一、Tat和TAR对人免疫缺陷病毒HIV-1基因表达的调控研究（论文文献综述）
张旭[1]（2020）在《HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究》文中指出研究目的艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的一种慢性传染病,主要传播途径包括血液接触,母婴传播和性传播三种,因其具有致命性,且尚无彻底治愈药物的特点,成为威胁人类健康的主要疾病之一。艾滋病未能得以根治的主要原因是有病毒储藏库的存在。目前的联合抗逆转录病毒治疗方法（cART）主要靶向艾滋病毒编码蛋白中的三种酶活性蛋白。但15种HIV编码蛋白中还有许多潜在的病毒机制及可能的药物靶点仍未得到充分研究。为了清除HIV-1的病毒储藏库,已经开发出各种治疗策略,其中包括“HIV-1病毒储藏库的震和杀”（“shock and kill”）。“shock and kill”研究的关键问题之一是如何修复HIV-1感染受损的免疫系统,恢复宿主的免疫监控,以达到清除病毒的效果。长期以来HIV-1的Nef蛋白可以通过介导细胞表面MHC-I的下调,帮助HIV-1逃避免疫系统的监控。寻找一种新型的特异性拮抗Nef下调MHC-1的抗病毒药物具有重大的学术价值和应用价值。本研究试图从FDA批准已经在临床上使用的化合物库中希望筛选一个能够特异性拮抗Nef蛋白的抗病毒药物,从而恢复细胞表面的MHC-I的表达,增加免疫系统对HIV-1感染细胞的应答反应,为临床上增强对HIV-1的免疫监控提供一种新的治疗策略。研究内容和方法首先,本研究利用分子克隆技术构建HIV-1 Nef-GFP蛋白稳定表达的荧光载体系统,通过细胞转染,流式细胞术等方法,在HEK293T细胞中验证Nef-GFP表达载体能够有效抑制细胞表面MHC-I的表达。进一步再通过高通量药物筛选,筛选出Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂洛伐他汀。其次,通过病毒的包装和体外扩增,过表达Nef和SERINC5,ELISA等实验方法,验证洛伐他汀是否能够抑制同样被Nef下调的CD4和SERINC5,并抑制由Nef引起的病毒复制能力。通过病毒体外感染,共培养等实验来检测洛伐他汀是否促进自体的细胞毒性T淋巴细胞通过免疫杀伤反应清除感染细胞,并进一步测试洛伐他汀抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4+T淋巴细胞的病毒反弹,验证洛伐他汀的抗病毒效果。最后,通过分子对接实验、位点突变、和免疫共沉淀方法,探讨洛伐他汀特异性拮抗Nef蛋白恢复MHC-I表达的分子机制。研究成果本研究通过流式高通量药物筛选系统对FDA批准已在临床上广泛使用的的药物库进行药物筛选工作,我们发现一种他汀类药物洛伐他汀,不仅可以显着拮抗Nef蛋白下调MHC-I的表达,还可以拮抗Nef抑制的CD4和SERINC5的表达,并在野生型HIV-1病毒感染的CD4+T细胞中验证了洛伐他汀对MHC-1和CD4的下调有抑制作用,抑制作用呈现剂量依赖性。体外CD4+T细胞自体感染实验和自体CD8+T细胞共培养实验中,加入特定组合的HIV-1抗原肽模拟体内病毒感染情况,发现洛伐他汀处理后,感染细胞中病毒复制被有效并持续的抑制,说明洛伐他汀能有效抑制病毒颗粒的内源性感染性。通过细胞杀伤实验检测结果,发现洛伐他汀处理后,感染的CD4+T细胞的CTLs杀伤毒性显着增加,表明洛伐他汀还可以促进自体CTLs,并且有效抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4+T淋巴细胞的病毒反弹。另外,我们通过分子对接实验,计算洛伐他汀可能与Nef-MHC-I复合物作用的位点,并通过分子突变实验加以证实。我们还发现洛伐他汀通过直接与Nef蛋白作用,干扰Nef-MHC-AP-1复合物的形成,从而抑制Nef蛋白对MHC-I的下调。结论本研究筛选出一种有前景的抗HIV-1病毒药物洛伐他汀。洛伐他汀可以拮抗Nef介导的MHC-I、CD4和SERINC5的下调,增强CD8+T细胞的CTLs反应,抑制病毒的复制,有助于临床上增强抗HIV-1的免疫监控呼吸道合胞体病毒（RSV）是最常见的呼吸道病毒,它与儿童肺炎、细支气管炎和婴幼儿死亡率显着相关。Micro RNAs（mi RNAs）是一种内源性非编码小RNAs,在基因调控中发挥作用,并与宿主免疫反应和疾病进展相关。在本研究中,为了识别儿童肺炎相关潜在的生物标志物,同时研究RSV相关儿童肺炎的分子机制,我们分析了患RSV轻症肺炎和重症肺炎儿童全血样本的全转录组和微小RNA组。我们发现RSV重症肺炎患儿全血mi RNAs和编码RNA（m RNA）表达谱发生改变,差异明显。在RSV重症肺炎患儿中,hsa-mi R-1271-5p、hsa-mi R-10a-3p、hsa-mi R-125b-5p和hsa-mi R-30b-3p这四种mi RNAs被显着上调。进一步,我们对RSV重症肺炎的特异性mi RNA的靶标基因进行了比较。利用基因功能富集分析法（GO分析）对这些靶基因进行分析,发现大多数靶基因参与炎症和免疫反应,包括NF-k B信号通路、MAPK信号通路和T细胞受体信号通路。我们的发现将有助于识别重症肺炎的生物标志物和新的药物设计策略,并用用以治疗的RSV重症肺炎儿童。
靳红亮[2]（2020）在《基于GPI锚定双功能HIV进入抑制剂的基因治疗策略》文中研究表明自HIV病毒被鉴定发现以来,它一直作为一种严重危害全球公共健康的重大病原体,预防和治疗策略的研究一直在持续不断地进行。至今已有近40年的努力,安全有效的疫苗尚无问世,高效抗逆转录病毒治疗（HAART）依然是控制病毒感染的金标准治疗手段。由于HAART不能根除HIV,患者需要长期使用该疗法才能预防病毒相关免疫缺陷的出现。该疗法的局限性,如长期使用带来的毒副作用和耐药性问题,也愈来愈明显。因此,一种有效且低毒性的替代疗法已经成为了抗击HIV感染方面的研究重点和热点。目前,功能性治愈策略的研制是全球艾滋病治疗研究的重点。柏林病人和伦敦病人的成功已经证明了这种概念是可行的,并且提示基因治疗策略在实现HIV的功能性治愈方面具有非常大的前景。在基因治疗背景下,基因修饰的HIV抗性细胞也就成为了一种最具治疗潜力的手段。基于柏林病人和伦敦病人的思路,通过降低或消除细胞表面CCR5蛋白表达,多种靶向CCR5策略已经被用于生产HIV抗性（HIV-resistant）细胞。尽管靶向CCR5策略很难产生耐药性毒株,这种策略制备的HIV抗性细胞仍然允许X4嗜性和双嗜性（R5X4）病毒株的感染。因此,具有广谱和强效抗病毒特性的HIV靶细胞亟需研究。本课题旨在利用糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定平台将靶向病毒Env不同位点的进入抑制剂表达于HIV靶细胞表面,获得具有广谱抗病毒能力的细胞。首先,我们利用GPI锚工具将靶向gp41蛋白的短肽膜融合抑制剂2P23锚定和表达在靶细胞表面,并通过共聚焦实验证明GPI-2P23主要靶向在细胞膜表面脂筏区域。同时,FACS实验证明它的表达不影响细胞表面CD4、CCR5和CXCR4的表达水平。随后的活性评估实验证明了 GPI-2P23能有效保护靶细胞免受HIV-1、HIV-2和SIV病毒感染、并且也能有效阻止HIV-1病毒包膜蛋白介导的细胞膜融合和细胞间病毒的传播。此外,GPI-2P23修饰的CD4+T细胞能够完全抵抗R5嗜性和X4嗜性的HIV-1病毒感染,并能够在病毒复制的情况下表现出选择性存活优势。在进一步研究设计与GPI-2P23靶点不同的强效GPI锚定膜融合抑制剂过程中,我们探究了 GPI锚定膜融合抑制剂潜在的作用机制,发现主要有三个方面。一是PBD基序对于GPI锚定膜融抑制剂发挥抗病毒活性是至关重要的。二是Linker对于GPI锚定膜融合抑制剂不是必需的。三是首次证实了 GPI锚定膜融合抑制剂对病毒包膜蛋白的加工处理过程和子代病毒的感染性均有干扰作用,并且还发现含有PBD基序的GPI锚定膜融合抑制剂（尤其是GPI-CP41）的干扰能力更强。鉴于我们另一项研究发现的两个强效广谱的膜锚定进入抑制剂GPI-10E8（靶向gp41）和GPI-m36.4（靶向gp20）,且和膜锚定进入抑制剂GPI-CP41的作用位点不同。最后,为了研究膜锚定双功能进入抑制剂,基于GPI·锚定平台,多肽膜融合抑制剂（CP41）和广谱中和抗体（10E8或m36.4）融合至一个分子并表达在靶细胞表面。基于病毒感染试验和病毒包膜蛋白介导的细胞融合试验证实了 GPI-10E8-L-CP41、GPI-CP41-L-10E8 和 GPI-m36.4-L-CP41 是膜锚定双功能进入抑制剂。总之,本研究基于靶向HIV病毒包膜蛋白不同位点的进入抑制剂,成功构建了两类膜锚定双功能进入抑制剂,并证实了其制备广谱抗性的HIV靶细胞的能力,因此作为一种HIV基因治疗策略是非常具有治疗潜力的。
张标[3]（2019）在《激活细胞内天然免疫抑制乙型肝炎病毒和艾滋病毒感染》文中认为第一部分激活肝星状细胞Toll样受体3（TLR3）抑制乙型肝炎病毒复制乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）是一种嗜肝性DNA病毒,可引起乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌,是人类面临的主要公共健康问题之一。使用干扰素（Interferon,IFN）和/或核苷类似物是治疗HBV感染的首选方法。由于不能清除细胞内病毒的cccDNA,目前的治疗不能治愈HBV感染。尽管绝大多数成年人在接种乙肝疫苗后可产生强效持久的保护性抗体,但仍有5-10%的成年人对疫苗不产生免疫反应。因此,研发治愈HBV的药物和更高效的疫苗仍是目前的研究重点。本项目旨在研究肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）是否参与抗HBV的天然免疫。HSC是一种肝周细胞,位于肝实质细胞和肝窦内皮细胞之间。HSC参与肝脏纤维化的过程。肝脏损伤可激活HSC,活化的HSC促进细胞外基质的迁移和沉积,导致肝脏纤维化。近年来的研究证明HSC在肝脏免疫中也发挥作用。然而,目前尚未有关HSC在肝脏抗HBV天然免疫中的报道。作为一种识别病毒感染的重要模式受体,TLR3可识别病毒的双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）,启动细胞内的天然免疫反应。在本研究中,我们使用dsRNA模拟物（PolyI:C）激活HSC内的TLR3信号通路,检测其对IFN及下游抗病毒因子的诱导作用。结果显示,PolyI:C能显着激活HSC的TLR3信号通路,诱导干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3,IRF3）和IRF7磷酸化,选择性地上调IFN-β和IFN-λ表达。TLR3激活诱导IFN的产生与RIG-I信号通路无关。TLR3激活的HSC培养上清可显着抑制HBV在肝细胞（HepG2）中的复制。使用IFN-β和IFN-λ受体的中和抗体预处理HSC上清,可阻断其介导的抗HBV作用,表明这两种IFN在抗HBV中均发挥作用。机制研究发现,HSC上清可激活HepG2细胞内JAK/STAT信号通路,诱导表达干扰素刺激因子 IFN-stimulatedgene,ISG)。这些ISG（ISG20、ISG54、ISG56、OAS-1、Trim25和Trim22）可在HBV复制的不同阶段发挥干扰和/或抑制作用。上述发现表明,激活肝脏内的非HBV靶细胞（旁观者细胞）的TLR3/干扰素信号通路可产生多种抗HBV的细胞因子,抑制HBV在肝细胞中的复制。我们的研究为研发激活肝脏内天然免疫为基础的HBV治疗提供了重要的实验证据。未来的研究需使用动物或人肝脏组织进一步证明HSC在肝脏抗HBV天然免疫中的作用。第二部分激活DNA感受器抑制人类免疫缺陷病毒感染巨噬细胞天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防线。