一、丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析（论文文献综述）
高又文[1]（2020）在《野生鼠血清标本中持续性G病毒感染的分子流行病学研究》文中认为研究背景持续性G病毒（Pegivirus）是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科持续性G病毒属,具有与丙型肝炎病毒属病毒相类似的基因组结构。流行病学研究显示,该病毒属病毒能够感染人、马、猪、猿猴、蝙蝠以及鼠等哺乳动物。野生鼠（包括家鼠）与人类生活密切,是多种病原体重要的传播宿主。关于鼠持续性G病毒（rodentpegivirus,RPgV）感染野生鼠及其流行病学特征的调查资料尚少,只有两篇报道,分别是Kapoor等在仓鼠科沙漠林鼠血清中检测到rodent pegivirus,以及Firth等在纽约居民区采集的鼠科挪威鼠体内检测到rat pegivirus。中国尚无野生鼠携带pegivirus病毒的流行病学资料。第一个持续性G病毒,人持续性G病毒（human pegivirus,HPgV）于1995年被发现,当时称为庚型肝炎病毒（HGV）或者GB病毒C型（GBV-C）,后来发现HGV并不引起病毒性肝炎,反而可以延缓HIV感染者的疾病进程。但2015年,在马病毒性肝炎血清中分离到的Theilar氏疾病相关病毒（Theilar’s disease associated virus,TDAV）,被认为是该病的病原体,说明持续性G病毒可能具有致病性。随着研究的广泛开展,pegivirus病毒受到越来越多的关注,新的pegivirus病毒也在不断被发现。2015年,人pegivirus 2型病毒（HPgV-2）在丙型肝炎患者或反复输血的血友病患者样本中检测到,其序列既有最早发现的人pegivirus病毒序列的特征,又具有丙型肝炎病毒HCV的序列特征,流行病学研究显示,HPgV-2与HCV感染密切相关,但其致病性尚待确定。此外,在猿猴体内检测到的pegivirus序列也存在新大陆与旧大陆猴SPgV之间的序列差异。而在有着病毒库之称的蝙蝠体内发现的pegivirus病毒序列具有更丰富的多样性。深入研究不同动物和人类感染的持续性G病毒序列,能够为该病毒属病毒的来源、传播与进化提供信息。研究目的本研究以广东省广州市白云和越秀城区以及福建省厦门市城区作为研究现场,在人群密集处采集野生鼠,研究中国野生鼠血清样本中是否存在pegivirus病毒感染,以及其血清学和分子流病学特征。在获得病毒序列的基础上,进行序列分析,研究pegivirus病毒的分子进化特征。研究方法1野生鼠样本的采集选取广东广州白云区,越秀区,福建厦门城区人群活动密集区域为调查现场。从2015年3月-2016年3月,采用笼捕法捕捉野生鼠样本,分离血清,进行种属鉴定,记录信息。2 pegivirus病毒的调查研究血清样本通过RNA抽提及逆转录后,使用针对NS3区序列的巢式引物检测核酸保守序列NS3部分区域,测序,进行序列相似性同源性分析,构建系统进化树。3 pegivirus血清学研究构建Luciferase荧光素酶和鼠pegivirus NS3或者E2蛋白融合表达的重组载体,在真核细胞中表达,收获抗原蛋白,建立荧光素酶免疫吸附方法（luciferase immunosorbent assay,LISA）检测鼠血清样本中抗RPgV NS3抗体和抗RPgV E2抗体。4 pegivirus全长序列分析扩增鼠pegivirus病毒全长序列,与Genbank数据库中下载的参考序列进行比对,分析序列特征,并利用贝叶斯统计模型分析序列进化信息。研究结果1野生鼠感染pegivirus病毒检测结果野生鼠携带pegivirus的种属类型包含2目2科5种。其中啮齿目鼠科占据了三个物种,分别是褐家鼠（Rattus norvegicus,219只,69.5%）,黄胸鼠（Rattus tanezumi/R.brunneusculus13 只,4.1%）,黄毛鼠（Rattus losea/R.rattus,34 只,10.8%）,此外还包含食虫目鼩鼱科的物种,鼩鼱（Suncus murinus,48只,15.9%）,褐家鼠是研究现场的优势鼠种。315份血清样本中RPgV RNA阳性样本为68份,野生鼠携带pegivirus病毒核酸检测总阳性率为21.6%。其中在219份褐家鼠血清样本中检测到62份阳性,阳性率28.31%;在13份黄胸鼠样本中检测到1份,阳性率为7.69%;在34份黄毛鼠血清样本中检测到2份,阳性率为5.88%,在48份鼩鼱样本中检测到3份阳性,阳性率为6.25%。本研究所获的鼠pegivirus序列与目前已知的RPgV序列（KJ950934,NC021154）均在一个分支。此外,本研究检测为阳性的动物种属中,除了已经报道的褐家鼠/挪威鼠之外,还包括黄胸鼠,黄毛鼠两类啮齿动物,以及食虫目的鼩鼱,但所有种属携带病毒的序列均落在RPgV分支,并无独特分支,说明本研究中不同种属的鼠样本中所感染的RPgV序列高度同源。2鼠pegivirus血清学调查结果利用荧光素酶免疫吸附方法共检测212份血清样本,其中NS3抗体阳性109份,阳性率为57.4%。NS3核酸和抗体双阳性样本26份,核酸阴性而抗体阳性样本为83份,核酸阳性但抗体阴性样本10份。同样的方法检测207份血清样本中的E2抗体,97份判定为阳性。其中,核酸和E2抗体双阳性样本97份,核酸阴性但E2抗体阳性样本为98份,核酸阳性但E2抗体阴性样本12份。NS3抗体和E2抗体两种检测方法检出结果差异显着。3 pegivirus病毒序列分析扩增获得三条野生鼠携带pegivirus病毒的近全长序列。在同一种属的pegivirus氨基酸序列比较中,相似度最高的序列集中在非结构蛋白NS3区域。在NS5B区与RatPgV相似度最高,与旧世界猿猴SPgV该区域的相似度最低。但是在E2,NS4B和NS5A区,本研究中RPgVs的氨基酸序列与同一分支内蝙蝠BPgV序列的相似性高于对应区域沙漠林鼠RodentPgV。此外,本研究中RPgVs序列与蝙蝠GBV-D和人HPgV-2型相比,蝙蝠序列在保守区NS3和NS5B的相似性高于人HPgV-2型。但是在E1,E2,NS2,NS4B和NS5A区域的氨基酸序列比较中,人HPgV-2型与本研究中RPgVs序列的相似度均高于同蝙蝠GBV-D的比较结果。通过Bayesian MCMC统计模型分析pegivirus病毒进化速率为 6.061 ×10-4/site/year。结论1首次在中国野生鼠体内检测到pegivirus,鼠种包括褐家鼠,黄毛鼠,黄胸鼠以及食虫目的鼩鼱体内也携带该病毒,扩充了 pegivirus的流行病学资料。本研究筛检序列NS3和NS5B区与挪威鼠ratPgV高度相似,符合国内外研究pegivirus的流行具有种属特异性的报道。2应用luciferase真核表达载体,建立了鼠pegivirus血清学检测方法。首次填补了 pegivirus病毒在鼠类宿主中的血清学资料。3扩增近全长序列。与基因库不同种属参考序列进行比对,发现鼠pegivirus病毒的不同编码区具有多样性。总体而言,持续性G病毒NS3区进化速率较慢,变异小,所有序列具有共同的起源,尚无证据说明该病毒跨种传播。
夏静[2]（2019）在《丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究》文中指出丙型肝炎（HCV）感染是一个全球性健康问题,全球范围共有7100万人感染了HCV。80%的患者急性感染后转化为潜伏感染,随着时间的推移,逐渐转变为肝硬化和肝癌。目前,HCV是唯一一种疫苗尚未商业化的肝炎病毒,尽管目前高效的直接抗病毒在HCV治疗方面取得了重要的进展,小分子药疗法会因出现耐药株（RAV）而治疗失败,并且直接抗病毒药物因其昂贵的售价,使得发展中国家的病人对其望而却步。更重要的是,尽管治愈,再次感染依旧会发生。世界卫生组织（WHO）计划在2030年内将HCV新感染患者人数降低90%,所以,一个有效的预防性疫苗对于对抗全球HCV流行至关重要。诱导出能与病毒包膜糖蛋白结合的广谱中和抗体是HCV疫苗研究的主要目标。因此,对于自然感染患者中的广谱中和抗体研究是必不可少的。我们从一个慢性丙肝感染患者体内分离出一株能与HCV包膜糖蛋白E2结合的人源抗体,命名为8D6。这株抗体展示出广谱中和抗体活性,即能中和细胞培养产生的所有亚型的HCV病毒颗粒（HCVcc）。通过功能和表位分析,我们发现8D6可以通过靶向E2保守区域进而阻断E2和受体CD81的结合。更重要的是,8D6对直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral reagents,DAA）耐药毒株也显示出了广谱中和活性。随后,我们对抗体序列进行分析时发现,8D6 CDRH3区域上存在一个二硫键桥基序（C-C）,并且在二硫键桥中恒定存在4个氨基酸（CX4C）,进一步研究发现,该二硫键桥一旦发生突变,抗体的广谱中和活性会大大降低,甚至丧失。并且这一基序在一类抗体之中都是保守的,说明抗体广谱中和活性的获得与二硫键桥息息相关。最后,我们重建了8D6推测的胚系（iGL）抗体基因并测试其与HCVcc的结合能力和中和活性,并从中找到了一个1b亚型的毒株PR79L9,8D6胚系抗体可以对PR79L9毒株产生很强的中和效果。这暗示了PR79L9毒株的E2序列可以作为疫苗抗原设计来诱导产生类似8D6的广谱中和抗体（bNAbs）。总之,我们发现了一个新的结合E2保守区的广谱中和抗体8D6,并且其胚系抗体可以作为一种潜在HCV疫苗株的探针。
