柔嫩艾美尔球虫Profilin样蛋白是潜在候选抗原 |
| 4.4 柔嫩艾美尔球虫CCT2 可能是毒力因子 |
| 4.5 ~(91)LITFATRSK~(99)是EtMIC1 的关键抗原表位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 博士在读期间发表的论文 |
（7）毒害艾美耳球虫配子体抗原的免疫保护分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫活疫苗的应用与现状 |
| 2 鸡球虫核酸疫苗的应用与现状 |
| 3 鸡球虫亚单位疫苗的应用与现状 |
| 4 鸡球虫配子体疫苗的应用与现状 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 毒害艾美耳球虫Engam56基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 毒害艾美耳球虫Engam56基因的原核表达与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毒害艾美耳球虫重组配子体抗原rEnGAM56的免疫保护分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 毒害艾美耳球虫重组配子体抗原rEnGAM22,rEnGAM56-T和rEnGAM59的联合免疫保护分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录1 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 鸡球虫病防治研究进展 |
| 1 鸡球虫的生物学特征 |
| 2 鸡球虫病的诊断与防治 |
| 3 鸡球虫病的免疫预防 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第一章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam56基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam82基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.1.1 鸡球虫病原 |
| 1.1.2 鸡球虫病的防治 |
| 1.2 鸡球虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 活疫苗 |
| 1.2.2 DNA疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3 禽用免疫增强剂研究进展 |
| 1.3.1 微生态制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.2 生物制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.3 中草药及多糖类免疫增强剂 |
| 1.3.4 化学合成小分子类免疫增强剂 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂和仪器 |
| 2.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 2.2.5 免疫增强剂的配制 |
| 2.2.6 实验动物分组 |
| 2.2.7 免疫攻虫程序 |
| 2.2.8 主要观察指标 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫期间动物体重变化 |
| 2.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 2.3.3 血清抗体水平检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 |
| 3.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 3.2.5 免疫增强剂的制备 |
| 3.2.6 实验动物分组 |
| 3.2.7 免疫攻虫程序 |
| 3.2.8 主要观测指标 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫增强剂对免疫期间动物体重变化 |
| 3.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 3.3.3 免疫增强剂对鸡群抗体和细胞因子水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂和仪器 |
| 4.2.4 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育 |
| 4.2.5 柔嫩艾美耳球虫母株卵囊的收集和纯化 |
| 4.2.6 柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的繁殖和纯化 |
| 4.2.7 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组测序 |
| 4.2.8 荧光定量PCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株的早熟选育结果 |
| 4.3.2 早熟株与母株转录组测序结果 |
| 4.3.3 差异基因的筛选 |
| 4.3.4 差异基因功能分类 |
| 4.3.5 转录组差异表达基因的荧光定量验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验虫株和细胞 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 柔嫩艾美耳球虫四个阶段虫体的纯化以及cDNA制备 |
| 5.2.4 EtRON2和EtRON3 转录水平分析 |
| 5.2.5 DF-1细胞的传代培养 |
| 5.2.6 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段虫体中的分布 |
| 5.2.7 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 EtRON2和EtRON3 在早熟株和母株孢子化卵囊的转录水平差异 |
| 5.3.2 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段中转录水平的差异 |
| 5.3.3 EtRON2和EtRON3 在虫体不同发育阶段的分布情况 |
| 5.3.4 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）鸡球虫重组双价疫苗的制备及其效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1.鸡球虫的概述及入侵机制 |
| 2 鸡抗球虫的免疫机制及相关细胞因子的作用 |
| 2.1 免疫机制 |
| 2.2 细胞因子的作用 |
| 3 新型鸡球虫疫苗的研究进展 |
| 3.1 DNA疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗 |
| 3.3 活载体疫苗 |
| 4 鸡球虫免疫相关蛋白1(IMP1)的研究进展及应用 |
| 5 纤维外链接蛋白EDA佐剂的研究进展及应用 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第一章 重组质粒的构建 |
| 目的 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂与试剂盒 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 Em IMP1C、EDA、Et IMP1C片段的扩增 |
| 2.2 构建pEASY-Em IMP1C、pEASY-Et IMP1C、pEASY-EDA质粒 |
| 2.3 构建pET28a-Em IMP1C、pET28a-Et IMP1C、pET28a-EDA 重组质粒 |
| 2.4 构建pET28a-EDA-Em IMP1C、pET28a-EDA-Et IMP1C质粒 |
| 2.5 构建pET28a-Em IMP1C-EDA-Et IMP1C表达质粒 |
| 3 结果 |
| 3.1 EDA、Em IMP1C及 Et IMP1C扩增 |
| 3.2 重组质粒pET28a-Et IMP1C和 pET28a-Em IMP1C的酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒pET28a-EDA-Et IMP1C、pET28a-EDA-Em IMP1C及 pET28a-EDA的酶切鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 重组蛋白的表达 |
| 目的 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂及试剂盒 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BL21蛋白表达菌的转化 |
| 2.2 重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.3 Western-blot鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 诱导时间 |
| 3.2 可溶性表达 |
| 3.3 蛋白纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 动物模型免疫学研究 |
| 目的 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂及试剂盒 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 实验动物及球虫株 |
| 2 方法 |
| 2.1 球虫卵囊的活化 |
| 2.2 血清IgG抗体检测 |
| 2.3 ELISA效价检测 |
| 2.4 IL-12、IL-10、IFN-γ细胞因子浓度检测 |
| 2.5 CD4~+/CD8~+T淋巴细胞检测 |
| 2.6 病理切片制作 |
| 2.7 体重变化 |
| 2.8 肠道病变计分方法 |
| 2.9 排出卵囊数 |
| 2.10 计算ACI(抗球虫指数) |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IL-2细胞因子检测 |
| 3.2 IL-12细胞因子检测 |
| 3.3 IFN-γ细胞因子检测 |
| 3.4 抗体IgG浓度及效价检测 |
| 3.5 淋巴细胞亚群检测 |
| 3.6 平均增重、卵囊排出数量、肠道病变计分 |
| 3.7 病理变化 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 仪器 |
| 附录 B 检测步骤 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
四、鸡球虫亚单位苗研究进展（论文参考文献）
- [1]柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价[D]. 程振扬. 扬州大学, 2021
- [2]柔嫩艾美耳球虫配子体基因Etgam56的克隆表达与免疫保护分析[D]. 刘悦. 扬州大学, 2021
- [3]毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究[D]. 高阳. 扬州大学, 2021
- [4]鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用[D]. 徐向东. 扬州大学, 2021
- [5]鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究[D]. 戴玉. 山东农业大学, 2020(11)
- [6]鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究[D]. 赵宁宁. 山东农业大学, 2020(08)
- [7]毒害艾美耳球虫配子体抗原的免疫保护分析[D]. 汪飞燕. 扬州大学, 2020
- [8]堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究[D]. 华恩玉. 扬州大学, 2020
- [9]柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究[D]. 余水兰. 中国农业科学院, 2020
- [10]鸡球虫重组双价疫苗的制备及其效果评价[D]. 陈欢. 福建农林大学, 2020