由于可识别病毒DNA并激活抗病毒免疫反应,DNA感受器是细胞内天然免疫系统的重要组成部分。目前已知细胞内存在多个可识别多种病毒的DNA感受器。胞质内的DNA感受器识别病毒DNA并诱导宿主细胞产生IFN抑制病毒。研究发现,HIV复制过程中产生的RNA:DNA中间体、单链DNA（single-stranded DNA,ssDNA）和双链DNA（double-stranded DNA,dsDNA）均可被DNA感受器识别。巨噬细胞是体内重要的免疫细胞,在抵抗HIV感染过程中发挥重要作用。然而,巨噬细胞是HIV的重要靶细胞,HIV通过各种机制逃逸巨噬细胞内的抗病毒天然免疫在细胞内生存和复制,形成持续和潜伏感染。因此,激活巨噬细胞的天然免疫对抑制和清除HIV感染至关重要。本课题旨在探究激活巨噬细胞DNA感受器对HIV感染/复制的作用及其机制。我们使用DNA感受器的配体poly（dA:dT）和poly（dG:dC）刺激巨噬细胞,激活细胞内DNA感受器信号通路,启动天然免疫应答。本研究发现,激活巨噬细胞的DNA感受器可显着抑制HIV感染巨噬细胞。机制研究发现,DNA感受器激活促进巨噬细胞内干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor,IRF3）和IRF7磷酸化,上调I型和III型IFN表达。分泌和释放的IFN与细胞表面IFN受体结合,激活JAK/STAT信号通路,产生干扰素刺激基因（Interferon stimulate genes,ISG）:ISG15、ISG56、Viperin、OAS2、GBP5、MxB和Tetherin)和抗HIV的微小RNA（microRNA:miRNA-29c、miRNA-138、miRNA-146a、miRNA-155、miRNA-198和miRNA-223）。这些抗病毒因子可在HIV复制周期的不同阶段发挥抗病毒作用。这些抗HIV因子的作用与干扰素表达相关,因为抗干扰素受体的中和抗体可阻断它们的抗HIV作用。此外,我们发现DNA感受器激活的巨噬细胞高表达CC趋化因子,显着降低HIV进入巨噬细胞后的逆转录产物Strong Stop DNA的表达。这些结果表明激活DNA感受器诱导产生的CC趋化因子可通过竞争性结合HIV进入辅助受体抑制病毒进入巨噬细胞。
冯泽明[4]（2019）在《瑞香烷型二萜化合物NB6及白藜芦醇激活潜伏HIV作用机制的研究》文中指出尽管高效抗逆转录病毒治疗（HAART）对HIV复制和传播的控制具有良好的效果,但由于HAART不能彻底消除具有复制能力却处于潜伏状态下的HIV,因此患者往往需要终身接受HAART治疗来确保病毒的抑制。“激杀疗法”旨在通过潜伏激活药物将细胞中的潜伏HIV病毒再激活,然后结合HAART联合HIV特异性免疫细胞杀死产生HIV病毒的细胞,从而彻底清除潜伏的HIV病毒库。基于“激杀疗法”的治疗理论,首先是要找到一种高效低毒的HIV潜伏激活剂:即可以有效地激活潜伏的HIV,同时又不广泛地引起T细胞的全面活化。然而目前针对已经报道的HIV潜伏激活剂的临床试验结果大都不够理想。因此,对于“激杀疗法”能否实际运用,当务之急就是要寻找开发更多安全有效的HIV潜伏激活剂。本课题通过对从草本植物黄芫花中分离得到的瑞香烷型二萜类化合物成分进行测试,筛选到一个可以在低浓度条件下（10 nM）有效激活潜伏HIV病毒表达的化合物NB6。通过机制的研究,我们发现NB6通过PKC-NF-κ B信号通路激活潜伏HIV,进一步的研究发现NB6也可以通过PKC途径促进转录延伸因子ELL2蛋白的上调,同时促进ELL2-SEC复合物的组装以及HIV Tat蛋白招募更多的ELL2-SEC,该发现使我们对PKC激动剂活化HIV潜伏病毒库的机制有了更加全面的认识。通过进一步的研究,发现10 nM的NB6促进治疗后HIV患者T细胞潜伏HIV的转录表达的同时不会引起人CD4+T细胞的全面活化,该结果证实了NB6可以激活真实的潜伏HIV。本课题通过对植物提取物白藜芦醇（RES）的研究,发现RES可以通过激活AKT/Fox01蛋白信号通路解除Fox01对Tat的抑制,进而促进Tat蛋白表达的升高。另外,我们发现在没有Tat存在的情况下,RES会破坏SEC复合物的形成,而在Tat存在下RES反而促进Tat结合到更多的SEC组分,从而对HIV基因的转录延伸产生正面的影响。同样,在2D10细胞中,我们发现抑制AKT蛋白后即可显着地抑制RES对潜伏HIV的激活能力,而抑制Fox01蛋白则显着地促进RES激活潜伏HIV。由此发现RES通过AKT/Fox01途径激活潜伏HIV。综上,本课题通过从传统的草本植物中去筛选发现了新型的HIV潜伏激活剂,为寻找以及开发治疗HIV的药物提供了新的方案以及奠定了研究基础。
王蓓蕊[5]（2019）在《基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及鼠细胞模型探索》文中研究指明背景:人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）,经感染人体后可导致获得性缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）。联合抗逆转录病毒治疗（Combination Antiretroviral Therapy,cART）的运用,可以使 HIV-1 感染者体内的病毒复制数低于常规检测水平线以下,但不能使其完全清除。治疗HIV-1感染的主要困难就是清除这群潜伏的整合且具有复制能力的病毒储存库（viral reservoir）。目前对于检测病毒储存库方法很多,但是各有不足,如何能更精确快速找到病毒储存库,本研究论文提出问题,并且在目前被视为检测病毒储存库金标准的方法—体外扩增检测（viraloutgrowthassay,VOA）的基础上进行改进。由于HTV-1的生物学特性的复杂,目前尚无有效疫苗。对于HIV的研究,特别是HIV-1抗逆转录病毒治疗后,HIV-1感染变成慢性病,各种并发症的研究,需要动物模型。本文基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及利用dCas9基因激活系统与EcoHIV相结合,改进HIV啮齿类细胞模型。目的:本文基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及鼠细胞模型。方法:利用Crispr/Cas9改造后的dCas9基因激活系统,根据其设计原理,在HIV-1的长末端重复序列（LTR）设计20条sgRNA。首先分别测试20条sgRNA的激活能力,并筛选出2条效率较高的sgRNA进行对比,确定效率最佳者。其次将此条sgRNA与dCas9基因激活系统导入Jurkat细胞经筛选建立激活系统细胞系;利用含荧光素酶报告基因的感染Jurkat细胞,构建HIV潜伏细胞系。将潜伏细胞系与激活系统细胞系,按照预先设定的潜伏频率共培养7天和14天后测试激活能力,并与HIV激活剂对比激活能力。测试在鼠类细胞中存在HIV激活系统时,EcoHIV能否在鼠类细胞中完成病毒感染,复制,再感染的病毒增殖循环。结果:筛选出两条具有高效HIV扩增能力的gRNA-L和gRNA-O。通过对比试验,gRNA-L和gRNA-O分别促进Jurkat6465-Luc的扩增效力,在第6天测定gRNA-L和 gRNA-O 荧光素酶活性强度（pg/ml）（85530±979.2,n=3）和（96925±2759,n=3）明显比对照（9876±437,n=3）高（P<0.01）;最后选取gRNA-L与dCas9基因激活系统构建的Jurkat6465L细胞系作为工作细胞测试设定潜伏频率为1/500的HIV潜伏模型细胞,在第7天、第14天激活HIV潜伏模型细胞的频率测定分别1/864和1/755,比传统激活剂第14天激活HIV潜伏模型细胞的频率1/1180更接近设定值;用HIV潜伏细胞测试dCas9基因激活系统激活HIV潜伏细胞频率1/615与对照1/749相比更接近于设定频数1/500。dCas9基因激活系统能激活Eco-HIV感染的大鼠C6细胞系,未感染Eco-HIV组中荧光素酶活性强度（RUF）C6-6465-L（74.67±5.812,n=3）,C6-6465-O（84±8,n=3）与对照 C6-6465-对照（86.67±3.528,n=3）相比无统计学意义;Eco-HIV感染组中 C6-6465-L（2839±25.75,n=3）,C6-6465-0（3173±61.2,n=3）与对照C6-6465-对照（105.3±3.528,n=3）相比p<0.01,有统计学意义。其次,dCas9基因激活系统能激活Eco-HIV感染的小鼠BsB8细胞系。感染Eco-HIV的BsB8-6465-L 荧光素酶活性强度（RUF）（929.7±11.55,n=3）比 BsB8-6465-对照（179±12.49,n=3）与空白组（169.3±8.353,n=3）相比p<0.01,有统计学意义。最后,dCas9基因激活系统激活的Eco-HIV感染的大鼠C6细胞,再感染C6细胞后仍能进行转录复制,荧光素酶活性强度（RUF）C6-LTR-L（788±41.63,n=3）,C6-LTR-O（836±28.1,n=3）,C6-LTR-空（85.33±7.055,n=3）分别与 C6 无感染（83.67±8.11,n=3）相比p<0.01,p<0.01,N,实验组有统计学意义。结论:本研究进一步改进了 HIV体外病毒扩增方法,准确有效地启动病毒转录并促进其转录达到可检测水平,使得静息潜伏病毒激活检出率较传统方法提高。本研究同时也解决了 EcoHIV鼠细胞模型不能进行转录复制的难点。
殷林波[6]（2019）在《HIV感染长期不进展低病毒复制者中miRNA对外周血CD8+T细胞功能的调控研究》文中研究说明目的:获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）引起的一种传染性疾病,虽然抗逆转录病毒治疗（ART）的出现大大降低了HIV感染者的发病率和死亡率,然而抗逆转录病毒治疗却不能完全治愈HIV感染患者,一旦停药,病毒会迅速反弹。HIV感染后,不同个体疾病进程呈现明显的不均一性。具有非典型疾病进展的HIV感染患者特别重要,因为它们可以为HIV发病机理和治疗方案的研究提供重要的信息,因此这些非典型疾病进展的患者也是我们研究的重点。在1993年报告了长期非进展者（LTNPs）的第一个证据,有约15%的HIV感染者能够在未接受抗病毒治疗室维持CD4计数大于500个cells/u L以上[1,2].。2005年,研究表明,大约1/300的HIV感染患者在没有抗逆转录病毒治疗（ART）的情况下在血浆中检测不到HIV病毒载量[3]。2007年,一些患者被描述为“精英控制者”（EC）,他们在没有抗逆转录病毒治疗的情况下将HIV病毒载量维持在50拷贝/ml以下至少1年[4-8]。虽然这部分患者数量很少,但这些患者能够很好的维持自身免疫功能,对抗病毒的有效复制,其中的具体机制值得我们去研究和探索。尽管从定义上看,LTNPs和ECs之间存在重叠,但它们并不相同。一些LTNPs虽然能够在未接受抗病毒治疗的情况下较好的维持CD4细胞的计数,但仍然正在进行病毒复制,而另一些LTNPs则没有[3,5,7,9-11]。LTNPs对病毒的控制水平不尽相同,导致这种差异的原因目前尚不清楚。以往研究报道指出与HIV阴性个体相比,维持高病毒载量的LTNPs在后期易于长期疾病进展,CD4 T细胞水平降低,病毒水平大幅度提高并且其预期寿命降低[12,13].。分析LTNPs中不同水平的病毒控制的潜在原因可能有助于理解HIV发病机制,并可能提供免疫干预的新方法。病毒控制水平多种因素的影响,包括受免疫和病毒学等。mi RNA虽然是一种小分子的非编码RNA,但由于在细胞内的表达丰度较高,种类繁多,学者们已经发现了超过1500多种不同的mi RNA,其能够通过与靶基因的m RNA特异性结合,参与调控机体内复杂的生理活动。在HIV感染的各个过程中,HIV病毒的进入、整合、逆转录等过程中是否受到一些宿主mi RNA的调节,HIV本身是否可以产生特异性的mi RNA影响宿主以及其它细胞的存活以及功能,还有两者之间是以如何形式相互影响的相关机制尚不明确,因此mi RNA与HIV-1的之间的相互关系是学者们的研究热点。