李天一[3]（2019）在《云南红河州高危人群HIV及其共感染的HCV/HPgV-2病毒的分子流行病学研究》文中认为艾滋病1985年传入我国,近10年来,我国艾滋病的流行模式由血液和静脉吸毒传播为主转变为以性传播为主,经性传播的比例从2006年的33.1%增加到2017年的94.6%,其中异性性传播的比例为69.2%。在我国,估计有400-1000万女性性工作者（Female sex workers,FSWs）,1860岁成年男性约69%有嫖娼史,FSWs具有特殊的脆弱性,容易被边缘化,具有特别高的HIV（Human Immunodeficiency Virus）感染的负担,是HIV和其他性病从高危人群向一般人群传播的桥梁人群,FSWs及嫖客人群是应该受到特别重视的我国HIV流行的关键人群。HCV（Hepatitis C virus）主要经血液及经皮暴露传播,与HIV具有共同的传播途径和危险人群,共同感染十分普遍。HIV感染可增加HCV感染的风险,降低HCV的体内清除率,加快HCV感染的疾病进程,HCV感染也可加快HIV的疾病进展,HCV相关肝病也是HIV感染者主要的疾病和死亡原因。HPgV-2（Human pegivirus 2）是2015年由两个独立的研究小组报道的一种新的主要经血传播的人类病毒,属于黄病毒科的一个新属（Pegivirus）,目前,仅有几项研究证实其主要感染HCV阳性的人,对这个病毒与HIV和HCV感染的关系、致病性等目前尚无定论。云南省是我国艾滋病流行的起源地,红河州是云南省艾滋病疫情最为严重的地区。为了摸清红河州艾滋病流行的特点和规律,2008年5月至2014年6月,中国疾病预防控制中心汪宁教授课题组在云南红河州的开远、蒙自和河口针对暗娼和嫖客人群进行了艾滋病的流行病学研究,通过系列横断面研究和前瞻性队列研究,获得了FSW及嫖客人群的HIV新发感染率及其变化趋势、新发感染相关的危险因素、HIV阳性FSW二代传播的风险等一批重要的研究结果。本课题在此基础上,以历次调查确认的771名HIV阳性者为研究对象,利用采集并保存的血浆标本和调查信息,进行HIV的分子流行病学研究、与HIV共感染的HCV和HPgV-2的分子流行病学研究,目的是阐明当地高危人群中HIV及其共感染的HCV和HPgV-2的基因变异特征,从分子水平进一步揭示流行规律,明确病毒传播的关键环节,为HIV及其他两种病毒感染的防控提供依据。第一部分云南省红河州高危人群HIV感染的分子流行病学研究背景:HIV具有高度的变异性,HIV-1的M群广泛流行,可进一步分成A-D、F-H、J和K共9个亚型及88个流行重组型（Circulating Recombinant Forms,CRF）及无数的独特重组型（Unique Recombinant Forms,URF）。云南省是我国主要流行HIV-1毒株的传入地和重组毒株的起源地,流行毒株的分布有显着的地理、民族和传播途径的差异,对红河州以暗娼和嫖客为主的高危人群缺乏HIV-1基因亚型分布及长期变化的研究。方法:挑选HIV抗体确认阳性标本并整理背景信息,提取纯化血浆病毒RNA（Ribonucleic Acid）,一步法逆转录巢式PCR（Polymerase Chain Reaction）扩增HIV-1pol区约3100bp的片段并测序,进行下列研究:（1）病毒基因亚型:采用构建NJ（Neighbor-Joining）进化树和使用在线工具COMET和REGA的方法分型,两种工具分型结果一致且置信值为100%的为确定的分型结果,结合流行病学信息,分析基因亚型与人群特征的关系及随时间的变化。（2）病毒基因重组:用jpHMM软件进行病毒基因重组分析,将不同插入片段分别与标准参考株构建NJ进化树,判断重组片段的来源,分析不同高危人群的重组模式特征。（3）传播簇分析:对不同亚型的序列分组,剪切为相同长度,删除已知的耐药位点,构建ML（Maximum-likelihood）进化树,判断传播簇的标准是bootstrap大于990,基因距离小于0.015。分析成簇人员的特征以及成簇相关的因素。将HIV感染者的首次标本及其病毒基因序列分为20082010年、20082012年、2008年2014年3组,分别构建ML树并进行成簇分析,观察传播簇数目和规模随时间的变化。（4）耐药分析:将拼接编辑的pol区序列提交美国斯坦福大学的HIV耐药数据库（http://hivdb.stanford.edu）,通过序列比对确定耐药突变的位置、种类、耐药程度及药物敏感性的解释。（5）红河毒株与云南省流行毒株的关系:收集318例20082010年采样的云南各地HIV感染者的pol区基因序列,与本研究获得的序列一并构建进化树,对成簇的流行毒株构建MCC（Maximum clade credibility）进化树,分析红河州HIV-1毒株与云南省流行毒株的关系。结果:获得386例研究对象的HIV-1 pol区基因序列,除20082009年采样的标本扩增测序失败的比例显着高于其他时间采样的标本外,扩增测序成功与失败的人员在人口学特征方面均无显着性差异。获得的主要结果:（1）HIV-1基因亚型及其人群分布和时间变化:当地流行的HIV-1毒株比例由高到低依次为CRF08BC（62.95%）、CRF07BC（10.88%）、新型重组毒株URF（10.88%）、CRF01AE（8.03%）、C（6.99%）和B（0.26%）。各亚型HIV-1在各类人群的分布有显着差异,吸毒人群中CRF08BC的比例显着高于嫖客和暗娼人群;CRF01AE毒株几乎仅出现在不吸毒的嫖客和暗娼;HIV-1基因亚型的分布随时间呈现明显变化,CRF08BC的比例下降,在性传播人群中最为显着;暗娼人群中CRF07BC和CRF01AE的比例显着提高;嫖客人群中URF毒株的比例显着高于其他人群,是新型HIV-1毒株主要来源。（2）不同人群中新型重组毒株（URF）的基因重组模式有显着差异,B/C重组主要出现IDU（Intravenous Drug Users）人群,CRF01AE参与的重组主要出现在不吸毒的暗娼和嫖客人群,B/C重组的C亚型病毒骨架主要来源于CRF08BC或CRF07BC。（3）参与分析的386条序列形成32个传播簇,成簇率20.98%,簇的大小为28,含2条序列的簇占绝对优势（71.88%）,大部分簇内人员发生过商业性行为。年龄大（50岁以上）、单身、感染CRF07BC毒株等因素与成簇相关。虽然各亚型的成簇数均随时间而增加,但是簇内人员数和成簇率均未见增加,未见传播簇的扩张。（4）CRF07BC、C和CRF01AE均形成红河当地的流行簇,呈现奠基效应。结论:（1）CRF08BC是当地优势毒株,CRF01AE在不吸毒的嫖客和暗娼中的比例显着高于吸毒人群,当地正在发生优势毒株由CRF08BC向CRF07BC和CRF01AE的转变,与性传播超越静脉吸毒成为当地主要传播途径的转变是一致的。（2）IDU人群病毒的主要重组模式是B/C,多数源于CRF08BC或CRF07BC的二代重组。CRF01AE参与的重组主要出现在不吸毒的暗娼和嫖客,主要源于CRF01AE与CRF08BC或CRF07BC的二代重组。不吸毒的嫖客人群是新型重组毒株的孵化器,应密切监测。（3）HIV-1传播簇以含2条序列的小簇为主,形成传播簇的多为有IDU行为的人,推测IDU嫖客与IDU暗娼在从事性交易的同时,可能也常共用注射器吸毒。未见传播簇随时间的扩张,推测静脉吸毒的暗娼和嫖客多数以长期稳定的“对子”形式活动,很少有新成员加入。（4）主要流行毒株形成当地的流行簇,与云南其他地区交集不多,是艾滋病预防控制的有利条件。第二部分云南省红河州高危人群与HIV共感染的HCV分子流行病学研究背景:HCV的复制和突变速率均大于HIV-1,在RNA病毒中居首。目前将HCV分为7个基因型和83个亚型,1型和3型流行范围最广,4型和5型是低收入国家最常见的亚型。我国是HCV感染大国,已检出HCV 6个基因型的24个亚型。云南省是HCV的高流行地区,吸毒人群中HCV基因亚型复杂,各亚型毒株的分布有显着的地区差异。对红河州及以暗娼和嫖客为主且感染了HIV的人群,尚缺乏HCV基因亚型分布及其长期变化的研究。方法:挑选HIV抗体确认阳性标本并整理背景信息,进行下列研究:（1）用ELISA法检测HCV抗体,分析各类人群中HCV抗体阳性率的差异。（2）提取纯化血浆病毒RNA。（3）一步法逆转录巢式PCR扩增HCV CE2（1300bp）和NS5B（1000bp）区基因片段并测序。（4）分析HCV基因亚型:将CE2和NS5B区的序列质量控制后提交到COMET HCV比对网站,得出分型结果。再下载53条各基因型的参考序列,分别导入CE2和NS5B的fas文件,用MEGA 6构建NJ树,汇总两种方法的结果确定基因亚型。（5）HCV成簇分析:将序列构建ML进化树确定传播簇,传播簇的判断标准为bootstrap值大于99%、基因距离小于0.05。将研究对象的首次标本及其HCV基因序列分为20082010年、20082012年、20082014年3组,分别进行成簇分析,观察传播簇数目和规模随时间的变化,对主要流行毒株进行流行动力学分析。（6）HIV与HCV的共传播:对同时获得HIV和HCV序列的研究对象进行两种病毒传播簇的比较。结果:（1）检出HCV抗体阳性500例,仅静脉吸毒的人群（IDU）HCV抗体的阳性率是99.25%,有静脉吸毒行为的人群HCV抗体阳性率显着高于无静脉吸毒行为的人群（97.85%vs19.10%,P<0.05）。单纯嫖客人群和单纯暗娼人群HCV抗体的阳性率分别是36.89%和7.93%。（2）有357例HCV RNA扩增测序成功,其中CE2区334例、NS5B区293例,扩增测序成功率为71.2%,不同特征人群扩增测序的成功率无显着差异。依据CE2和/或NS5B区确定HCV基因亚型,构成比由高到低依次为3b（37.25%）、3a（26.05%）、6n（17.37%）、1b（10.36%）、6a（7.84%）和其他亚型（6k、6v和2a）。不同人群HCV基因亚型的分布有显着差异,暗娼人群6a多于1b,且未检出5个亚型（3b、3a、6n、1b、6a）以外的其他亚型。（3）HCV基因亚型的分布在20082011、20122014两个时间段呈明显变化,6n在各人群均呈下降趋势、6a在暗娼和嫖客人群显着上升、3a在吸毒人群中显着升高而在嫖客和暗娼人群中下降、3b在嫖客人群中显着升高,在其他人群中变化不大。（4）共确认30个传播簇,成簇率为16.81%,绝大多数（93.33%）为仅有2条序列的传播对。簇内人员为IDU嫖客与IDU暗娼的占75%、均为仅IDU人员的占25%、簇内人员同民族的居多（85.71%）、文化程度均偏低居多（66.67%）、含单身人士的居多（89.34%）,不同HCV基因亚型成簇率具有显着差异,由高到低依次是6a（37.04%）、3b（21.37%）、3a（17.02%）、6n（6.35%）、1b（5.41%）,不同类型高危人群的成簇率未见显着差异。（5）HCV传播簇的数目和成簇率随时间增加,但未见传播簇随时间而扩张,保持以2条序列的小簇为主。在同时获得HIV和HCV序列的研究对象中,有6对2种病毒均成簇,可能为共同传播。结论:（1）有静脉吸毒行为的人群HCV抗体阳性率最高。获得了性高危人群（暗娼和嫖客）HCV抗体阳性率的数据,明显高于目前所知异性传播HCV的水平,需要密切监测和研究。（2）HCV的基因亚型复杂,毒株的种类和分布正在发生变化,3b毒株在嫖客人群中的增加最为显着。（3）HCV的成簇率为16.81%,绝大多数为传播对,簇内人员的社会人口学特征多数相近,基本信息未知的人显示成簇率较高的趋势,提示调查依从性较差的人可能具有多重危险因素,感染和传播的危险较大。不同HCV基因亚型成簇率的差异,体现了不同毒株的流行和传播特征,成簇率较高的更多在共用注射器吸毒的人群中传播,成簇率低的可能主要通过偶发的针刺等事件传播。（4）未见传播簇随时间而扩张,提示当地共用注射器吸毒的人员长期保持稳定的关系,很少有新成员加入,HCV传播的增加主要是由于共用注射器吸毒的对子（2人）增加所导致的,预防控制的重点应该是减少新增吸毒人员。第三部分云南省红河州高危人群与HIV共感染的HPgV-2分子流行病学研究背景:HPgV-2是一个新的经皮传播的血源性传染性病毒,几乎所有确诊的HPgV-2病例都是与HCV双重感染,但在无HCV感染的人群中也有低流行率。在云南省的特殊高危人群中HPgV-2的流行状况如何?是否HPgV-2影响HIV和HCV感染的进程?都需要深入研究。由于这个病毒多数是与HIV和/或HCV共感染,对其致病性尚无定论。方法:挑选HIV抗体确认阳性标本并整理背景信息,进行下列研究:（1）检测HPgV-2抗体,采用自建的ELISA法检测HPgV-2抗体,分析不同特征人群抗体阳性率的差异。（2）提取纯化血浆病毒RNA。（3）获得HPgV-2基因片段并测序,采用逆转录巢式PCR扩增HPgV-2 NS3区长度为153bp的基因片段并测序,比较不同特征人群的HPgV-2 RNA阳性率。（4）高通量测序获得HPgV-2的全长基因组。（5）整理HPgV-2基因序列,质量控制后,进行系统进化分析,确定HPgV-2与其他Pegivirus属病毒的亲缘关系,比较全长序列各基因片段的基因离散率。（6）HIV和HCV载量的检测和比较:取全部HPgV-2 RNA阳性标本,挑选2倍数量HPgV-2 RNA阴性标本,两组标本HIV和HCV RNA均阳性,采样时间为同一年份、抗病毒治疗情况和传播途径相同。分别检测HIV和HCV载量。结果:（1）HIV-1感染者的HPgV-2抗体阳性率为25.29%,HIV抗体和HCV抗体均阳性者的HPgV-2抗体阳性率显着高于HIV抗体阳性而HCV抗体阴性者（27.69%vs 20.83%,p<0.05）。HPgV-2与HIV-1共感染率呈随时间升高的趋势。HIV-1感染者的HPgV-2核酸阳性率为5.32%,HIV-1与HCV同时阳性者的HPgV-2核酸阳性率高于仅仅HIV-1阳性者（6.37%vs 3.35%,p<0.05）。（2）单纯吸毒者、单纯暗娼嫖客人群和混合行为组,HPgV-2抗体和核酸的阳性率分别为38.57%和6.09%、21.75%和3.57%、19.55%和6.77%,单纯吸毒人群的阳性率显着高于暗娼和嫖客人群（p值均<0.01）。（3）HPgV-2核酸阳性组和阴性组的HCV载量平均值分别为1.11E+06cp/ml和7.19E+05cp/ml、HIV载量的平均值分别为5.36E+04cp/ml和2.14E+05cp/ml,均无显着性差异。（4）获得了7条HPgV-2的全基因组序列,红河的HPgV-2独自成簇,奠基者效应显着。鉴定出3个可能的传播簇,1个簇可能为HPgV-2与HIV和HCV的共传播。结论:（1）本研究特殊HIV感染的高危人群中,HPgV-2的流行率较高,可能与研究对象既有IDU等经皮经血暴露的行为,还有频繁的经性暴露行为有关。（2）HPgV-2感染最常发生于HCV阳性的人,常通过经皮经血途径传播,也可能存在经性传播。（3）未发现HPgV-2感染对HIV和HCV的复制有影响。（4）HPgV-2基因序列较为保守,红河的毒株在局部地区独立传播流行,与HIV和HCV的共感染比较罕见。静脉吸毒与性乱行为交织的高危人群是新病毒产生和传播的沃土,需要密切监测和深入研究。
吴涛[4]（2017）在《海南省HCV分子分型、分子进化及黎族HCV基因型6特殊病毒株的全基因组研究》文中指出背景:目前,全球有近1.8亿人感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）,而在中国约1000万为抗-HCV阳性。HCV至今尚缺有效的疫苗。依据Simmond系统,HCV可分为7个基因型和85个确定的以及20个待定的基因亚型。对HCV基因型分布及分子流行病学的研究,有助于控制HCV的播散。最新研究表明,中国HCV基因型以1b为主,占56.8%（582/997）;其次为2型、3型和6型。但是,中国的南北地区HCV基因型组成和播散趋势不尽一致。与北方不同,6a在华南地区已经取代2a成为当地的第二个主要流行的HCV基因亚型,并曾在广东河源发生快速流行。海南岛毗邻广东省,主要居民为汉族（83.33%）,其次是黎族（14.73%）。至今对海南岛的HCV分子流行病学研究较少。此外,海南黎族族源研究显示,其与南岛语系的多个族群有明显遗传渊源关系,其被称为“人类进入东亚入口的古老活化石”。至今HCV基因型6的各个亚型主要发现在东南亚地区流行。HCV基因型6因其遗传差异最大,亚型最复杂,已被视为HCV的最古老的病毒株,目前仍不断地发现新的HCV基因型6特殊病毒株——指不能归入已知的亚型的病毒株。HCV基因型6特殊病毒株由于病毒载量低、遗传差异大和缺乏参照序列,因此对该类病毒进行全长扩增是世界难题。前期研究发现部分来源于海南黎族的HCV基因型6病毒起源古老且独特。因此,对海南黎族的HCV基因型6特殊病毒株进行全长扩增,研究海南黎族的HCV基因型6与东南亚其他地区该型病毒的进化关系,将有助于补充该型病毒的生活史研究。目的:1.本研究首先通过研究海南省汉族和黎族人群中的HCV基因型分布和临床特点、高危因素来了解海南省HCV的感染概况。2.应用系统发育树分析（phylogenetic anlynasis）来了解海南汉族地区HCV的来源、传播模式和规律。3.从黎族中的HCV基因型6特殊病毒株中,对两株未知的病毒株HN1316和HN1350进行了全基因组扩增和测定。进一步分析黎族“HCV基因型6特殊病毒株”与东南亚地区的HCV基因型6毒株的进化关系。方法:1.样品来源:纳入2013.1～2014.6间收集的HCV-RNA阳性慢性HCV感染者血清标本246例（其中汉族176例,黎族70例）。基因的扩增和测序:巢式PCR扩增并测序Core-E1。数据分析:应用系统发育树分析海南汉族和黎族人群中HCV基因型的分布特点。2.应用BEAST 1.6软件和贝叶斯—马尔科夫链—蒙特卡洛（Bayesian—MCMC）方法对海南汉族与中国其他地区汉族的HCV序列进行种系地理学分析。最后,扩大海南汉族的慢性HCV感染者的病例数至402例,检测其基因分型,系统分析这些患者的流行病学特点和临床特点,Logistic回归分析海南地区HCV感染的高危因素。3.设计简并引物及特异性引物,通过“DNA walking on bridges and islands”策略进行多片段PCR扩增并测定两株未知的黎族病毒株——HN1316和HN1350的全基因组序列。继而采用生物信息学软件,进行核苷酸相似性分析,构建ML（Maximun Likelihood）系统进化树以估算它们的系统进化位置,进行基因重组测定分析,来确定新的基因亚型。结果:1.海南省汉族人群的HCV流行概况:（1）海南省汉族的163例样本基因型分布为:6a是最主要的亚型,其次是1b、3b、3a、2a和 1a:6a为 33.7%（55/163）,1b为 33.1%（54/163）,3b为 14.7%（24/163）,2a 为 6.7%（11/163）,3a 为 8.6%（14/163）和 1a 为 3%（5/163）。（2）种系地理学分析发现:海南的HCV与中国其它地区汉族的HCV交替分布于每一簇中。进而,扩大至402例后的检测基因型分布、流行病学特点和临床特点如下:（3）6a仍是最主要的亚型,其次是1b、3b、3a、2a和1a。（4）Logistic分析表明:海南HCV传播的高危因素分别是使用过污染的医疗器械（P<0.05）、使用血制品（P<0.05）和静脉吸毒（P<0.01）;卡方检验显示6a亚型中静脉吸毒明显高于其他亚型（P<0.01）。2.海南省黎族58例的基因型分布为:基因型6为94.8%（55/58）,1b为1.72%（1/58）、2a 为 1.72%（1/58）、3b 为 1.72%（1/58）。进一步对 55 例HCV 基因型 6 分析发现:6a 为 3.5%（2/58）,6xa 为 3.5%（2/58）,6w 为 5.2%（3/58）,6e 为 1.7%（1/58）,6v 为 1.7%（1/58）,6r 为 1.7%（1/58）,特殊病毒株为77.6%（45/58）。系统发育树分析显示这45株病毒明显有别于东南亚其他地区的病毒株而集聚为独立的进化簇。3.成功对HN1316和HN1350成功进行全基因组扩增。分析发现:两个病毒株与其他已知的6型全长序列的基因相似性在70～80%;接着构建ML系统进化树发现,HN1350与印度尼西亚、香港地区发现的6g、6w有着共同的祖先,HN1316与6a、6b、6xd和6ZS202、老挝地区发现的6L373有着共同祖先。进一步分析发现无明显流行病学关联的三个病毒株:HN1350（全长）、HN1314和HN1411三个序列之间基因差异在7.6～14%。结论:1.6a是海南汉族中最主要的感染基因型,其次为1b,提示6a在我国可能已经开始从广东地区快速传播开来。海南岛虽然与大陆隔海相望,但是海南省汉族人群同属于中国大陆汉族的HCV传播网络。2.海南黎族人群的HCV以基因6型为主,并发现多株基因6型的特殊病毒株且高度聚集,提示HCV基因型6病毒可能在黎族地区封闭地缓慢传播了非常长的时期。3.首次在黎族中发现一个HCV基因型6的新亚型。基因相似性结果显示HN1316和HN1350属于HCV基因型6,但不能归于已知亚型;这两个病毒株与东南亚周边地区来源的病毒有共同祖先,提示海南黎族可能是HCV基因型6起源的一部分;本研究中有三株病毒满足新基因亚型命题条件,可以命名一个HCV基因型6新亚型（6xg?）,联系HCV命名委员确认新命名的工作在进行中。
张静娜[5]（2016）在《高通量测序技术用于丙型肝炎病毒感染溯源调查》文中指出背景近年来我国的丙型肝炎聚集性疫情暴发事件时有发生。为了调查疫情暴发的源头、追踪传播关系,有针对性地制定预防控制方案,需要可靠的丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）感染溯源实验室检测数据提供支持。国外报道用于HCV感染溯源调查的实验室技术主要有巢式PCR产物直接测序法、PCR产物克隆测序法和终点有限稀释PCR产物测序法,其中巢式PCR产物直接测序法国内也有报道。巢式PCR产物直接测序法操作简便,但获得的信息量少,只能获得优势准种的核酸序列；而后两种方法可用于在准种水平上分析HCV感染者之间的传播关系,不足之处是操作比较繁琐、工作量大。第二代测序技术（Next-generation sequencing technology. NGS）的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis）,即通过识别新合成的序列末端的标识来确定DNA的序列,一次检测可以获得大量的核酸信息。目前应用较多的技术平台主要包括Illumina/Solexa Genome Analyzer（美国Illumina公司）、Applied Biosystems SOLID system （美国ABI公司）和Roche 454 FLX焦磷酸测序平台（美国454 Life Sciences公司）。其中Roche 454 FLX焦磷酸测序平台曾被用于未经过HCV抗病毒治疗的感染者病毒准种的变异性、HCV抗病毒治疗患者准种的变异性、HCV急性感染者病毒进化的瓶颈效应、HCV暴发调查等的研究中,但它因测序成本很高,用于HCV感染溯源调查的实用价值不大。