通过相关的研究发现HIV-1感染后宿主的mi RNA表达谱会发生明显改变,这为我们研究HIV感染调控机制提供重要的信息,值得我们做进一步的深入研究。相关研究已经表明mi RNA在免疫应答和病毒产生的过程中发挥着重要的调节作用,在HIV感染中,mi RNA可以通过靶向HIV-1基因组或通过调控宿主靶基因来影响抗病毒细胞因子的释放来调控病毒的产生[14-18]。micro RNAs（mi RNAs）作为的小分子非编码RNA,能够参与多种基因的转录及转录后的调控,对于mi RNAs与HIV之间的相互调控关系的研究,可以为我们提供关于HIV感染后机体的复杂的调控机制提供很多重要的信息,有利于我更好的了解HIV感染的发病机制[19]。大量的研究报告指出,细胞内源性mi RNA表达水平的改变对HIV病毒的复制过程中发挥着重要的作用,并且细胞的耗竭能够影响了内源性mi RNA对靶基因的调控作用[20][21]。研究表明,mi RNAs对于相关细胞因子的产生也会产生复杂的调控作用[22]。在HIV感染后,mi RNA调节细胞因子如白介素2（IL-2）和白介素10（IL-10）的表达,IL-2和IL-10是机体重要的免疫调节因子,因此mi RNA能够通过调控细胞因子来参与调控机体的免疫功能[23,24]。对免疫细胞的发育和功能方面,学者们也进行了大量的相关mi RNA的研究,包括CD8 T细胞,它是抗病毒免疫反应的关键参与者[25,26]。在HIV感染过程中,CD8 T细胞发挥重要的作用,其能够有效增殖来进行CTL应答或者分泌相关抗病毒细胞因子IFN-r、GRanzyan B等发挥抗病毒作用。前人的研究报道指出mi RNA参与调节CD8 T细胞的发育、分化和发挥功能所需的许多调节蛋白的表达。在本研究中,我们分析了HIV感染长期不进展不同病毒控制水平的患者PBMC中mi RNA表达情况以及差异性的mi RNA对CD8 T细胞相关免疫功能的影响及其作用机制。研究方法:1研究对象:论文第一部分收集27例HIV感染长期不进展者（Long-term non-progressors,LTNPs）、6例典型进展者（Typical Progressors,TP）和4例健康对照（Healthy Control,HC）。筛查组用9例LTNPs、6例TPs和4例HCs的PBMC进行Mi RNA的筛查,验证组新纳入18例LTNPs对筛查组筛查出来的mi RNA进行验证论文第二部分共收集27例健康对照（HCs）。采用ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,磁珠法负选PBMC中的CD8 T细胞,经过流式检测,CD8 T细胞的纯度大于98%。论文第三部分共收集7例HIV感染未接受抗病毒治疗的患者。采用ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。磁珠法负选PBMC中的CD8 T细胞,经过流式检测,CD8 T细胞的纯度大于98%。ELISPOT实验的标本,磁珠法去除PBMC中的CD4 T细胞,经过流式检测,CD4 T细胞的纯度小于3%。病毒体外感染实验的标本,磁珠法负选PBMC中的CD4 T细胞,经过流式检测,CD4 T细胞的纯度大于98%2 mi RNA筛查阵列分析基于q RT-PCR的高通量mi RNA谱分析在Quanto Bio Biotechnology Co.Ltd公司（中国北京）进行。首先,使用TRIZOL（Invitrogen,Carlsbad,USA）分离从外周血单核细胞（PBMC）提取的总RNA。然后使用大肠杆菌poly（A）聚合酶将腺嘌呤添加到缺少poly（A）尾的RNA分子的3’末端,逆转录酶Superscript ⅡⅠ（Invitrogen）在c DNA合成期间将通用标签连接到c DNA的3’末端。使用这种通用标签,使用mi RNA特异性正向引物和反向通用引物混合物进行q RT-PCR,U1和U6作为内参,用-CT的变化用作相对定性值。。3外周血单核细胞亚群分选密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（PBMC）,分别不同荧光抗体标记的CD3（FITC）、CD4（APC）、CD8（APC-CY7）、CD14（PE-CY7）、7-AAD（PERCP）,4℃避光染色30min,取出离心洗涤细胞,弃上清,使用流式细胞仪FACS AriaTM（美国BD公司）进行单核细胞亚群分选。4逆转录和荧光实时定量PCR总RNA提取采用RNeasy Micro kit（Qiagen）,为防止基因组DNA污染,提取后的RNA采用DNase Ⅰ进行纯化。逆转录试剂Primpscript?RT reagent kit（TAKARA）将RNA逆转录。检测mi RNA相对表达量的实时荧光定量PCR采用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（TAKARA）。mi RNA相对表达量内参基因为small nucleolar RNA（sn RU6）,m RNA内参基因为GAPDH。mi RNA和m RNA相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法5原代细胞的分离和Jurkat细胞的培养提取全血的PBMC,采用磁珠法负选PBMC中的CD8 T细胞,经过流式检测,CD8 T细胞的纯度大于98%。CD8细胞和Jurkat细胞株培养于含有10%FBS和1%PS的RPMI 1640（Hy Clone）中。为了检测CD8细胞的增殖、凋亡和胞内细胞因子,用CD3/28刺激,浓度为3ug/m L。6转染mi RNA mimics、inhibitor将mi RNA的mimics或inhibitor（20μM）和阴性对照（control）（上海Gene Pharma公司）用Hi Per Fect转染试剂（Qiagen公司）转染至Jurkat细胞,原代CD8T细胞用RNAi MAX（Invitrogen）进行转染。收集细胞用于流式检测和mi RNA的提取、检测。7转染si RNA-PTEN经负选得到CD8 T细胞后,PTEN的敲除采用si RNA-PTEN（20μM,Invitrogen）,cs/control,转染试剂为RNAi MAX（Invitrogen）,孵育6h后加CD3/28刺激,收集细胞流式检查。si RNA阴性对照为非特异性Stealth RNAi?Negative Control Duplexes8增殖试验转染（24小时）后,用Cell Trace TM Violet（Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA）在37℃下标记Jurkat细胞和原代CD8 T细胞15分钟,用完全培养基洗涤。在抗CD3/CD28（3μg/ml;Gibco,New York,NY,USA）存在下培养原代CD8 T细胞,孵育5天后,使用BD LSR Ⅱ流式细胞仪和Flow Jo软件分析分裂细胞。9检测细胞凋亡转染（72小时）后,用PE-Annexin V和7-AAD（Biolegend）染色Jurkat细胞。转染后（24小时）,使用抗CD3/CD28（3μg/ml）刺激原代CD8 T细胞,刺激（48小时）后,用PE-cy7-CD3,APC-cy7-CD8,PE-Annexin V和7-AAD（Biolegend）对CD8 T细胞染色。使用BD LSR Ⅱ流式细胞仪和Flow Jo软件分析细胞。10细胞周期测定使用BD Cycletest TM Plus DNA试剂盒（BD Biosciences）根据制造商提供的说明书测定细胞周期阶段。简而言之,转染后将Jurkat细胞培养72小时。转染后（24小时）,使用抗CD3/CD28（3μg/ml）在刺激下培养原代CD8 T细胞48小时。使用BD LSR Ⅱ流式细胞仪测定DNA含量的分布,并使用Flow Jo软件进行分析。11 IFN-γ和颗粒酶B的细胞内染色转染后（24小时）,使用抗CD3/CD28（3μg/ml）刺激原代CD8 T细胞24小时。流式检测前6小时,将蛋白质转运抑制剂（Golgi Stop;1μl/ml,BD Biosciences）加入培养物中。用PE-cy7-CD3和APC-cy7-CD8（Biolegend）对细胞染色。随后,通过在1X Perm/Wash缓冲液中在黑暗中孵育细胞15分钟,然后在4℃下与APC-IFN-γ和FITC-Granzyme B孵育30分钟来进行细胞内染色。染色后,将细胞固定在1%甲醛中。使用BD LSR Ⅱ流式细胞仪测定IFN-γ和颗粒酶B的细胞内表达,并使用Flow Jo软件分析数据。12 IFN-γELISPOT测定如制造商提供的说明书中所述,使用抗CD4 MAb包被的磁珠（Biolegend）从PBMC中去除CD4+T细胞。根据说明书,使用人IFN-γELISpot试剂盒（Mabtech,Nacka,Sweden）检测IFN-γ的分泌。转染后（24小时）,每孔加入2×105个CD4+T细胞耗尽的PBMC（一式两份）,体积为200μl。加入HIV-1 gag肽库（10μg/ml,Sigma）20小时。抗CD3/CD28（3μg/ml）用作阳性对照,阴性对照由无刺激的细胞组成。通过减去阴性对照（仅培养基）值计算IFN-γ分泌细胞的数量。阳性反应定义为>50个斑点形成单位/106个PBMC。13体外感染通过用HIV-1 p NL4-3质粒和水泡性口炎病毒糖蛋白质粒（VSV-G）转染293T细胞产生病毒颗粒。将mi R-19b mimcs,p NL4-3质粒和VSV-G质粒转染到293T细胞中以检测mi R-19对HIV产生的影响。2天后,通过ELISA（河北医科大学生物医学工程中心,河北,中国）测量上清液中p24的水平。对于Clone-X细胞的感染,用mi R-19b mimcs转染细胞24小时,随后用VSV-G假型HIV-1（NL4-3）病毒感染。感染后48小时通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的表达。使用具有复制能力的HIV-1病毒测试mi R-19b在原代CD4 T细胞中的作用。用mi R-19b mimcs或对照转染来自健康对照的分离的原代CD4 T细胞。转染后（24小时）,使用抗CD3/CD28（3μg/ml）刺激细胞。冷冻保存的初级HIV-1分离物（通过使用来自HIV-1感染的患者和健康供体的混合PBMC的共培养获得）被解冻并添加到细胞中。感染3天后收集上清液,通过ELISA测量上清液中p24的水平14统计分析主成分分析（Principal component analysis,PCA,Origin 9.1软件）分析具有不同疾病进展的HIV感染患者中mi RNA的分布。非参数Mann-Whitney检验用于确定LTNP-Hs和LTNP-Ls之间差异的mi RNA。配对t检验用于分析组间细胞功能的差异。使用SPSS 21.0和Graph Pad Prism Version 5.0软件包进行数据分析,P<0.05认为有统计学差异。结果:1.mi RNA表达谱将HIV感染长期不进展者分为两组对15例HIV感染者（9 LTNPs,6 TPs）和4例健康人的PBMC标本进行mi RNA表达谱（347个mi RNA）的分析,比较mi RNA在各组中的表达情况。对mi RNA表达的结果进行PCA分析,发现9例LTNPs、6例TPs和4例HCs能够明显的分为A、B两组。TPs与HCs分区较明显,所有的HCs都在B组中,绝大部分的TPs集中在A组中。而对于LTNPs,有6例集中在A组中,与TPs交互在一起,表明其mi RNA表达谱与TPs相近;而其它3例则集中在B组中表明其mi RNA表达谱与HCs相近。A、B两组中的LTNPs的病毒载量间有明显差异（P=0.024）。2.LTNP-Ls与LTNP-Hs之间差异性表达的mi RNA对mi RNA表达谱进行分析,按adj.P<0.05（adj.P,Benjamini-Hochberg FDR矫正后的P值）并且Fold Change>2的标准来分析在LTNP-Ls与LTNP-Hs间差异表达的mi RNA,发现有78个mi RNA符合标准,其中有55个mi RNA表达上调,23个mi RNA表达下调（见附表1）,无监督的聚类分析发现,这78个mi RNA能够很好的区分LTNP-Ls与LTNP-Hs。