本课题组曾将美国Illumina公司的Miseq高通量测序平台成功地用于肾透析人群HCV的传播关系调查。本研究拟利用美国Illumina公司开发、通量更高的Hiseq高通量测序平台（简称Hiseq测序）,建立基于准种分析的HCV感染溯源技术,并尝试用于静脉注射吸毒人群中HCV的传播关系调查,为今后应对丙型肝炎聚集性疫情暴发调查提供技术储备。目的1.建立并优化基于HCV准种分析的Hiseq测序技术；2.了解静脉注射吸毒人群中HCV感染者体内HCV准种的分布规律；3.探索Hiseq测序技术在HCV感染溯源调查中的应用。材料和方法1.研究对象1.1一例新近HCV感染者的溯源调查针对1例2015年1月15日在美沙酮门诊发现的HCV抗体阳转静脉注射吸毒者（编号P1）,调查在其可能感染HCV的时期内（2014年3月24日之后）与其共用针具、HCV抗体阳性的4例静脉注射吸毒者（编号P2-P5）的流行病学信息,并以与P1在同一美沙酮门诊服药或者居住在同一乡镇、HCV抗体阳性的28例静脉注射吸毒者（编号C1-C28）作为研究对照。分别采集上述33人的全血样品5 m1,离心后分离出血浆备用。1.2两个美沙酮门诊静脉注射吸毒HCV感染者间的传播关系研究针对2个美沙酮门诊H和L,收集2015年1-9月发现的所有静脉注射吸毒HCV抗体阳性者的血浆样品备用（编号分别为H1-H13、L1～L32）。2.实验方法2.1从血浆样品中提取RNA,然后逆转录合成cDNA。2.2 PCR产物直接测序：分别对NS5B基因区和Core/E1基因区进行PCR扩增,产物直接测序；根据序列结果对HCV样品进行基因亚型分析。2.3针对HCV HVR1区设计引物、优化反应条件。引物尽可能覆盖多种基因亚型,必要时设计多套引物。2.4针对HCV HVR1区,对cDNA进行PCR扩增；PCR产物纯化后,构建DNA文库,然后进行Hiseq测序。2.5 Hiseq测序数据初步处理后,统计每条独特序列出现的频数,了解HCV准种群分布情况；剔除重复序列后,获得每个样品的多个独特准种群序列,进行系统进化分析。结果1.一例新近HCV感染者的溯源调查1.1 HCV基因亚型：P1-P5与28份对照样品中有11份样品（P3和10份对照）HCV核酸检测为阴性,其余样品核酸检测为阳性,并获得了HCV基因亚型分析结果。P1和P2均为3b基因亚型,P4、P5分别为3a、6n基因亚型,据此可以排除P4、P5与P1之间存在传播关系的可能性。在18份核酸阳性样品中,8份（C7、C12、C14、C15、C16、C19、C20、C28）的基因亚型与P1相同。1.2 HCV准种群分布：在基因亚型为3b的10份样品中,9份（P1、P2、C7、 C12、C14、C15、C16、C19、C28） PCR扩增成功并进行Hiseq测序。Hiseq测序结果经初步处理后,9份样品分别得到了约百万条核酸序列,获得的有效序列数为249 753～1086 333条（平均869 608条）。剔除重复序列后,获得了3-172个（平均48个）独特准种群的序列。统计每份样品中各准种群序列出现的频率并由高到低依次排序,频数最大（最优势）的前2条序列的频数之和占该样品所有准种群总序列的比例都超过了38%,其中4份样品（C7、C15、C19、C28）超过了85%,有3份样品（C7、C19、C28）甚至超过了97%。1.3基因离散率：9份样品的样品内平均基因离散率为0.5%-13.2%,其中P1、C7、C16的均大于6%,样品内平均基因离散率的大小与HCV感染时间长短没有相关性。9份样品的样品间平均基因离散率为10.8%～25.0%,P1和P2间平均基因离散率为19.0%,与P1和其余7份样品间的基因离散率差异无统计学意义（P>0.05）。1.4系统进化树分析：从HCV序列数据库下载25条HCV 3b亚型参考株序列,与9份样品的准种群序列一起进行系统进化树分析。结果显示,P2、C12、C14、C15、C16、C19、C28的准种群各自聚集为一簇；C7的部分准种群和P1聚集为一簇,其余准种群单独聚集为一簇。和P1聚集在一簇的那部分C7准种群和P1间的平均基因离散率为6.4%（0～13.3%）,这与P1和其余7份样品间基因离散率的差异有统计学意义（P<0.05）。系统进化分析结果提示P1和C7间可能存在直接或间接的HCV传播关系。鉴于HCV可能存在多重感染的特点,在HCV传播关系的调查中样品间基因离散率的最小值这一指标比样品间平均基因离散率更有价值。2.两个美沙酮门诊静脉注射吸毒HCV感染者间的传播关系研究2.1 HCV基因亚型：美沙酮门诊H和L共有13份样品HCV核酸检测为阴性,其余样品核酸检测为阳性,并获得了HCV基因亚型分析结果。美沙酮门诊H有2份样品（H8、H12） HCV核酸检测为阴性；在11份核酸阳性样品中,1份（H1 1）为3a/3b基因亚型；7份H1、H3、H4、H7、H9、H10、H13)为3b基因亚型,2份（H5、H6）为6a基因亚型,1份（H2）为6u基因亚型。美沙酮门诊L有11份样品（L3、L5、L6、L7、L11、L15、L17、L20、L25、L29、 L32） HCV核酸检测为阴性；在21份核酸阳性样品中,5份（L8、L18、L21、 L28、L31）为1a基因亚型；1份（L14）为3a/3b基因亚型；6份（L1、L10、L12、L13、L16、L24）为3b基因亚型；1份（L19）为6m/6n基因亚型；4份（L4、L22、L23、L30）为6n基因亚型；其余4份L9、L26、L27)分别为6a、1b、6u、3a基因亚型。1b基因亚型只有1份样品,可以排除该HCV感染者与其他感染者间存在传播关系的可能性。2.2 HCV准种群分布：对上述基因亚型分析成功且同一基因亚型不少于2份的所有样品（共31份）进行HVR1区PCR扩增,结果有27份样品扩增成功并进行Hiseq测序。Hiseq测序结果经初步处理后,27份样品分别获得的有效序列数为366980～2732511条（平均1432153条）。剔除重复序列后,分别获得2-207个（平均45个）独特准种群的序列。统计每份样品中各准种群序列出现的频率并由高到低依次排序,频数最大（最优势）的前2条序列占所有准种群总序列的比例均超过了16%,其中12份样品（H1、H3、H4、H6、H9、H11、H13、 L1、L8、L16、L18、L31）超过了82%,甚至有8份样品（H3、H4、H6、H9, L1、L16、L18、L31）超过了96%。2.3基因离散率：27份样品的样品内平均基因离散率为0.4%～26.0%,其中H2、H6、H9、L14、L19、L23、L28、L30的均大于5%。大部分样品之间的最小基因离散率均大于5%,部分样品之间的基因离散率最小值为0,样品H6和H9之间的基因离散率最小值为0.4%,H11和L23、L30之间的基因离散率最小值均为0.4%,L8和L21之间的样品基因离散率最小值为1.9%,L21和L28之间的基因离散率最小值为4.8%。2.4系统进化分析：样品L28、L31的准种群序列各自单独聚集为一簇,样品L8、L18、L21的所有准种群序列和L23、L30的部分准种群序列聚集为一簇；L8和L21之间的基因离散率最小值为1.9%,样品L8和L23、L18和L23、L18和L30、L21和L23、L21和L30之间的平均基因离散率最小值均为0。样品H6的部分准种群序列和H9的准种群序列聚集在一起,H6和H9之间的基因离散率最小值为0.4%。样品H3、L10、L12、L14的准种群序列各自聚集为一簇,样品H1、H4、H9、H10、H11、H13、L1分别和L23、L30的部分准种群序列聚集在一起,L24和L23的部分准种群序列聚在一起,H11和L23、L30之间的平均基因离散率最小值均为0.4%,L24和L23之间的平均基因离散率最小值为0,其余样品和L23、L30之间的平均基因离散率最小值均为0,系统进化树与基因离散率的结果共同提示同一门诊内部分感染者之间以及2个门诊部分感染者之间均可能存在直接或间接的HCV传播关系。结论1.本研究建立了基于HCV准种分析的Hiseq测序技术。2.静脉注射吸毒人群中HCV感染者体内HCV准种呈多样性分布的特点。3.通过对1例新近HCV感染者的溯源调查,排除了其共用针具的3个HCV感染者与他之间的潜在传播关系,并找到了新的传播线索。4.通过对2个美沙酮门诊的HCV感染者进行溯源分析,结果提示同一门诊内部分感染者之间、以及2个门诊部分感染者之间存在直接或间接的传播关系。5.鉴于HCV可能存在多重感染的特点,在HCV传播关系的调查中样品间基因离散率的最小值这一指标比样品间平均基因离散率更有价值。6.Hiseq测序具有高通量、操作较简便、成本相对低的特点,在HCV感染溯源调查中具有较高的实用价值。
肖桂娥[6]（2014）在《广州地区丙型肝炎患者的HCV基因型相关研究》文中进行了进一步梳理研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染可导致75%-85%感染者发展为慢性肝病，是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病因，严重危害人类的健康和生命。全球HCV感染率约3.0%，即有1.7-2.0亿的HCV感染者；我国的HCV感染率约为2.5-4.9%，感染人数已超过3000万。HCV可经静脉吸毒、输血、性传播、垂直传播、或经破损的皮肤粘膜传播如手术、纹身、拔牙、共用卫生器具等。发达国家以静脉吸毒传播为主，我国早期以输血和血制品传播为主，在实行血液筛查HCV制度后，此传播途径大幅下降。但随着我国吸毒人群增多，经静脉吸毒感染HCV的比例增大。HCV基因型繁多，目前国内外常采用Simmonds命名法，将HCV分为6种基因型和80多种基因亚型。基因型分布有明显的地域差异性，la、lb、2a、2b、3a型呈全球广泛分布，其中1b型分布最广；中国以1b和2a型多见，其中以1b型为主，2a型主要分布在中国北部，3型主要分布在云南等西南地区，4型、5型报道罕见，6型主要见于香港、澳门及南方边境省份，6亚型最复杂，变异株最多，到目前为止，6型已发现有23个亚型。有报导广东地区献血员和静脉吸毒人群中，以1b和6a型为主，并发现新的6型变异株。而本地区丙型肝炎患者的HCV基型变化有待进一步研究。不同基因型的HCV对肝脏损伤程度不同，1b型对肝脏的损伤严重度大于其他基因型。目前多采用聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）α联合利巴韦林（RBV）进行抗病毒治疗，不同基因型感染者疗效不一，1、4型病毒应答率低于2、3型，因此，准确诊断HCV基因型对HCV抗病毒治疗方案选择及疗效判断至关重要。为了精准分型，国际上对HCV基因分型技术进行了长期研究。目前，HCV基因分型技术包括基因测序法、型特异性引物扩增法、探针杂交法、基因芯片法、限制性片段长度多态性分析（RELP）、异源分子迁移率分析法（HMA）等。对HCV全基因组测序是最准确的方法，但难度大、费时、成本高，临床上难以实行，而部分基因测序法相对简单易行，目前已将HCV基因NSB5区测序分型法视为“金标准”。但我们临床上常规采用国产商业试剂（探针杂交法）对HCV基因分型，此法只能分出1型与非1型，且准确率较低。鉴于基因分型方法存在的问题和广东地区HCV基因型的复杂性，为配合临床丙型肝炎诊疗的需求，本研究以广州地区丙型肝炎患者为主体，对其HCV基因相关问题进行了研究，包括临床切实可行的两种基因分型方法的准确性比较和HCV分子流行病学研究两部分内容。第一部分临床切实可行的两种基因分型法（部分基因测序法与探针杂交法）的准确性比较研究内容及目的比较临床常规使用的HCV部分基因测序法和探针杂交法对HCV基因分型的准确性，为临床选择HCV基因分型方法、基因型诊断和制定抗病毒治疗策略及HCV分子流行病学研究提供可靠依据。研究方法收集2012-2013年在广州市第八人民医院就诊的191例临床丙型肝炎患者，其血清标本已采用国产探针杂交法进行了HCV基因分型。以国际HCV基因库中HCV全基因序列代表株的分型结果为“金标准”，设计C区和NS5B区基因序列扩增引物，分别扩增HCV C区和NS5B区基因，基因产物的测序结果与“金标准”共建系统进化树进行基因分型，分型结果与患者的探针杂交法分型结果进行对比。研究结果1.从国际HCV基因库中共获得92个代表株，涵盖7个基因型、54个基因亚型和5个重组基因型。分别构建代表株的全基因、C区和NS5B区的系统进化树，结果显示，92个代表株的全基因序列分型结果与其C区和NS5B区基因分型结果一致。2.用HCV C区和NS5B区扩增引物分别检测191例临床丙型肝炎患者的HCV基因，结果显示两区均扩增成功的有171例，其中167例C区和NS5B区HCV基因分型结果一致。3.167例基因测序分型结果与患者的探针杂交法分型结果对比显示，总符合率为84.43%（141/167）。探针杂交法误检的26例中，23例6a型误检为1型；2例1b和1例1a型被误检为非1型。171例患者中另外4例（2.34%）的C区与NS5B区HCV分型结果不一致，其中3例C区分型为6a而NS5B区分型为1b，另外1例C区分型为1b而NS5B分型为6a，4例患者的探针杂交结果显示，2例与C区结果一致；另外2例与NS5B区结果一致。结论1.目前临床上常规使用的国产商业试剂（探针杂交法）误检率高，且易在1型和6型间出现误检。2.建立了更精确的基因分型法：C区和NS5B区基因同时测序可使分型结果更加准确，两区分型结果一致时可以取代HCV全基因测序分型，两区分型结果不一致时，提示可能存在混合株或重组株感染，需做进一步分析。第二部分广州地区丙型肝炎患者的HCV分子流行病学研究研究内容及目的研究广州地区丙型肝炎患者HCV基因型特点及其与患者年龄、性别、传播途径及HCV病毒载量的相关性，以便了解本地区丙肝临床HCV分子流行病学变化趋势及对临床预后的影响。研究方法收集2012-2013年在广州市第八人民医院就诊的207例HCV RAN阳性的丙型肝炎患者血清，分别提取病毒RNA，反转录生成cDNA。对其HCV C区和NS5B区基因序列进行RT-NPCR扩增，两区扩增成功的PCR产物进行基因测序，测序结果分别与相应的参照株序列比对，构建系统进化树，两区基因分型结果一致者确定HCV基因亚型，分析广州地区HCV基因型特点及传播途径。并采用SPSS13.0统计软件分析性别、年龄、HCV病毒载量与基因型的相关性。研究结果1.179例结果纳入分析207例标本分别进行HCV C区及NS5B区巢式PCR扩增，产物分别为401bp，375bp，目的条带清晰且单一，无非特异性杂带。有185例HCV C区和NS5B区都扩增成功，其中179例两区基因分型结果一致。2. HCV基因型特点1)179例HCV基因特点共检出1型、2型、3型、6型四种基因型和八种基因亚型，以1b和6a为主。各亚型所占比例为：1b型40.78﹪（73/179），6a型27.37﹪（49/179），3b型11.73﹪（21/179），3a型8.94﹪（16/179），2a型6.15﹪（11/179），1a型3.91﹪（7/179），2b型0.56﹪（1/179），6n型0.56﹪（1/179）。未发现新的6型变异株。2)1b和6a型系统进化树特点1b株主要分为在A、B、C三簇，A簇与中国广泛流行1b株同源性高、B簇与中国中部及南部地区流行1b株同源性高；6a型株分为Ⅰ、Ⅱ两大簇，与广东地区献血人群及静脉吸毒人群中HCV6a型感染株同源性高。3.流行病学特点：1)传播途径患者主要通过静脉吸毒、输血和血制品感染HCV。静脉吸毒感染者中主要以6a型为主，占57.45%（27/47），其次为3a型，占21.28%（10/47）；通过输血和血制品感染者中主要以1b型为主，占78.95%（30/38）。2)性别6组基因亚型间患者的性别比例有明显统计学差异（P=0.002）。3)年龄6组基因亚型间患者年龄分布有统计学差异（P=0.007），2a型患者平均年龄最大（53.45±11.02岁），与其他组相比，均有统计学差异（均为P<0.05），而其他组两两比较均无统计学差异。4)病毒载量6组基因亚型间患者的病毒载量有统计学差异（P=0.000），1b型患者病毒载量平均水平最高（6.51±0.90log10IU/ml），与其他组相比，均有统计学差异（均为P<0.05），而其他组两两比较均无统计学差异。5)合并HIV感染患者特点179例患者中，有30例患者合并HIV感染，其中以6a型患者最多，达51.51%（17/33）。采用独立样本的t检验，比较单纯HCV与合并HIV感染者的HCV载量均值，结果显示，两组间无统计学差异（P=0.691）。结论：1.广州地区丙型肝炎患者HCV基因型存在多种亚型；以1b、6a、3型为主，1b型株包含中国大部分地区的1b型株，6a、3型已取代2a型分别成为第二、三主要流行基因型；未发现其他文献报道的或未曾发现的6型变异株。2.丙型肝炎患者性别比例、年龄、病毒载量在基因亚型上均有统计学差异，其中2a型平均年龄水平最高。1b型病毒载量最高，这与1b型比其他基因型有更强的致病性等报道是相符的。输血及血制品传播中以lb型为主，静脉吸毒传播中以6a型为主。3. HCV/HIV共感染者以6a型占主要，其病毒载量与单纯HCV感染者相比无统计学差异。
张智辉[7]（2014）在《云南省静脉注射吸毒人群中HCV感染的分子流行病学研究》文中研究说明丙型肝炎（Hepatitis C）是威胁人类身体健康的重要传染病,其病原体是丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）,全球范围内大约有1.7亿人感染了HCV,我国的感染率约为3.2%。HCV感染容易慢性化,慢性丙型肝炎约有20%-30%会在20年内缓慢进展为肝硬化和肝癌,HCV感染成为导致肝癌及终末期肝病的重要原因。HCV的依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）缺乏校对功能,使得RNA在复制过程中错配率极高,最终导致了HCV基因组中核苷酸突变频率极高,为基因分型提供了基础。HCV可分为6个主要基因型,每个基因型又可分为若干亚型,HCV基因型的不同直接影响HCV的致病力和患者对药物治疗的反应性。在静脉注射吸毒人群中HCV的感染比例极高（15.6%-98.7%）,云南省地处中国西南边陲,与缅甸、老挝、越南三国接壤,紧邻世界最大的鸦片种植地“金三角”,是毒品运输入中国内地的重要节点,具有大量的吸毒人员。相关调查显示云南省静脉注射吸毒人群HCV的感染率接近80%。本研究从昆明市疾病预防控制中心获得了100份2012年1月至5月期间收集于云南不同地区吸毒人员的HCV阳性血清样本,通过RT-PCR扩增得到HCV C/E1区段,经过T-A克隆和测序,确定了云南省共分布8个亚型的HCV（la,1b、3a、3b、6a、6n、6u、6v）。主要流行的基因型为6型（47%）,其次为3型（41%）及1型（12%）。在亚型分布中,6n亚型（30%）及3b亚型（29%）为主要流行的亚型,占到样品总数的59%。本研究通过对比云南省与其他地区静脉注射吸毒人群HCV基因型分布情况后发现,云南省HCV基因型分布情况与中国南部的情况相似,而与中国东部地区有明显区别。通过对比本次研究的结果与早前云南省相关研究的结果,发现在五年时间内云南省静脉注射吸毒人群中6型HCV比例由25%上升为47%,其中6a亚型由5%上升为15%,6n亚型由11.2%上升为30%,而3a亚型及1b亚型的频率下降接近50%。本研究的结果进一步佐证了HCV的基因型及基因亚型受到贩毒路线的影响这一推论,并发现云南省静脉注射吸毒人群中HCV基因型及基因亚型相较之前有了明显的变化,6a及6n亚型可能由缅甸和越南通过贩毒路线传入云南。
赵琦,时丽丽,邱茂锋[8]（2014）在《丙型肝炎病毒感染分子溯源技术研究进展》文中研究指明丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染主要经血液和母婴垂直传播,还可能经性传播。依据美国疾病预防控制中心的有关指南,对HCV职业暴露感染的鉴定依赖于文件记录和定期的随访检测结果[1]。对于没有完整记录和随访检测结果的职业暴露感染、医源性感染等,比如近年来多次在我国发现的聚集性丙肝疫情,单纯依靠传统流行