为了排除由于HIV感染以及感染时间的不同导致的mi RNA表达差异,我们排除了LTNPs分别与HCs和TPs差异性表达的75个mi RNA（P<0.05,Fold Change>2）。在排除LTNPs分别与HCs和TPs差异的mi RNA后,只留下了3个mi RNA,分别是mi R-15a、mi R-19b和mi R-33。根据筛查结果,我们比较了mi R-15a、mi R-19b和mi R-33在LTNP-Ls与LTNP-Hs之间的表达情况,发现mi R-15a（adj.P=0.024）、mi R-19b（adj.P=0.048）和mi R-33（adj.P=0.024）均在LTNP-Ls的PBMC中高表达3.mi R-19b在LTNP-Ls中高表达为了进一步的验证在LTNP-Hs与LTNP-Ls组件差异性表达的mi RNA,我们又选取了18例符合标准的LTNPs标本,其中,10例为LTNP-Hs,8例为LTNP-Ls,。通过提取PBMC中的RNA,逆转录并q RT-PCR分析mi RNA分别在LTNP-Hs与LTNP-Ls中mi R-19b、mi R-15a和mi R-33的表达情况。相对定量分析发现,与LTNP-Hs相比,mi R-19b在LTNP-Ls中高表达（P=0.034）,而mi R-15a与mi R-33在两组间没有差异。筛查与验证结果表明,mi R-19b在LTNP-Ls中特异性高表达。4.mi R-19b在LTNP-Ls的CD4和CD8细胞中高表达前期实验结果均是在PBMC的水平上进行检测的,而PBMC的成分比较复杂,包含了淋巴细胞、单核细胞等,。为了进一步明确mi R-19b在细胞亚群中表达情况。用流式的方法将LTNPs的PBMC进行分选,分得CD4 T淋巴细胞、CD8 T淋巴细胞以及单核细胞。q RT-PCR检测mi R-19b在这三个细胞亚群中的表达情况,发现mi R-19b在LTNP-Ls的CD4（P=0.041）和CD8（P=0.028）中显着高于LTNP-Hs,而在单核细胞中,LTNP-Hs与LTNP-Ls间没有统计学差异,见图4。结果表明,mi R-19b主要是在LTNP-Ls的淋巴细胞中高表达。5.mi R-19b在Jurkat细胞系中对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响用转染试剂将mi R-19b mimcs转染入Jurkat T细胞系中高表达mi R-19b,分析其对细胞增殖的影响,转染5天后,流式细胞仪检测细胞表面Celltrace TM Violet平均荧光强度,结果发现,高表达mi R-19b的Jurkat细胞Celltrace TM Violet平均荧光强度显着低于对照组（P=0.013）,说明mi R-19b的高表达能够促进细胞的增殖。转染2天后,流式细胞仪检测,发现mi R-19b能够促进G2/M的表达（P=0.033）,说明mi R-19b的高表达能够促进细胞的周期。转染2天后,细胞染色7-AAD和Annexin V,流式检测细胞凋亡,发现mi R-19b能够抑制Jurkat细胞的早起凋亡（P=0.005）。6.mi R-19b调控CD8细胞功能为了检测mi R-19b对CD8细胞增殖的影响,在转染mi R-19b mimcs后加入CD3/28刺激,刺激浓度为3ug/m L,培养5天后流式检测,结果表明mi R-19b的上调促进对CD8细胞的增殖（P=0.010）。培养2天后流式检测,发现mi R-19b的上调抑制CD8细胞的早期凋亡（P=0.009）。为了研究mi R-19b对CD8细胞胞内IFN-γ和Granzyme B的调控作用,在转染mi R-19b mimcs后加入CD3/28刺激,培养24小时后流式检测,在检测前6小时加入胞内蛋白转运抑制剂（Golgi Stop）,流式结果表明mi R-19b的上调能够显着促进对CD8细胞IFN-γ（P=0.006）和Granzyme B（P=0.002;）的分泌。7.mi R-19b靶向调控PTEN运用生物信息学分析的方法,分析mi R-19b靶基因的涉及到的细胞信号通路(（http://diana.imis.athena-innovation.gr/）,结果发现Fox O信号通路是mi R-19b靶基因参与的重要信号通路并且与细胞周期的调控严密相关。因此,我们在Jurkat T细胞中转染mi R-19b mimcs高表达mi R-19b,q RT-PCR检测Fox O信号通路中关键基因的表达情况,发现基因PTEN被显着下调（P<0.001）,而以往的研究已经明确了PTEN是mi R-19b的靶基因,mi R-19b能够下调PTEN。8.PTEN的下调影响CD8细胞功能为了检测PTEN的下调对CD8细胞增殖的影响,在转染si RNA-PTEN后加入CD3/28刺激,刺激浓度为3ug/m L,培养5天后流式检测,结果表明PTEN的下调促进对CD8细胞的增殖（P=0.040）。培养2天后流式检测,发现PTEN的下调抑制CD8细胞的早期凋亡（P=0.047）。为了研究PTEN的下调对CD8细胞胞内IFN-γ和Granzyme B的调控作用,在转染si RNA-PTEN后加入CD3/28刺激,培养24小时后流式检测,在检测前6小时加入胞内蛋白转运抑制剂（Golgi Stop）,流式结果表明PTEN的下调能够显着Granzyme B（P=0.006）的分泌,而对CD8细胞IFN-γ的分泌也有明显的上调趋势（P=0.094）。9.在HIV感染者中,mi R-19b对CD8细胞功能的影响在HIV感染者的CD8细胞中,通过转染mi R-19b mimcs的方法高表达mi R-19b,发现mi R-19b的高表达能够促进HIV感染者CD8细胞的增殖（P=0.010;）,促进分泌Granzyme B（P=0.003）和IFN-r（P=0.010）,而对CD8细胞的早期凋亡有抑制作用（P=0.040）。在HIV感染者的CD8细胞中,通过转染mi R-19b inhibitor的方法下调mi R-19b的表达,与mi R-19b高表达的结果相反,mi R-19b的低表达能够抑制HIV感染者CD8细胞的增殖（P=0.043）,抑制分泌Granzyme B（P=0.049）和IFN-r（P=0.023）,而对CD8细胞的早期凋亡有促进作用（P=0.035）。在HIV感染者的CD8细胞中,通过转染si RNA-PTEN的方法下调PTEN的表达,与mi R-19b高表达的结果一致,PTEN的下调能够促进HIV感染者CD8细胞的增殖（P=0.043）,促进分泌Granzyme B（P=0.049）和IFN-r（P=0.023）,而对CD8细胞的早期凋亡有抑制作用（P=0.035）。10.mi R-19b通过靶向PTEN调控HIV感染者CD8细胞在HIV感染者分选的CD8细胞中,共转mi R-19b inhibitor和si RNA-PTEN,检测CD8细胞增殖、凋亡、分泌Granzyme B和IFN-r的能力。。mi R-19b inhibitor和si RNA-PTEN共转后,与对照组相比,CD8细胞增殖、凋亡、分泌Granzyme B和IFN-r的能力没有统计学差异,结果表明PTEN的下调扭转了mi R-19b inhibitor对HIV感染者CD8 T细胞功能的影响,进一步的证实了mi R-19b通过靶向PTEN影响CD8细胞的功能。11.在HIV特异性多肽刺激下,mi R-19b对IFN-r分泌的影响前期实验结果表明,在CD3/28刺激条件下,mi R-19b能够靶向PTEN促进CD8T细胞分泌IFN-r,为了更进一步的探索mi R-19b在HIV特异性抗原刺激条件下依然能够调节CD8细胞分泌IFN-r的能力,对HIV感染者的PBMC细胞,利用磁珠法去除CD4 T淋巴细胞,在HIV Gag多肽刺激的条件下进行ELISPOT检测IFN-r的分泌情况。结果表明,在HIV Gag多肽刺激下,mi R-19b高表达能够促进IFN-r的分泌（P=0.041）;mi R-19b低表达能够抑制IFN-r的分泌（P=0.020）12.mi R-19b的高表达抑制HIV病毒的产生在293 T细胞系中,共转包装HIV病毒的质粒p NL4-3和mi R-19b mimcs,48小时后ELISA法检测细胞上清中P24的表达情况。结果发现,mi R-19b高表达的293T细胞上清中P24的浓度显着低于对照组（P=0.040）。接着在Clone X细胞（GFP表达指示病毒感染）中,高表达mi R-19b后,用相同滴度HIV假病毒感染,结果发现,GFP的表达率在mi R-19b高表达组显着低于对照组（P=0.007）。最后,我们分选了正常人的CD4 T淋巴细胞,转染mi R-19b mimcs高表达mi R-19b后,用从HIV感染者中分离出来的真病毒感染CD4细胞,检测上清中P24的表达情况,结果显示,mi R-19b高表达的CD4 T淋巴细胞上清中P24的浓度显着低于对照组（P=0.001）。结论:1通过对LTNPs的mi RNA表达谱分析,发现mi RNA的表达能够将LTNPs对病毒的不同控制水平很好的分开,mi R-19b在LTNP-Ls中特异性高表达。2.通过检测mi R-19b高表达后对CD8细胞功能的影响,证实mi R-19b能够靶向PTEN促进CD8细胞的增殖、促进分泌IFN-r和Granzyme B、抑制早期凋亡。3.在HIV感染者中,mi R-19b靶向PTEN调控CD8细胞功能并在HIV特异性抗原刺激下,mi R-19b能促进HIV感染者的抗病毒反应。4 mi R-19b抑制T细胞中HIV的产生。
郭家梅[7]（2018）在《RNase H活性升高对HIV-1复制和聚合酶抑制剂的影响及NPB524抗HIV-1作用机制研究》文中提出HIV-1逆转录酶（Reverse Transcriptase,RT）是抗艾滋病药物研发的经典靶点,该酶具有三种酶活性:RNA依赖的DNA聚合酶（RNADependentDNAPolymerase,RDDP）活性,DNA 依赖的 DNA 聚合酶（DNA Dependent DNA Polymerase,DDDP）活性和核糖核酸酶H（RNase H）活性,这三种酶活性协调催化逆转录过程。虽然逆转录过程中RT的聚合酶活性（包括RDDP和DDDP活性）和RNase H活性均必不可少,但目前上市的12个逆转录酶抑制剂均为聚合酶活性抑制剂,包括核苷类逆转录酶抑制剂（Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制（non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NNRTIs）。目前尚无以RNase H活性为靶点的药物上市,相对其他艾滋病药物靶点,针对RNase H的研究空间相对较大。HIV-1逆转录过程由RT聚合酶活性和RNase H活性协调催化。而聚合酶抑制剂NRTIs和NNRTIs是WHO推荐的一线艾滋病治疗药物,即抑制RT聚合酶活性是必须的。本论文提出并试图证实如下两个假设:①当聚合酶抑制剂与RNase H抑制剂联合使用时,由于聚合酶活性和RNase H活性同时被抑制,可能使这两种酶活性重新达到平衡,由此导致治疗效果不及单独使用聚合酶抑制剂。②若在应用聚合酶抑制剂抑制聚合酶活性的同时升高RNase H活性,将加剧两种酶活性的失衡,可能达到更优的抗HIV-1效果。本论文构建并应用表型混合（Phenotypic Mixing）病毒模型提高HIV-1病毒颗粒中的相对RNase H活性,考察了 RNase H活性升高对HIV-1复制和聚合酶抑制剂NRTIs及NNRTIs药效的影响。结果显示,RNase H活性升高抑制HIV-1的复制;RNase H 活性升高可提升 HIV-IRT-K10N 和 HIV-1RT-Y181c 对 NVP 的敏感性;RNase H活性升高可提升HIV-lRT-D67N/K70R/T215F对AZT的敏感性。本研究还发现当向HIV-1RT-M184V病毒颗粒引入50%的野生型RT时,HIV-1RT-M184V对3TC的敏感性与野生型HIV-1 一致,即不再产生耐药。该结果与K.Van Laethem等人的临床研究结果一致,提示表型混合病毒模型可用于研究突变病毒比例与耐药出现的相关性。我们还应用该结果验证了胞浆中的RT进入病毒衣壳结构调节逆转录过程的可能性。结果显示,胞浆中的野生型RT并未提升HIV-1RT-M184V对3TC的敏感性,提示胞浆中的RT无法进入病毒衣壳结构调节逆转录过程。本部分内容的研究结果提示,HIV-1逆转录过程中RT聚合酶活性和RNase H活性的平衡十分重要。①RNase H活性升高导致两种酶活性失衡,从而抑制HIV-1复制。②RNase H活性升高有利于聚合酶抑制剂的抗突变HIV-1药效。③通过向细胞浆提供外源性RNase H无法达到升高RNase H活性的目的,继续寻找RNase H激活剂是直接有效的方法。药用植物来源的天然产物是抗病毒药物的重要来源。本课题组前期研究发现从丹参细胞培养物的脂溶性成分中分离得到的化合物NPB524具有良好的抗HIV-1活性,半数抑制浓度为30 nM。本论文研究了该化合物的抗HIV-1作用机制,发现NPB524为HIV-1转录抑制剂。综上所述,本论文包含两部分内容:第一部分研究了逆转录过程中RT聚合酶活性与RNase H活性的失衡对HIV-1复制和聚合酶抑制剂药效的影响,证实了RNase H活性升高抑制HIV-1的复制,并有助于提升部分耐药病毒对聚合酶抑制剂的敏感性,期望拓宽以RNase H为靶点的抗HIV-1药物研发思路。第二部分确认了天然产物NPB524具有抗HIV-1活性,机制研究显示NPB524为HIV-1转录抑制剂,期望能为该类药物的研究提供物质基础。
马力[8]（2017）在《宿主因子调控HIV-1感染的分子机制研究》文中指出虽然高效抗逆转录病毒治疗（HAART）能够显着降低血液中病毒载量,延长感染者寿命,但不能清除体内持续（潜伏）感染的HIV-1,这成为当前根治HIV/AIDS的主要障碍之一。HIV-1 LTR启动子驱动的前病毒DNA转录水平的抑制是病毒建立和维持潜伏感染的关键。多种细胞因素参与HIV转录调控,包括转录调控因子的表达和组蛋白或前病毒DNA表观遗传学修饰等。研究宿主因子调控HIV-1转录作用,可深入理解HIV-1潜伏感染机制和鉴定新的抗病毒靶点,利于HIV/AIDS根除策略的发展。实验室前期工作通过多种基因组学分析,筛选和鉴定了一系列能够调控HIV-1转录的宿主因子。其中,SAFB1（Scaffold Attachment Factor B1）和RBMX（RNA Binding Motif Protein,X-Linked）是一对能够相互结合的宿主蛋白,能够结合DNA/RNA或染色质,调控基因转录。我们利用质粒过表达实验证实两者能可抑制HIV-1的复制。本论文中,我们深入研究了这两个蛋白的抗病毒机制,发现两者分别都可抑制HIV-LTR驱动的前病毒DNA的转录,维持病毒的潜伏感染,但具体机制上稍有不同。1)SAFB1结合于HIV-1 LTR,抑制RNA聚合酶II磷酸化,抑制HIV-1前病毒DNA转录的起始和延伸,维持病毒潜伏我们首先分析了SAFB1对HIV-1感染调控,发现SAFB1能够显着抑制野生型HIV-1在原代CD4+T细胞中的复制。进一步分析显示SAFB1抑制HIV-1转录起始和转录延伸。机制上,SAFB1能够结合于HIV LTR,该结合可能依赖于组蛋白H3;从而介导核酸非依赖方式结合于RNA聚合酶II,阻止RNA聚合酶II ser2磷酸化及在HIV DNA上的富集。结构域分析显示SAFB1抗病毒活性依赖于C端R/G富含区域。在CD4+T细胞潜伏感染模型中,SAFB1的缺失促进HIV-1前病毒DNA的重激活。本研究阐明了SAFB1抑制HIV-1转录,限制病毒感染及维持病毒潜伏的作用机制。2)RBMX抑制HIV-1 LTR转录,维持病毒潜伏通过相同实验方法,我们发现RBMX抑制HIV-1的转录延伸,从而抑制整合HIV-1 LTR驱动基因转录。RBMX同样能够显着抑制野生型HIV-1感染CD4+T细胞,维持HIV-1前病毒潜伏感染。此外,RBMX能够结合于HIV LTR核小体1和核小体2处,以及组蛋白H3上,但RBMX并不影响RNA聚合酶II的磷酸化。进一步实验发现RBMX表达干涉并不影响SAFB1抗病毒活性,同时SAFB1也不参与RBMX抗病毒活性。说明RBMX抑制HIV-1转录的机制不同于SAFB1,二者各自独立调控病毒转录。结构域功能分析显示,RBMX富含丝氨酸和精氨酸以及富含酪氨酸的区域,对其抗病毒活性有重要作用。后者能够结合于染色质参与生物学功能,提示RBMX有可能通过调控染色质活跃状态调控HIV-1转录。研究揭示了RBMX调控HIV-1转录维持病毒潜伏的作用,具体作用机理有待进一步研究。本研究揭示了宿主因子SAFB1及RBMX可以通过抑制HIV-1前病毒DNA转录来维持潜伏感染,加深了对于HIV-1潜伏机制的理解。对于这些宿主因子的进一步筛选与分析有助于拓展我们对于病毒潜伏感染的认识,提出针对潜伏感染的新方案,进而开发出有效清除潜伏病毒感染的策略。
李立[9]（2016）在《HIV-1编码的microRNA-TAR和IncRNA MALAT1在HIV-1感染巨噬细胞中的作用研究》文中研究指明目的： （1）当前有很多研究报道显示病毒编码的miRNAs在病毒复制以及病毒与宿主之间的相互作用中发挥着重要作用。然而关于来源于HIV-1的TAR元件的miR-TAR-3p是否表达及其在病毒复制中的功能研究却很少有文章报道。由此,本文试图研究HIV-1编码的miR-TAR-3p在HIV-1感染的人外周血单核细胞衍生的巨噬细胞（Monocyte-derived macrophages, MDM）中的表达及其在HIV-1复制中的作用。（2） MALAT1 （metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript）是肿瘤中一种常见长链非编码RNA,很少有文献报道MALAT1在外周血分离的MDM中的研究,我们试图利用蛋白质组学研究MDM中的长链非编码RNAMALAT1的功能以及分子机制,而MDM又是HIV-1的靶细胞,我们试图研究MALAT1在HIV-1感染的MDM中的作用。方法：（1）首先利用RT-qPCR检测miR-TAR-3p在HIV-1感染的患者外周血以及MDM中的表达；然后利用合成的miR-TAR-3p mimics和miRNA inhibitor转染进MDM后检测gag基因和p24蛋白的表达;并利用荧光素酶报告基因检测miR-TAR-3p对HIV-1转录的影响；之后再用细胞因子芯片检测miR-TAR-3p对巨噬细胞中细胞因子的影响；最后利用荧光素酶报告基因试验检测HIV-1编码的其他miRNAs对HIV-1转录的影响。 （2）首先利用RT-qPCR证实MALAT1在MDM中的表达；接着利用蛋白质组学检测MDM中MALAT1调控的所有蛋白表达以及相关功能情况；然后利用RT-qPCR检测HIV-1感染之后长链非编码RNA MALAT1和抗病毒miR-125b的表达量变化；最后转染MALAT1 siRNA之后,检测MDM中MALAT1和抗HIV-1感染的miR-125b的表达情况。结果： （1）我们检测到HIV-1感染病人外周血中以及细胞模型中有miR-TAR-3p的表达。合成的miR-TAR-3p mimics明显抑制HIV-1在巨噬细胞中的复制,合成的miR-TAR-3p Inhibitor mimics明显促进了HIV-1在巨噬细胞中的复制。双荧光素酶报告基因实验显示miR-TAR-3p通过结合5’LTR的TAR元件来抑制HIV-1的转录。利用细胞因子芯片技术来筛选有表达变化的细胞因子时,没有发现有明显变化的细胞因子。HIV-1编码的miR-N367以及miR-TAR-3p可以抑制HIV-1基因组的转录,而miR-H1对HIV-I基因组的转录没有影响。（2）RT-qPCR结果显示长链非编码RNA MALAT1在MDM中有表达。利用蛋白质组学研究MALAT1调控的蛋白,总共鉴定到4709个蛋白,包括26个上调的差异蛋白和51个下调的差异蛋白,其中STAT1的表达量明显下调,GO功能注释显示和signaling, viral reproduction相关。HIV-1感染的MDM中MALAT1表达量上升,而miR-125b表达量下降。干扰MALAT1表达的MDM中,STAT1表达量下降,miR-125b表达量上升。结论：（1）我们的研究揭示了HIV-1编码的miR-TAR-3p存在于HIV-1感染的病人外周血以及巨噬细胞中,功能研究显示miR-TAR-3p可能作为负调控因子调控HIV-1的复制。 （2）我们的研究发现MALAT1在巨噬细胞中可能发挥着重要的抗病毒免疫作用,也发现MALAT1在HIV-1感染中可能扮演重要角色。这可能对于后期利用MALAT1作为一个HIV-1潜在的治疗靶点提供理论基础。
吕艳茹[10]（2014）在《HBx蛋白对肝细胞肝癌中C19MC基因簇以及miR-1269b的表达调控》文中研究说明[目的]肝细胞肝癌是原发性肝癌中最多见的恶性肿瘤,死亡率仅次于胃癌、食道癌。HBV的感染与肝细胞肝癌的发生密切相关。MicroRNAs（miRNAs）是一类真核生物中广泛存在的,内源性的大小约21—23个碱基的单链小分子RNA。近年来的研究表明,miRNA和人的包括癌症在内的多种疾病的发生紧密相关。以往的研究表明,在HBV相关的肝细胞肝癌中,miRNA的表达谱发生了显着的变化。但是,HBV调控miRNA表达变化的机制目前尚不清楚。在本课题中,我们通过深度测序,发现了在HBV阴性肝癌组织和HBV 阳性肝癌组织中差异表达的miRNA:C19MC基因簇和miR-1269b。本项研究的目的是研究HBV感染导致C19MC基因簇和miR-1269b异常表达的分子机制。[方法]首先,通过深度测序检测在HBV阴性和HBV阳性肝癌组织中差异表达的miRNA,并选取了我们感兴趣的miRNA:C19MC基因簇和miR-1269b作为进一步研究目标。通过qRT-PCR方法,在肝细胞肝癌组织和细胞中,验证C19MC基因簇和miR-1269b的差异表达以及HBx蛋白调控其表达。接下来,综合文献和生物信息学预测C19MC基因簇上游甲基化岛,qRT-PCR检测去甲基化后C19MC基因簇的表达。同时qRT-PCR检测HBx蛋白对DNMT3A和DNMT1表达的影响。此外,我们利用qRT-PCR检测,HBV和HBx蛋白对miR-1269b初始转录本的影响并利用生物信息学网站预测构建miR-1269b的启动子。在293T细胞和HepG2细胞中,通过双荧光素酶报告系统验证miR-1269b启动子的活性以及HBV和HBx蛋白对miR-1269b启动子的作用。进一步预测miR-1269b启动子可以结合的转录因子,双荧光素酶报告系统检测HBx蛋白调控的转录因子NF-κB对miR-1269b启动子的作用。通过构建NF-κB结合位点缺失的miR-1269b启动子,双荧光素酶报告系统确定NF-κB是否直接结合miR-1269b启动子。同时通过qRT-PCR检测NF-κB对miR-1269b表达的影响。[结果]qRT-PCR结果证实HBV可以下调C19MC基因簇和miR-1269b的表达。在此基础上,转染HBx过表达质粒导致C19MC基因簇和miR-1269b表达下调。由此,推测HBV通过HBx蛋白下调C19MC基因簇和miR-1269b的表达。接下来,生物信息学预测和qRT-PCR结果证明C19MC基因簇受上游甲基化岛的调控。转染HBx过表达质粒可上调甲基化转移酶DNMT3A和DNMT1的表达,证明HBx蛋白通过促进甲基化转移酶DNMT3A和DNMT1的表达,使C19MC基因簇上游甲基化岛过甲基化,从而抑制C19MC基因簇的表达。此外,利用qRT-PCR检测到HBx可以抑制miR-1269b初始转录本的表达。通过构建miR-1269b的启动子,双荧光素酶报告系统验证了 HBV和HBx蛋白对miR-1269b启动子的抑制作用以及HBx蛋白调控的转录因子NF-κB可以结合并抑制miR-1269b启动子。在此基础上,将NF-κB结合位点缺失的miR-1269b启动子与N F-κB过表达或敲降质粒共转,初步确定了 NF-κB对miR-1269b启动子的直接抑制作用。同时,通过qRT-PCR证明NF-kB抑制miR-1269b成熟体的表达。[结论]在HBV相关的肝细胞肝癌中,HBV病毒感染可以通过HBx蛋白影响宿主细胞的DNA甲基化水平和转录因子NF-κB,从而实现对C19MC基因簇和miR-1269b的抑制作用。此外,这是首次发现HBV可以影响miR-1269b的表达。这些发现,有利于我们进一步阐明,在HBV相关的肝细胞肝癌中,HBV病毒引起miRNA表达变化的机制,有助于我们更好的理解HBV感染与肝细胞肝癌发生发展的关系。