李威[9]（2013）在《中国南方HCV基因型的分布和抗病毒疗效影响因素的相关研究》文中研究指明研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）引起的急、慢性肝病表现为很宽的临床谱,从症状轻到肝功能衰竭,慢性丙型肝炎患者有20%-30%在10-30年后进展为肝硬化,甚至肝癌。目前全球约有1.8亿人口感染HCV。HCV的流行率高,慢性率高,抗HCV筛查不能可靠的避免其经输血途径传播,又无疫苗预防及特异性的抗病毒药物,迄今HCV感染仍是全球严重的公共卫生问题之一。HCV是单股正链RNA病毒,由于复制所依赖的多聚酶缺乏校对功能,HCV基因序列易发生突变,从而呈现一定的异质性。HCV基因型和亚型的区分是根据基因组核苷酸序列的差异程度,前者的序列差异度为30-35%,后者为20-25%。目前,HCV可分为6种基因型和80多种基因亚型。HCV基因型的分布具有明显的地域和人种分布特征。但HCV基因型的分布并非一成不变的,随着HCV传播方式的改变以及全球人口的迁移和流动以及,各地区的HCV基因型分布也在发生变化。有研究表明在一些国家如法国、意大利、波兰、德国等国家HCV基因型分布正在发生变化。随着我国经济的迅猛发展,国内外及国内不同地区之间在各个领域的交流增多,人口流动性增强,这为HCV在人群中快速传播流行提供了环境。在我国1993年对献血者实施HCV抗体筛查之后,丙肝的传播途径也由原来以输血传播为主到以输血、吸毒、纹身、性传播等多种途径并存的现象。HCV的传播方式的改变以及人口的大规模流动,使我国HCV基因型的分布也在发生改变。我国主要HCV基因亚型为1b亚型,其次为2a亚型,北方地区2a亚型患者比例比南方地区高。华南地区1997-2002年间研究报道的HCV 1b亚型的流行率是90%左右,2a亚型是8%左右,未见6a亚型报道。2005年Lu等调查发现,华南地区珠三角三城市66例样本中1b亚型的比例为66.7%,6a亚型所占比例21.2%,已超过2a亚型的比例（7.6%）成为仅次于1b亚型的第二大基因型。但是因为研究样本量较少,结论需要进一步证实。影响慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的病毒因素包括HCV基因型、病毒Core和NS5A区突变、治疗前病毒载量等因素。现已公认,HCV基因型与临床抗病毒治疗疗效及疗程有关联。2004年我国发布的《丙型肝炎防治指南》和2009年美国肝病研究协会（AASLD）的《丙型肝炎的临床实践指南》（更新版）中均明确指出：1型的持续病毒学应答比2、3型低；推荐1型的治疗疗程为48周,而非1型（2/3型）的疗程为24周,1型和非1型患者的利巴韦林的剂量也不同。由此可见,HCV基因型对指导慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗具有重要的临床意义。由于HCV 6型分布地区较为局限,关于该基因型的抗病毒治疗结局和影响因素报道不多。鉴于我国华南地区HCV 6a亚型的快速流行趋势,加快对6a亚型慢性丙型肝炎的临床特征、抗病毒治疗疗效、预测因素以及与lb亚型的差异等研究,具有重要的临床意义。慢性丙型肝炎标准治疗方案（SOC）是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗,从全球来看患者病毒学应答率在50%左右。SOC方案治疗有很多副作用和禁忌症,且花费昂贵,致使部分患者无法完成全程治疗或无法接受该治疗方案。因此,积极探索能够预测抗病毒治疗疗效的因素对患者避免治疗带来的高风险、将药物的毒副作用降低到最低以及合理的进行个体化治疗,具有重要的临床实践意义。2009年以来,全球多项研究发现人基因组编码干扰素的基因IL28B附近rs12979860和rs8099917位点单核苷酸多态性与聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗应答有关,这一发现标志着在HCV研究领域对宿主作用的认识进入新的阶段。同时探索寻求快速、简单、可靠的IL28B多态性检测方法,也成为近年与该领域相关的研究热点之一。长期以来,HCV体外细胞培养模型研究进展缓慢。直到2005年日本学者Wakita等成功地建立了HCV 2a （JFHl）型全基因组细胞培养系统,该细胞培养体系的全长JFH1 RNA能够有效复制并分泌感染性病毒颗粒。它的构建在HCV细胞培养模型发展史上具有里程碑式的意义。由于不同HCV基因型的生物学特点及对抗病毒治疗应答存在差异,2a亚型细胞培养模型并不能满足HCV相关研究需要,随后许多学者积极探索构建其他基因型的全基因组细胞培养系统,但收获不多。近年,在JFH1细胞培养模型的基础上来进行改造,构建其他基因型与JFH1嵌合病毒细胞培养系统取得了一些进展。目前已报道的嵌合病毒细胞培养体系包括1a、1b、2a、3a、4a、2b、5a、6a、7a等,而HCV 6a犁全基因组细胞培养系统未见报道。鉴于目前HCV 6a亚型在我国华南地区快速增长和流行,并有向全国传播趋势。加快对我国6a亚型的生物学特点、疫苗研发、抗病毒药物的评价和筛选等已成为我国丙型肝炎防治研究的迫切需要。因此,有必要尽快建立我国6a亚型流行毒株细胞培养系统。研究目的基于前期我们研究团队对HCV基因型的初步研究结果,本研究旨在通过扩大样本以调查我国华南地区慢性丙型肝炎的HCV基因亚型分布情况与特征,分析该地区HCV基因亚型流行和变迁,探讨HCV基因亚型流行模式转变的原因和6a亚型病毒株的进化来源。对比分析我国华南地区HCV 1b和6a亚型慢性丙型肝炎的临床特征,比较两组患者的抗病毒治疗结局差异,探讨影响病毒学应答的因素。建立一种与慢性丙型肝炎抗病毒治疗应答相关的IL28B rs8099917基因多态性检测方法,并应用该方法检测rs8099917基因型,分析该位点基因型与治疗结局的关系。利用JFH1（2a）可高效细胞培养的特性,以JFH1序列为骨架,构建HCV 6a/JFH1重组病毒,为下一步构建6a亚型全基因细胞培养系统奠定实验基础,以期为我国HCV 6a病毒株的生物学特点、相关免疫学特征、疫苗研制、抗病毒药物的评价和筛选等提供实验技术平台。研究方法1.慢性丙型肝炎的病毒基因型和亚型的分布：通过比对分析我国HCV主要流行基因亚型的序列,改进HCV基因分型引物,选择C/E1和NS5B区PCR扩增测序分型。回顾性收集患者年龄、性别、病毒载量、感染时间及传播途径等资料,多因素分析HCV基因型/亚型与这些因素的关系。2.影响慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的病毒与宿主因素研究：建立华南地区1b亚型和6a亚型慢性丙型肝炎临床对照研究,所有患者应用聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗48周,并随访至少24周。收集患者抗病毒治疗前临床基线资料：性别、年龄、HCV RNA定量、ALT、AST、TBIL、ALB、TG、CHOL、 GLU、WBC、NEU、RBC、PLT、HGB等资料,记录抗病毒治疗期间4、12、48周以及治疗结束随访24周时HCV RNA定量。比较分析两组患者的临床一般特征以及抗病毒治疗应答差异,分析影响病毒学应答的因素。3.与抗病毒疗效相关的IL28B多态性检测方法的建立与应用：根据四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应方法（T-ARMS-PCR）的原理,设计两对引物,特异性扩增鉴定IL28B rs8099917基因型,并通过直接测序和设置阳性参照评价T-ARMS-PCR方法的特异性。应用该方法对我国慢性丙型肝炎患者IL28B rs8099917基因型进行检测,对IL28B另一位点rs12979860直接测序法鉴定基因型,分析两位点基因多态性与抗病毒治疗疗效的关系。4.我国华南地区6a/JFH1重组病毒的构建：应用重叠延伸PCR方法分别扩增华南地区HCV 6a亚型Core-NS2基因和JFH1两基因片段,进行基因融合连接,酶切连接构建6a/JFH1重组病毒质粒。5.统计学方法：计数资料采用卡方检验；计量资料两组之间比较t检验或非参数Mann-Whitney U检验,计量资料三组之间比较采用方差分析；HCV基因型与相关因素的关系采用多分类Logistic回归分析；探讨慢性丙型肝炎患者获得SVR的预测因子应用二分类Logistic回归分析。P值小于0.05时有显着性差异,所有统计学分析使用SPSS13.0。结果1.388例慢性丙型肝炎患者中,检测出HCV基因型有8种：1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a和6d,各种基因亚型的例数分别为5例（1.3%）、230例（59.3%）、31例（8.0%）、1例（0.3%）、30例（5.2%）、16例（4.1%）、84例（21.6%）和1例（0.3%）。2.不同HCV基因型患者的平均年龄有显着性差异（p<0.001）。与6a亚型患者相比,感染1b和2/3型患者的平均年龄大（34.9±8.6岁vs.42.7±15.3岁和40.2±10.7岁）。在大于25岁以上年龄组中,1b亚型的比例随年龄增大有增多趋势,而6a亚型的比例有随年龄增大有减少趋势。3.不同HCV基因型患者的性别分布有显着性差异（p=0.011）。感染2/3型和6a亚型的男性患者比例明显高于女性（67.6%vs.32.4%和76.2%vs.23.8%）。4.不同HCV基因型患者的传播途径有明显差异（p<0.001）。通过输血或血制品感染HCV的患者中1b亚型的比例是80.5%,经静脉吸毒感染HCV患者中6a亚型的比例是63.3%。117例有明确输血或血制品时间的lb亚型患者中,1995年之前感染HCV的患者比例高达84.6%（99/117）,而在1995年之后,通过此途径感染的患者比例显着下降并维持一定水平。5.多因素Logistic回归表明,HCV基因型与传播途径独立相关。1b亚型与输血或血制品途径相关（P<0.001）,而6a亚型与经静脉吸毒途径相关（P<0.001）。6.进化树分析显示,我国华南地区慢性丙型肝炎的6a亚型病毒株与香港6a亚型病毒株有高度的相似性,二者在进化距离上与越南6a亚型病毒株更接近。7.本研究共纳入47例lb亚型和41例6a亚型慢性丙型肝炎患者,两组患者在抗病毒治疗前的性别分布、平均年龄,以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清白蛋白、总胆红素、甘油三酯、胆固醇、血糖、白细胞、中性粒细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、HCV RNA定量等水平差异无统计学意义（P值均大于0.05）。8.88例慢性丙型肝炎患者,总体SVR率为71.6%（63/88）。与lb亚型患者相比,6a亚型患者有较高的RVR和SVR（92.7%vs.66%,P=0.002和85.4%vs.59.6%,P=0.007）；但两组患者的EVR和ETVR无显着性差异（95.1%vs.87.2%,P=0.362和95.1%vs.91.5%,P=0.802）。9.多变量Logistic回归分析影响SVR的因素表明,在抗病毒治疗前,HCV基因型（0R=3.59,P=0.036）和患者年龄（0R=0.92,P=0.001）独立与SVR相关；而治疗开始后,患者年龄（0R=0.88,P=0.001）和RVR（OR=17.24, P=0.012）与SVR独立相关。10.本研究建立了IL28B rs8099917基因分型方法即T-ARMS-PCR法,应用该方法对56例HCV 1b亚型慢性丙型肝炎患者的rs8099917基因分型结果与直接测序较为一致,特异性为（98.2%）。T-ARMS-PCR法是一种快速、简单、有效的rs8099917基因分型方法。11.56例1b亚型慢性丙型肝炎患者中,rs8099917位点的TT基因型的比例为80.4%（45/56）,TG基因型的比例为19.6%（11/56）,未检测到GG基因型。携带TT基因型患者获得病毒学应答率显着高于携带TG基因型患者（68.9%vs.27.3%,p=0.029）。测序结果表明,rs12979860与rs8099917位点基因型有高度的关联性。12.本研究构建了6a/JFH1重组病毒质粒,转染Huh7.5.1细胞后,复制效力较低,需进一步改造,筛选适应性突变病毒株。结论1.华南地区慢性丙型肝炎患者中存在8种不同HCV基因亚型：1a、1b、2a、 2b、3a、3b、6a和6d。该地区主要流行的HCV基因型是1b亚型,其次为6a亚型。华南地区HCV基因型的流行模式呈现新特点：与输血或血制品途径相关的lb亚型患者比例有减少趋势,而与静脉吸毒途径相关的6a亚型患者比例有增多趋势。2.1b和6a亚型两组慢性丙型肝炎患者治疗前临床基线特征相似,但两组患者的抗病毒治疗结局不同：与1b亚型相比较,6a亚型患者能够获得有较高的SVR率。在抗病毒治疗前,HCV基因型是预测SVR的主要因素；而抗病毒治疗开始后,RVR是预测SVR的主要因素。3.四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应方法（T-ARMS-PCR）是一种快速、简单、有效的IL28B rs8099917基因分型方法。携带rs8099917 TT基因型患者比TG基因型患者有较高病毒性应答率。我国慢性丙型肝炎患者人群中rs8099917与rs12979860位点高度关联。4.本研究成功构建了6a/JFH1重组病毒质粒,为构建6a亚型全基因组细胞培养体系奠定了实验基础。