二、Tat和TAR对人免疫缺陷病毒HIV-1基因表达的调控研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Tat和TAR对人免疫缺陷病毒HIV-1基因表达的调控研究（论文提纲范文）
（1）HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词和中英文对照表 |
| 第一部分 :HIV-1 病毒Nef蛋白抑制剂的筛选和及其作用机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 HIV的研究背景 |
| 1.2 Nef蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 Nef蛋白的基本特征 |
| 1.2.2 Nef介导的HIV病毒躲避免疫监控的机制 |
| 1.3 抗HIV-1药物的研究进展 |
| 1.3.1 抗HIV-1的治疗方法 |
| 1.3.2 抗病毒药物的种类 |
| 1.3.3 开发抗病毒药物的靶标 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.3 实验主要质粒和小分子 |
| 2.1.4 主要试剂耗材 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受试者临床样本入排标准及医学伦理 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 外周血单个核细胞(PBMCs)的分离 |
| 2.2.4 人原代T淋巴细胞的分离培养 |
| 2.2.5 贴壁细胞系的传代 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.7 HEK293T细胞转染实验 |
| 2.2.8 流式细胞术 |
| 2.2.9 单轮感染试验 |
| 2.2.10 病毒体外扩增和感染实验 |
| 2.2.11 自体CD4~+和CD8~+T细胞共培养实验 |
| 2.2.12 细胞毒性杀伤实验 |
| 2.2.13 分子对接 |
| 2.2.14 Western Blot实验 |
| 2.2.14 免疫共沉淀 |
| 2.2.15 蛋白纯化实验 |
| 2.2.16 表面等离子体共振实验 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 高通量筛选Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂,恢复MHC-I的表达 |
| 3.2 洛伐他汀有效抑制Nef介导的MHC-I下调 |
| 3.3 洛伐他汀拮抗Nef介导的CD4和SERINC5 的下调以及抑制病毒颗粒的内源性感染性 |
| 3.4 在野生型HIV-1 感染期间,洛伐他汀可以抑制MHC-I和 CD4 分子的下调 |
| 3.5 洛伐他汀的预处理可增强HIV-1 感染者对重新激活的潜伏库的自体CTL应答 |
| 3.6 洛伐他汀直接作用于Nef,阻断Nef与 AP-1 的相互作用 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 展望 |
| 第6章 结论 |
| 第二部分 :通过整合微小RNA组(mi RNAome)和转录组分析鉴定呼吸道合胞体病毒(RSV)引起的小儿肺炎中mi RNA与 m RNA的互作关系 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 病人样本收集 |
| 2.2 RNA提取实验 |
| 2.3 高通量测序 |
| 2.4 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.5 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 利用高通量测序分析RSV轻症肺炎和RSV重症肺炎患儿全血标本中mi RNA和mRNA差异表达 |
| 3.2 对选定的mi RNA进行验证,鉴定潜在的诊断性mi RNA生物标志物 |
| 3.3 差异表达miRNA靶基因的预测与鉴定 |
| 第4章 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 细胞株来源 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）基于GPI锚定双功能HIV进入抑制剂的基因治疗策略（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一部分 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 软件 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 抗体 |
| 1.1.5 其他试剂和耗材 |
| 1.1.6 质粒 |
| 1.1.6.1 用于制备HIV-1、HIV-2和SIV病毒的质粒 |
| 1.1.6.2 用于制备慢病毒的质粒 |
| 1.1.6.3 用于表达GPI锚定膜融合抑制剂的表达质粒 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 重组慢病毒的制备及滴度测定 |
| 1.2.2 稳定表达外源基因(GPI锚定抗病毒分子)的HIV靶细胞系的构建 |
| 1.2.3 FACS分析外源基因在稳转HIV靶细胞系中的表达 |
| 1.2.4 Confocal鉴定外源基因定位于细胞脂筏区域 |
| 1.2.5 假型病毒(HIV-1、SIV和VSV-G)和复制型病毒(HIV-1和HIV-2)的制备 |
| 1.2.6 测定假型病毒和复制型病毒的滴度 |
| 1.2.7 评价外源基因在HIV靶细胞中的抗病毒能力 |
| 1.2.8 HIV-1包膜蛋白介导的细胞融合试验 |
| 1.2.9 HIV-1细胞间传播试验 |
| 1.2.10 FACS分析外源基因在HIV-1病毒生产细胞系中的表达 |
| 1.2.11 评价HIV-1病毒在表达外源基因的生产细胞系中的生产情况及其感染能力 |
| 1.2.12 Western blotting分析外源基因在HIV-1病毒生产细胞系中的表达对病毒包膜糖蛋白前体gp160加工处理的影响 |
| 1.2.13 Western blotting分析外源基因在HIV-1病毒生产细胞系的表达对病毒包膜糖蛋白gp41亚基掺入至病毒颗粒的影响 |
| 第二部分 膜锚定强效HIV膜融合抑制剂的构建及抗病毒活性的评价 |
| 结果 |
| 2.1 GPI锚介导抗病毒多肽在细胞膜上脂筏区域的表达 |
| 2.2 GPI-2P23修饰后的TZM-bl细胞有效地抵抗不同亚型的HIV-1病毒、HIV-2病毒和SIV病毒的感染 |
| 2.3 GPI-2P23修饰后的TZM-bl细胞有效地抵抗T20耐药性病毒感染 |
| 2.4 GPI-2P23能有效地阻止HIV-1包膜蛋白介导细胞间融合 |
| 2.5 GPI-2P23能有效地阻止细胞间病毒传播 |
| 2.6 GPI-2P23修饰后的人源CD4~+T细胞抵抗HIV-1病毒感染 |
| 2.7 GPI-2P23修饰后的CEMss-CCR5细胞在HIV-1感染细胞中具有选择性存活和增殖优势 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 膜锚定HIV膜融合抑制剂作用机制的研究 |
| 结果 |
| 3.1 GPI-CP28的构建及其抗病毒活性的评估 |
| 3.2 PBD序列对于GPI锚定膜融合抑制剂发挥抗病毒作用是非常关键的 |
| 3.3 Linker对于GPI锚定膜融合抑制剂不是必需的 |
| 3.4 GPI锚定膜融合抑制剂在HIV-1生产细胞系HEK293T中的表达 |
| 3.5 GPI锚定膜融合抑制剂限制子代病毒的释放并抑制其感染能力 |
| 3.6 GPI锚定膜融合抑制剂干扰病毒包膜蛋白的加工处理过程 |
| 3.7 GPI锚定膜融合抑制剂抑制病毒包膜蛋白gp120和gp41掺入到病毒颗粒 |
| 3.8 GPI-CP41修饰后的人CD4~+T细胞抵抗不同嗜性的HIV-1病毒感染 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 膜锚定双功能进入抑制剂的研究 |
| 结果 |
| 4.1 以gp41为靶标构建GPI锚定CP41和10E8双功能进入抑制剂 |
| 4.1.1 构建GPI锚定CP41和10E8双功能进入抑制剂 |
| 4.1.2 基于细胞融合试验,验证GPI锚定CP41和10E8是强效的双功能进入抑制剂 |
| 4.2 以gp120和gp41靶标构建GPI锚定m36.4和CP41双功能进入抑制剂 |
| 4.2.1 构建GPI锚定m36.4和CP41双功能进入抑制剂 |
| 4.2.2 基于细胞融合试验,验证GPI锚定m36.4和CP41是强效的双功能进入抑制剂 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五部分 全文总结 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 研究中的不足和有待进一步解决的问题 |
| 发表论文 |
| 综述 HIV基因和细胞治疗策略研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）激活细胞内天然免疫抑制乙型肝炎病毒和艾滋病毒感染（论文提纲范文）
| 论文研究目的和创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 肝星状细胞Toll样受体3(TLR3)激活抑制乙型肝炎病毒感染 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 HBV病毒结构和复制周期 |
| 1.2 肝脏天然免疫与HBV |
| 1.2.1 Toll样受体信号通路 |
| 1.2.2 RIG-I样受体信号通路 |
| 1.2.3 干扰素信号通路及抗病毒ISG |
| 1.3 肝星状细胞与肝脏免疫 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞与质粒 |
| 2.1.2 实验耗材与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 Real time-PCR检测细胞RNA |
| 2.2.4 ELISA检测LX-2细胞上清中IFN-β和IFN-λ1/3的表达 |
| 2.2.5 ELISA检测HepG2细胞上清中HBeAg和HBsAg的表达 |
| 2.2.6 Western blot检测细胞内蛋白表达 |
| 2.2.7 MTS检测PolyI:C对LX-2细胞的毒性作用 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 PolyI:C对LX-2细胞的毒性作用 |
| 3.2 PolyI:C诱导LX-2细胞表达IFN-β和IFN-λ |
| 3.3 PolyI:C诱导LX-2细胞内IRF3和IRF7激活 |
| 3.4 TCI抑制PolyI:C诱导的IFN和IRF表达 |
| 3.5 TLR3激活的LX-2细胞上清对HBV的抑制作用 |
| 3.6 LX-2细胞产生的IFN在抗HBV作用中发挥重要作用 |
| 3.7 PolyI:C处理的LX-2细胞上清诱导HepG2细胞表达ISG |
| 3.8 PolyI:C处理的LX-2细胞上清激活HepG2细胞JAK/STAT信号通路 |
| 第四章 讨论 |
| 第二部分 激活胞质DNA感受器抑制人类免疫缺陷病毒感染巨噬细胞 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 HIV/AIDS |
| 1.1.1 HIV/AIDS概述 |
| 1.1.2 HIV结构和复制周期 |
| 1.1.3 HIV治疗 |
| 1.2 DNA感受器与天然免疫 |
| 1.2.1 DNA感受器概述 |
| 1.2.2 DNA感受器与HIV |
| 1.3 IFN信号通路与HIV |
| 1.4 MicroRNA与HIV感染 |
| 1.5 CC趋化因子和HIV感染 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验耗材与试剂 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 病毒株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 细胞活力检测 |
| 2.2.4 HIV病毒感染 |
| 2.2.5 细胞内总RNA提取及逆转录PCR |
| 2.2.6 Real time-PCR检测细胞内mRNA和HIV病毒RNA表达 |
| 2.2.7 Real time-PCR检测巨噬细胞内microRNAs表达 |
| 2.2.8 巨噬细胞上清中HIV逆转录酶(HIV RT)活性检测 |
| 2.2.9 提取巨噬细胞内DNA检测HIV Strong Stop DNA水平 |
| 2.2.10 Western blot检测巨噬细胞蛋白表达 |
| 2.2.11 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测巨噬细胞上清中蛋白的表达 |
| 2.2.12 中和抗体抑制IFN与其受体结合实验 |
| 2.2.13 共聚焦显微镜观察感染或未感染的巨噬细胞形态 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Poly(dA:dT)或poly(dG:dC)对巨噬细胞的毒性作用 |
| 3.2 DNA感受器激活对HIV感染的影响 |
| 3.3 DNA感受器激活诱导巨噬细胞表达IFN-β和IFN-λ1 |
| 3.4 DNA感受器激活诱导巨噬细胞IRF3和IRF7磷酸化 |
| 3.5 Poly(dA:dT)激活巨噬细胞JAK/STAT信号通路 |
| 3.6 DNA感受器激活诱导巨噬细胞内抗HIV ISG表达 |
| 3.7 DNA感受器激活诱导CC趋化因子抑制HIV病毒进入巨噬细胞 |
| 3.8 Poly(dA:dT)和poly(dG:dC)刺激诱导抗HIV microRNA表达 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 读博期间发表的文章 |
| 毕业感言和致谢 |
（4）瑞香烷型二萜化合物NB6及白藜芦醇激活潜伏HIV作用机制的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词语对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 HIV/AIDS背景概述 |
| 1.1.1 HIV病毒组成 |
| 1.1.2 HIV感染复制和AIDS |
| 1.2 HIV潜伏形成的机制 |
| 1.2.1 HIV整合极性与HIV潜伏 |
| 1.2.2 染色质表观遗传机制与HIV潜伏 |
| 1.2.3 宿主转录因子与HIV潜伏 |
| 1.2.4 HIV Tat介导的转录延伸与HIV潜伏 |
| 1.2.5 Tat介导的转录延伸与超级转录延伸复合物(SEC) |
| 1.2.6 P-TEFb与其激酶抑制性复合体7SK SNRNP |
| 1.3 HIV潜伏的治疗策略 |
| 1.3.1 “Shock and Kill”策略 |
| 1.3.2 “Shock”和HIV潜伏激活剂 |
| 1.3.3 “Kill”和HIV特异性免疫的增强 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株及质粒 |
| 2.1.2 实验主要试剂耗材和设备 |
| 2.1.3 合成的引物或者序列 |
| 2.1.4 常用溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 流式细胞术 |
| 2.2.3 荧光素酶检测 |
| 2.2.4 细胞内总RNA的提取 |
| 2.2.5 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 真核细胞质粒瞬时转染 |
| 2.2.8 PCR扩增IkBα基因 |
| 2.2.9 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.10 限制性内切酶酶切与DNA连接反应 |
| 2.2.11 质粒感受态细胞转化 |
| 2.2.12 Western blot实验 |
| 2.2.13 总细胞蛋白样品的制备 |
| 2.2.14 核抽提总蛋白抽提 |
| 2.2.15 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.16 外周血单核细胞(PBMCs)的分离 |
| 第三章 实验结果 |
| 第一部分 NB6激活潜伏HIV机制的研究 |
| 3.1.1 NB6激活潜伏HIV病毒基因的转录表达 |
| 3.1.1.1 HIV潜伏激活剂的筛选及筛选到的化合物分子的结构特点 |
| 3.1.1.2 NB6在纳摩尔浓度下激活潜伏HIV |
| 3.1.2 NB6协同经典的HIV潜伏激活剂激活潜伏HIV |
| 3.1.3 NB6通过PKC蛋白途径激活潜伏HIV |
| 3.1.4 NB6通过NF-κB蛋白途径激活潜伏HIV |
| 3.1.5 NB6激活NF-κB后依赖于CDK9活性来促进HIV转录起始 |
| 3.1.6 NB6促进ELL2的mRNA水平及蛋白水平的上调 |
| 3.1.7 NB6促进ELL2蛋白上调依赖于PKC-NF-κB途径 |
| 3.1.8 NB6不引起7SK snRNP复合物的解离,但是促进ELL2-SEC的增加 |
| 3.1.9 NB6促进Tat招募更多的ELL2-SEC |
| 3.1.10 NB6不会引起CD4+T淋巴细胞的全面活化 |
| 3.1.11 NB6促进治疗后HIV患者PBMCs产生HIV病毒颗粒 |
| 第二部分 RES激活潜伏HIV机制的研究 |
| 3.2.1 RES在Tat存在下显着促进HIV基因的转录表达 |
| 3.2.2 RES提升HIV Tat的蛋白水平 |
| 3.2.3 RES促进Tat招募了更多的SEC组分 |
| 3.2.4 RES促进Tat的表达与FoxO1蛋白相关 |
| 3.2.5 RES通过激动AKT来促进Tat的表达 |
| 第四章 结果讨论与展望 |
| 4.1 结果讨论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及鼠细胞模型探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 利用dcas9基因激活系统改进HIV-1体外病毒扩增检测 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 5 实验结论 |
| 第二部分 利用dCas9基因激活系统改进HIV-1鼠细胞模型 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 5 实验结论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 在学期间获奖、参加会议及学术成果 |
| 致谢 |
（6）HIV感染长期不进展低病毒复制者中miRNA对外周血CD8+T细胞功能的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :HIV感染长期不进展miRNA表达谱的分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 miRNA筛查阵列分析 |
| 2.3.2 外周血单核细胞亚群分选 |
| 2.3.3 逆转录和荧光实时定量 PCR |
| 2.3.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miRNA表达谱将长期不进展者分为两组 |
| 3.2 LTNP-LS与 LTNP-Hs之间差异表达的miRNA |
| 3.3 与LTNP-Hs相比,miR-19b在 LTNP-Ls中高表达 |
| 3.4 miR-19b在 LTNP-Ls的 CD4和CD8 细胞中高表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :miR-19b对 CD8 细胞功能的影响及调控机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组: |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 原代细胞的分离和Jurkat细胞的培养 |
| 2.3.2 转染miRNA mimics |
| 2.3.3 逆转录和实时荧光定量PCR |
| 2.3.4 转染siRNA-PTEN |
| 2.3.5增殖实验 |
| 2.3.6 检测细胞凋亡 |
| 2.3.7 细胞周期测定 |
| 2.3.8 IFN-r和颗粒酶B的细胞染色 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 miR-19b在 Jurkat细胞系中对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响.. |
| 3.2 miR-19b调控CD8 细胞功能 |
| 3.3 miR-19b靶向调控PTEN |
| 3.4 PTEN的下调影响CD8 细胞功能 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :miRNA-19b在 HIV感染者中对CD8 细胞功能及病毒复制的影响研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 原代细胞的分离和培养 |
| 2.3.2 转染miRNA mimics |
| 2.3.3 逆转录和实时荧光定量PCR |
| 2.3.4 转染siRNA-PTEN |
| 2.3.5增殖实验 |
| 2.3.6 检测细胞凋亡 |
| 2.3.7 IFN-r和颗粒酶B的细胞内染色 |
| 2.3.8 IFN-r ELISPOT测定 |
| 2.3.9 体外感染 |
| 2.3.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 在HIV感染者中,miR-19b对 CD8细胞功能的影响 |
| 3.2 miR-19b通过靶向PTEN调控CD8 细胞 |
| 3.3 在HIV特异性多肽刺激下,miR-19b对 IFN-r分泌的影响 |
| 3.4 miR-19b的高表达抑制HIV病毒的产生 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 对本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）RNase H活性升高对HIV-1复制和聚合酶抑制剂的影响及NPB524抗HIV-1作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 1. 常规分子生物学实验 |