陶钧[10]（2012）在《中国丙型肝炎高危人群的基因亚型研究》文中研究说明背景在全球范围内的HCV感染率约为2%,我国的感染率为0.43%。HCV慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,2%～4%的患者可发展为肝硬化和原发性肝细胞癌,这严重危害了患者的健康,已成为人们日益关注的社会和公共卫生问题。有研究表明,聚乙二醇化干扰素和利巴韦林联合治疗后,出现SVR的患者发生肝硬化和原发性肝细胞癌的时间推后,发生机率减少。但HCV的6个基因型对聚乙二醇化干扰素和利巴韦林联合治疗的敏感性和愈后均不同。因此,HCV基因型可以为选择个体最优的治疗方案和预测愈后提供依据。我国HCV高发人群主要为吸毒人群,感染率相对较低的人群包括：输血人群、肾透析人群、性病门诊人群和女性性工作者及其它哨点监测高危人群。了解HCV高危人群的HCV基因型分布信息可以为公共卫生投入和干预措施实施提供依据。目的获得中国部分地区吸毒人群和国家级哨点监测人群HCV感染者及医院就诊HCV患者的基因亚型信息；研究影响HCV基因型别分布的因素；分析静脉注射吸毒的危险因素；探讨抗体阳性结果与核酸阳性结果之间的关系；讨论HCV基线病毒载量值与感染HCV基因亚型的关系。方法1.根据中国区HCV的主要流行基因亚型,使用Premier5.0设计适合中国区HCV分子流行病学调查的通用型引物；2.使用国产酶联免疫试剂初筛,并采用进口酶联免疫试剂对S/CO比值大于0.8的样本进行复检,筛选得到HCV抗体阳性样本；3.利用MagNA Pure LC核酸自动提取仪提取HCV核酸后,进行NAT检测；4.NAT检测阳性样本经巢式RT-PCR扩增NS5B测序区段,阳性扩增产物送公司测序；5.采用Chromas Pro1.5、BioEdit和Mega4.0软件对基因序列进行清理、拼接、比对和系统进化分析；6.比较设计引物与HCV Database和《丙肝检测技术规范》推荐引物扩增已知基因亚型的样本核酸提取物的成功率；7.比较In-House方法和Abbott Real Time HCV Genotype Ⅱ检测HCV基因型的一致性；8.统计分析使用SAS9.1软件,采用的统计学方法包括：成组t检验,χ2检验,logistic回归和方差分析。结果1.1664份HCV抗体阳性样本来自吸毒人群和国家级哨点监测人群HCV感染者及医院就诊HCV患者。其中,1416份NAT检测阳性,1302份成功获取基因亚型信息（91.9%）。吸毒人群HCV感染者的主要基因亚型为：3a,3b和6a；国家级哨点检测人群HCV感染者和医院就诊HCV患者的主要基因亚型均为：1b和2a；2.HCV基因亚型分布在性别、年龄、地区和人群间分布差异存在统计学意义,不同地区及人群间影响HCV基因亚型分布因素不一致；3.男性、低年龄和已婚是静脉注射吸毒的危险因素；4.HCV基线病毒载量值在感染不同HCV基因亚型间分布差异无统计学意义；5.自行设计引物可以有效扩增中国区流行的7个基因亚型（1a,1b,2a,3a,3b,6a,6n）, HCV Database推荐引物可以有效扩增1、2和3型；《丙肝检测技术规范》推荐引物可以有效扩增1和2型；6.18份样本（包括：1型,2型,3型和6型）使用In-House方法和Abbott Real Time HCV Genotype Ⅱ检测的基因型一致。1份In-house检测基因亚型为1a和3份6n亚型样本,雅培检测方法分别报告为1a/2混合感染和不确定；7. ELISA HCV抗体检测S/CO比值在HCV核酸阴性和阳性样本中分布差异不具有统计学差异。结论1.吸毒人群HCV感染者基因亚型以3型和6型为主,河北哨点监测人群HCV感染者和佑安医院就诊HCV患者基因亚型以1型和2型为主；2.性别、年龄、地区、人群和吸毒方式影响HCV基因亚型分布,不同地区及人群间影响HCV基因亚型分布因素不一致；3.男性、低年龄和已婚是静脉注射吸毒的危险因素；4.HCV基线病毒载量值在不同基因亚型感染者间分布无差异；5.自行设计引物能够有效扩增中国HCV流行的主要7个基因亚型（1a,1b,2a,3a,3b,6a,6n）;6. Abbott Real time HCV Genotype与In-house方法检测HCV基因型的一致性较好；7.酶联免疫S/CO比值不能预测NAT检测结果。
二、丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析（论文提纲范文）
（1）野生鼠血清标本中持续性G病毒感染的分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 pegivirus病毒概述 |
| 2 荧光素酶免疫共沉淀检测系统简介 |
| 3 分子演化及贝叶斯系统发育分析 |
| 第二章 广州和厦门城区野生鼠携带持续性G病毒流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 鼠血清pegivirus抗体检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 pegivirus病毒进化起源研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语词汇表 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
（2）丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 HCV流行病学 |
| 1.2 HCV基因组分子生物学特征 |
| 1.3 HCV研究模型 |
| 1.3.1 细胞培养模型 |
| 1.3.2 动物模型 |
| 1.4 HCV生命周期 |
| 1.5 HCV预防和治疗手段 |
| 1.5.1 HCV的 DAA治疗 |
| 1.5.2 HCV的抗体治疗和预防 |
| 1.6 HCV广谱中和抗体诱导对疫苗设计的启示 |
| 1.6.1 E1/E2 包膜糖蛋白诱导产生广谱中和抗体 |
| 1.6.2 HCV胚系抗体对疫苗设计的启示 |
| 1.7 8D6 筛选过程及表位分析、功能鉴定 |
| 1.8 课题设计思路 |
| 1.9 总结与展望 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 HCVcc病毒 |
| 2.1.3 抗体及蛋白 |
| 2.1.4 病人血清样本 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCVpp中和实验 |
| 2.2.2 HCV E2 分选探针制备 |
| 2.2.3 抗体表达 |
| 2.2.4 Protein-G亲和层析纯化抗体 |
| 2.2.5 胚系抗体设计及改造 |
| 2.2.6 OCTET RED96 仪器检测抗原抗体亲和力 |
| 2.2.7 8D6 Fab制备 |
| 2.2.8 小角度X射线散射(SAXS) |
| 2.2.9 Docking |
| 2.2.10 HCVcc制备 |
| 2.2.11 HCV RNA电转 |
| 2.2.12 HCV耐药株构建 |
| 2.2.13 微中和实验 |
| 2.2.14 免疫荧光 |
| 2.2.15 HCV E2 截短突变体及丙氨酸扫描突变体构建 |
| 2.2.16 Lipo3000 脂质体DNA转染 |
| 2.2.17 酶联免疫吸附实验 |
| 2.2.18 8D6 表位保守性序列分析 |
| 2.2.19 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 HCV广谱中和抗体8D6 的分离和初步评价 |
| 3.2 8D6 与纯化的重组Con1(1b亚型)E2 蛋白具有高亲和力 |
| 3.3 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱结合活性 |
| 3.4 8D6 对不同基因型HCVcc病毒具有广谱结合活性 |
| 3.5 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱中和活性 |
| 3.6 8D6 可以中和DAA药物耐药毒株 |
| 3.7 8D6 通过阻断E2与CD81 的结合来阻断病毒入侵 |
| 3.8 8D6 是构象表位抗体并且识别保守的E2 表位 |
| 3.9 8D6 识别E2 的具体表位探究 |
| 3.10 E2 N448 去糖基化对8D6 识别的影响 |
| 3.11 8D6 Fab-E2 小角散射(SAXS)模型 |
| 3.12 重组E2(1b/Con1)与8D6 Fab复合物模型 |
| 3.13 8D6 通过体细胞超频突变获得广谱中和活性 |
| 3.14 8D6在CDRH3 上存在一个对抗体广谱活性获得重要的CX_4C基序 |
| 3.15 通过8D6 胚系抗体筛选疫苗合适的HCV免疫原 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表(中英文对照) |
| 附录二 抗体序列 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（3）云南红河州高危人群HIV及其共感染的HCV/HPgV-2病毒的分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 摘要 Abstract 前言 第一部分 云南省红河州高危人群HIV感染的分子流行病学研究 |