| 2. 常规细胞生物学实验 |
| 3. 应用HIV1重组病毒模型评价化合物药效 |
| 4. 表型混合HIV-1病毒模型的建立 |
| 4.1 逆转录酶真核表达质粒的构建 |
| 4.2 逆转录酶的表达与纯化 |
| 4.3 逆转录酶的酶活性测定 |
| 4.4 突变pNL4-3.Luc.R~-E~-质粒的构建 |
| 4.5 表型混合HIV-1的制备 |
| 4.6 病毒p24含量测定 |
| 4.7 病毒浓缩 |
| 5. 检测RNase H活性升高对HIV-1复制的影响 |
| 6. 检测RNase H活性升高对聚合酶抑制剂药效的影响 |
| 7. 可控定量表达逆转录酶稳转细胞系的构建 |
| 8. 检测3TC在逆转录酶稳转细胞中的抗HIV-1_(RT-M184V)药效 |
| 9. NPB-524抗HIV-1作用机制研究 |
| 9.1 MTS法检测NPB524对细胞增殖的影响 |
| 9.2 NPB524抗VSV-G/HIV-1药效检测方法 |
| 9.3 NPB524抗HIV-1活病毒药效检测方法 |
| 9.4 Time of Addition(TOA)实验 |
| 9.5 检测NPB524对HIV-1转录和翻译的影响 |
| 9.6 检测NPB524对启动子转录活性的影响 |
| 第一部分 RNase H活性升高对HIV-1复制及聚合酶抑制剂药效学的影响 |
| 1. 升高HIV-1病毒颗粒的相对RNase H活性 |
| 1.1 初步选择逆转录酶突变位点 |
| 1.2 成功表达并纯化野生型和7种突变逆转录酶p66亚基 |
| 1.3 野生型和7种突变逆转录酶p66亚基酶活性测定 |
| 1.4 野生型HIV-1及7种表型混合HIV-1的包装和复制能力 |
| 2. RNase H活性升高可抑制HIV-1的复制 |
| 3. RNase H活性升高对聚合酶抑制剂药效的影响 |
| 3.1 RNase H活性升高对聚合酶抑制剂抗野生HIV-1药效无显着影响 |
| 3.2 RNase H活性升高对聚合酶抑制剂抗耐药HIV-1药效的影响 |
| 4. 聚合酶活性升高对3TC抗HIV-1_(RT-M184V)药效的影响 |
| 5. 胞浆中外源性逆转录酶无法影响HV-1逆转录过程 |
| 第一部分 讨论 |
| 第一部分 结论 |
| 第二部分 NPB524抗HIV-1作用机制研究 |
| 1. NPB524对细胞增殖无影响 |
| 2. NPB524扰HIV-1活性 |
| 3. NPB524抗HIV-1作用机制研究 |
| 3.1 NPB524作用环节初步确认 |
| 3.2 NPB524对HIV-1转录和翻译的影响 |
| 3.3 NPB524对HIV-1翻译无影响 |
| 3.4 NPB524对NF-κB和Tat诱导的LTR转录活性的影响 |
| 3.5 NPB524抑制Tat诱导的Sp1介导的LTR转录活性 |
| 第二部分 讨论及结论 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）宿主因子调控HIV-1感染的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 宿主因子SAFB1 调控HIV-1 复制及潜伏研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞 |
| 2.2 质粒、shRNAs及 siRNAs |
| 2.3 病毒 |
| 2.4 HIV-1潜伏感染前病毒重激活 |
| 2.5 细胞转染及荧光素酶检测 |
| 2.6 HIV-1感染实验 |
| 2.7 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.8 蛋白免疫印迹(Western Blotting) |
| 2.9 mRNA抽提与RT-PCR检测 |
| 2.10 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.11 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.12 激光共聚焦显微实验 |
| 2.13 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SAFB1 抑制HIV-1 感染HEK293T细胞 |
| 3.2 SAFB1 表达干涉促进HIV-1 感染CD4~+T 细胞 |
| 3.3 SAFB1 抑制HIV-1 转录起始和转录延伸 |
| 3.4 SAFB1 抑制整合LTR驱动的转录 |
| 3.5 SAFB1 通过C末端R/G-富含区发挥抗病毒活性 |
| 3.6 SAFB1 结合HIV LTR及组蛋白H3 |
| 3.7 SAFB1 结合并促进RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化 |
| 3.8 内源性SAFB1 表达干涉促进T细胞中潜伏HIV前病毒的重激活 |
| 3.9 PMA刺激下调SAFB1在HIV-1 潜伏T细胞中的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 宿主因子RBMX调控HIV-1 复制及潜伏研究 |
| 1.引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞 |
| 2.2 质粒、shRNAs和 siRNAs |
| 2.3 病毒及包装 |
| 2.4 HIV-1感染实验 |
| 2.5 细胞转染及荧光素酶检测 |
| 2.6 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.7 蛋白免疫印迹(Western Blotting) |
| 2.8 m RNA抽提与(RT-)PCR检测 |
| 2.9 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.10 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.11 激光共聚焦显微镜实验(Confocal) |
| 2.12 HIV-1潜伏感染前病毒激活 |
| 2.13 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RBMX抑制SAFB1 转录延长 |
| 3.2 RBMX抑制整合HIV LTR驱动转录 |
| 3.3 RBMX结合于HIV LTR |
| 3.4 RBMX结构域分析 |
| 3.5 RBMX抑制HIV-1 感染HEK293T |
| 3.6 RBMX抑制HIV-1 感染CD4~+T 细胞 |
| 3.7 内源性RBMX的表达干涉促进T细胞潜伏HIV-1 前病毒重激活 |
| 3.8 RBMX结合宿主因子SAFB1 |
| 3.9 RBMX与 SAFB1 独立负调控HIV-1 感染 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HIV-1感染阻断与功能性治愈研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（9）HIV-1编码的microRNA-TAR和IncRNA MALAT1在HIV-1感染巨噬细胞中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 HIV-1编码的microRNA-TAR在HIV-1感染的巨噬细胞中的作用研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论与展望 |
| 第二部分 长链非编码RNA MALAT1在巨噬细胞中的作用研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 已发表及待发表论文 |
| 后记 |
（10）HBx蛋白对肝细胞肝癌中C19MC基因簇以及miR-1269b的表达调控（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、HBV阴性和HBV 阳性肝癌组织中差异表达miRNA的筛选和验证 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 HBV阴性和HBV 阳性肝癌组织中差异表达miRNA的深度测序结果 |
| 1.2.2 C19MC基因簇和miR-1269b在HBV阴性和HBV 阳性肝癌组织中的差异表达 |
| 1.2.3 在肝细胞肝癌细胞中深度测序结果的验证 |
| 1.3 小结 |
| 二、HBx蛋白对C19MC基因簇表观调控的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HBV1.3倍体和HBx蛋白对C19MC基因簇初始转录本的影响 |
| 2.2.2 C19MC基因簇上游CpG岛的预测 |
| 2.2.3 C19MC基因簇的表达受甲基化调控 |
| 2.2.4 HBV1.3倍体和HBx蛋白上调DNMT1和DNMT3A的表达 |
| 2.3 小结 |
| 三、HBx蛋白对miR-1269b表达调控机制的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 HBV1.3倍体和HBx对miR-1269b初始转录本pri-miR-1269b的影响 |
| 3.2.2 miR-1269b启动子的预测、构建以及启动子活性的检测 |
| 3.2.3 HBV1.3倍体和HBx抑制miR-1269b启动子活性 |
| 3.2.4 调控miR-1269b启动子活性的转录因子的预测及验证 |
| 3.2.5 NF-kB直接结合并抑制miR-1269b启动子活性 |
| 3.2.6 NF-kB负性调控miR-1269b的表达 |
| 3.3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 microRNA与RNA病毒研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、Tat和TAR对人免疫缺陷病毒HIV-1基因表达的调控研究（论文参考文献）
- [1]HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究[D]. 张旭. 广州医科大学, 2020(01)
- [2]基于GPI锚定双功能HIV进入抑制剂的基因治疗策略[D]. 靳红亮. 北京协和医学院, 2020(05)
- [3]激活细胞内天然免疫抑制乙型肝炎病毒和艾滋病毒感染[D]. 张标. 武汉大学, 2019(06)
- [4]瑞香烷型二萜化合物NB6及白藜芦醇激活潜伏HIV作用机制的研究[D]. 冯泽明. 厦门大学, 2019(09)
- [5]基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及鼠细胞模型探索[D]. 王蓓蕊. 北京协和医学院, 2019(02)
- [6]HIV感染长期不进展低病毒复制者中miRNA对外周血CD8+T细胞功能的调控研究[D]. 殷林波. 中国医科大学, 2019(01)
- [7]RNase H活性升高对HIV-1复制和聚合酶抑制剂的影响及NPB524抗HIV-1作用机制研究[D]. 郭家梅. 北京协和医学院, 2018(02)
- [8]宿主因子调控HIV-1感染的分子机制研究[D]. 马力. 苏州大学, 2017(06)
- [9]HIV-1编码的microRNA-TAR和IncRNA MALAT1在HIV-1感染巨噬细胞中的作用研究[D]. 李立. 武汉大学, 2016(07)
- [10]HBx蛋白对肝细胞肝癌中C19MC基因簇以及miR-1269b的表达调控[D]. 吕艳茹. 天津医科大学, 2014(04)