| 1 背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 研究方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 研究对象及其基本情况 |
| 3.2 HIV-1 pol区扩增测序基本情况 |
| 3.3 HIV-1 基因亚型及其在不同人群和时间的分布 |
| 3.4 基于全长基因组的2株新型重组毒株和4株G亚型病毒的鉴定 |
| 3.5 新型重组毒株(URFs)的鉴定及人群特征 |
| 3.6 HIV-1 传播簇分析 |
| 3.7 与云南其他地区毒株流行的关系 |
| 3.8 主要HIV-1 毒株的流行动力学分析 |
| 3.9 耐药毒株流行情况 |
| 4 讨论 第二部分 云南省红河州高危人群与HIV共感染的HCV分子流行病学研究 |
| 1 背景 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 研究方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCV共感染的情况 |
| 3.2 HCV CE2/NS5B区扩增测序结果 |
| 3.3 HCV的基因亚型及其构成 |
| 3.4 HCV的成簇分析 |
| 3.5 不同时间段的成簇分析 |
| 3.6 HIV与 HCV的共传播 |
| 3.7 HCV的流行动力学析 |
| 4 讨论 第三部分 云南省红河州高危人群与HIV共感染的HPg V-2 分子流行病学研究 |
| 1 背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 研究方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HPgV-2抗体与核酸检测结果 |
| 3.2 HPgV-2阳性人员的流行病学特征 |
| 3.3 HPgV-2与HCV的共感染情况 |
| 3.4 HPgV-2抗体阳性者中HPgV-2 RNA阳性的比例 |
| 3.5 单独HPgV-2 RNA阳性率 |
| 3.6 HPgV-2的基因变异和遗传特征 |
| 3.7 HPgV-2的致病特征分析 |
| 3.8 HPgV-2的成簇分析 |
| 4 讨论 参考文献 作者在学期间取得的学术成果 主要简历 致谢 |
（4）海南省HCV分子分型、分子进化及黎族HCV基因型6特殊病毒株的全基因组研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 第一章 |
| 海南省HCV流行现状 1 |
| 引言 2 |
| 材料与方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 第二章 |
| 海南黎族HCV基因型6特殊病毒株的全基因组研究 1 |
| 引言 2 |
| 材料与方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 全文总结 参考文献 主要英文缩略对照表 附录 致谢 攻读博士期间成果 |
（5）高通量测序技术用于丙型肝炎病毒感染溯源调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 2 主要仪器设备、试剂及耗材 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 已发表论文 |
| 附录2 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）广州地区丙型肝炎患者的HCV基因型相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 临床切实可行的两种基因分型法（部分基因测序法与探针杂交法）的准确性比较 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部份 广州地区丙型肝炎患者的 HCV 分子流行病研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间参与撰写的文章 |
| 致谢 |
（7）云南省静脉注射吸毒人群中HCV感染的分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 1. 引言 |
| 1.1 HCV的基因组结构及编码产物 |
| 1.1.1 HCV的基因组结构 |
| 1.1.2 病毒蛋白的结构与功能 |
| 1.2 HCV的传播途径 |
| 1.2.1 血液传播 |
| 1.2.2 性传播 |
| 1.2.3 垂直传播 |
| 1.3 HCV基因分型 |
| 1.3.1 HCV的基因分型系统 |
| 1.3.2 全球HCV的流行与进化 |
| 1.3.3 我国静脉注射吸毒人群中HCV的流行与进化 |
| 1.3.4 HCV基因分型的意义 |
| 1.3.5 HCV基因分型的方法 2. 研究目的及意义 3. 材料和方法 |
| 3.1 血清样品 |
| 3.2 主要试剂及材料 |
| 3.3 主要仪器设备 |
| 3.4 软件 |
| 3.5 引物设计及主要参考序列 4. 实验方法 |
| 4.1 病毒基因组RNA的提取 |
| 4.2 逆转录反应获取HCV cDNA |
| 4.3 分型区段的选择及PCR反应条件摸索 |
| 4.4 PCR扩增HCV C/E1区的部分序列 |
| 4.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.6 PCR产物的纯化 |
| 4.7 受体菌DH5a的感受态制备 |
| 4.8 纯化产物于PMD19-T载体的连接 |
| 4.9 转化感受态细胞DH5a |
| 4.10 阳性重组质粒的提取及鉴定 |
| 4.11 数据分析 5. 实验结果 |
| 5.1 HCV分型扩增区段地选择及PCR条件优化 |
| 5.2 阳性样本中HCV RNA的PCR检测 |
| 5.3 HCV C/E1区段的PCR扩增 |
| 5.4 PCR产物胶回收、测序用重组载体PMD19-T的构建与鉴定 |
| 5.5 HCV阳性样本中HCVC/E1区段测序结果 |
| 5.6 云南省静脉吸毒人群中HCV的基因型分布 |
| 5.7 云南省静脉吸毒人群HCV感染亚型的性别及年龄分布 |
| 5.8 云南省静脉吸毒人群中HCV的基因型分布状况与其他地区分布状况的对比 |
| 5.9 云南省静脉吸毒人群中现有HCV的基因型分布状况与早期研究的对比 6. 讨论 7. 小结 参考文献 附录一 HCV阳性样品测序序列 附录二 主要缩略词表 附录三 主要溶液配制方法 致谢 研究生简历 攻读硕士期间发表论文的情况 |
（9）中国南方HCV基因型的分布和抗病毒疗效影响因素的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 慢性丙型肝炎病毒基因型和亚型的分布 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 影响慢性丙型肝炎抗病毒疗效的病毒与宿主因素研究 |
| 一、1b和6a亚型慢性丙型肝炎抗病毒疗效及影响因素 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 二、与抗病毒疗效相关的IL28B多态性检测方法的建立与应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 我国南方HCV 6a亚型重组病毒的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文缩写注释 |
| 攻读博士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（10）中国丙型肝炎高危人群的基因亚型研究（论文提纲范文）
| 缩写词表 中文摘要 ABSTRACT 前言 材料和方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 核酸提取 |
| 2.4 5’-UTR 区段扩增 |
| 2.5 NS5B区段扩增 |
| 2.6 凝胶电泳及基因测序 |
| 2.7 基因序列分析方法 |
| 3 比对实验 |
| 3.1 引物比对实验 |
| 3.2 Abbott Real Time HCV genotype Ⅱ和In-house HCV基因分型方法对比实验 |
| 4 统计学处理 研究结果 |
| 1 HCV基因分型汇总分析 |
| 1.1 贵州、陕西、江苏二省吸毒人群HCV感染者基因分型结果 |
| 1.2 佑安医院HCV患者基因分型结果 |
| 1.3 河北国家级哨点高危人群HCV感染者基因亚型分析 |
| 2 比对实验结果 |
| 2.1 引物比对实验结果 |
| 2.2 In-house 方法与 Abbott Real Time HCV genotype II 检测 HCV 基因亚型一致性 讨论 结论 参考文献 附录 |
| 附件1 HCV基因分型作业指导书 |
| 附件2 发表综述 |
| 附件3 已发表Meta分析文章 |
| 附件4 已发表着作 致谢 |
四、丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析（论文参考文献）
- [1]野生鼠血清标本中持续性G病毒感染的分子流行病学研究[D]. 高又文. 南方医科大学, 2020(01)
- [2]丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究[D]. 夏静. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [3]云南红河州高危人群HIV及其共感染的HCV/HPgV-2病毒的分子流行病学研究[D]. 李天一. 军事科学院, 2019(09)
- [4]海南省HCV分子分型、分子进化及黎族HCV基因型6特殊病毒株的全基因组研究[D]. 吴涛. 南方医科大学, 2017(11)
- [5]高通量测序技术用于丙型肝炎病毒感染溯源调查[D]. 张静娜. 中国疾病预防控制中心, 2016(02)
- [6]广州地区丙型肝炎患者的HCV基因型相关研究[D]. 肖桂娥. 广州医科大学, 2014(03)
- [7]云南省静脉注射吸毒人群中HCV感染的分子流行病学研究[D]. 张智辉. 北京协和医学院, 2014(01)
- [8]丙型肝炎病毒感染分子溯源技术研究进展[J]. 赵琦,时丽丽,邱茂锋. 国际病毒学杂志, 2014(01)
- [9]中国南方HCV基因型的分布和抗病毒疗效影响因素的相关研究[D]. 李威. 南方医科大学, 2013(08)
- [10]中国丙型肝炎高危人群的基因亚型研究[D]. 陶钧. 中国疾病预防控制中心, 2012(04)