一、一步法多重RT—PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究（论文文献综述）
张先东,蒋郁明,费奕强,薛晓阳,侯月娥[1]（2022）在《鸡传染性支气管炎诊断技术研究进展》文中提出鸡传染性支气管炎（avian infectious bronchitis,IB）具有极强的传染性,为我国二类动物疫病。IB的准确诊断对其防控具有极其重要作用。本文综述了病毒分离、血清学诊断、免疫组织化学技术、分子生物学诊断、蛋白芯片技术等主要的IB诊断方法。病毒分离是诊断IB的重要手段,但其耗时长且对操作有一定要求,因此近年来将其与基因测序分析相结合来进行IB诊断及基因型鉴别;在常规血清学方法中,酶联免疫吸附试验（ELISA）和血凝抑制试验（HI）是推荐用于鸡群大规模筛查及免疫效果评价的方法,病毒中和试验（VNT）具有高度特异性,常被应用于毒株的变异鉴定,但是耗时且缺乏标准化,建议选用更成熟的ELISA方法 ;随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应（PCR）因具有更高的准确性,且能实现实时定量分析,已被广泛应用于实验室检测;重组聚合酶等温扩增技术（RPA）特异性好,对试验条件要求不高,适用于养殖场的大规模IB筛查。另外,蛋白芯片技术、免疫层析试纸条、鸡声信号分析装置也为IB诊断提供了全新的思路。
马彩红[2]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及鸡5种病毒多重PCR诊断方法的初步建立》文中研究指明
杨楠,翟少伦,许军海,杨丹芳,娄亚坤[3]（2021）在《禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立》文中认为为了简便、快速、准确的检测禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）H5、H7、H9亚型（lumpy skin disease virus,LSDV）,本研究通过对禽流感病毒HA2基因保守区域的分析,设计、合成特异性引物和探针,结合Taq man-MGB探针技术,建立禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法。该方法敏感性较高,最低检出限为11copies/μL;与禽类常见病毒核酸均无交叉反应;不同稀释度的重组质粒的检测变异系数为0.1%～1.16%。上述结果表明,本研究建立的禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法比传统病毒分离鉴定方法时间更短,具有敏感性强、特异性高的特点,更适用于禽流感病毒H5、H7、H9亚型快速诊断及流行病学调查。
赵成龙[4]（2021）在《禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量研究及应用》文中研究表明禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽急性呼吸系统疾病,可感染多种家禽和野生鸟类。禽流感病毒自发现以来,每年都有疫病流行的报道,目前在全球多个国家和地区呈大范围流行。其中,H5和H7亚型高致病性禽流感每次暴发都会给养禽业造成巨大的经济损失。H5和H7亚型禽流感病毒均有感染人的报道,对人类生命健康构成巨大威胁,严重危害公共卫生安全。因此,建立禽流感病毒高通量的快速检测和鉴定方法,对于开展禽流感疫情的监测预警和保障公共卫生安全具有重要意义。为了更快速准确的检测禽流感病毒,尤其是H5和H7亚型禽流感病毒,本研究在已有的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测方法的基础上,根据生产需求进一步优化,组成完整的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒制品,用制备的质控品对该试剂盒进行质量研究,并将该试剂盒用于大量临床样品检测,评价检测效果。为了对禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒进行质量研究,本研究选择了 14株不同亚型禽流感病毒株、1株新城疫病毒株、1株鸡传染性支气管炎病毒株、1株鸡传染性法氏囊病毒株、1株禽白血病毒株、1株禽网状内皮组织增生症病毒株和2只SPF鸡组织样品作为质控品,进行试剂盒质控品制备与鉴定。首先,对质控品制备工艺进行研究,确定最合适的灭活剂和冻干保护剂组合。结果显示,β-丙内酯与蔗糖脱脂乳作灭活冻干组合效果最佳,冻干品在4℃保存第7 d、30 d、90 d分别检测,结果无明显差异;其次,将所有毒株进行培养、灭活、冻干,并用已公布的特异性荧光检测引物进行鉴定;选择1株H5亚型禽流感病毒株和1株H7亚型禽流感病毒株作为敏感性质控品并进行标定,用对应的引物探针检测结果为阳性,且未出现非特异性扩增,禽流感病毒通用检测引物探针检测敏感性质控品H7-2强阳性Ct值为25.296±0.981,H5亚型禽流感病毒强阳性Ct值为25.439±1.161,H7亚型禽流感病毒强阳性Ct值为27.658±1.020;将其余的毒株作为特异性质控品,用对应的引物探针检测结果为阳性,且未出现非特异性扩增;最后,将2只SPF鸡的血清、匀浆液上清和拭子作为阴性质控品,鉴定结果均为阴性。制备的敏感性质控品、特异性质控品和阴性质控品能满足禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒质量研究的需要。为了检验禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量是否符合标准,做了以下研究:（1）敏感性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒按照试剂盒说明书对敏感性质控品、特异性质控品、阴性质控品、45份H5亚型禽流感病毒阳性临床样品和45份H7亚型禽流感病毒阳性临床样品进行检测,同时用OIE推荐或论文公开发表的检测方法进行平行试验,与标准方法检测结果符合率为100%;将敏感性质控品H5-2 和 H7-2 用 PBS 进行 10 倍梯度稀释,选择 101、102、103、104、105、106、107、108倍稀释度样品提取核酸,用禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测,每个稀释度做20个重复,确定检测结果中阳性检出率刚好大于等于95%时的样品稀释度,该稀释度即为对应亚型的最低检出量,对应的Ct值即为阳性判定标准。结果显示,检测禽流感病毒通用型的引物探针对敏感性质控品H7-2的最低检测限为107倍稀释度,Ct值为37.614±0.250,检测H5亚型禽流感病毒的引物探针对敏感性质控品H5-2的最低检测限为106倍稀释度,Ct值为37.736±0.210,检测H7亚型禽流感病毒的引物探针对敏感性质控品H7-2的最低检测限为107倍稀释度,Ct值为37.833±0.312;（2）特异性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒对敏感性质控品、特异性质控品、阴性质控品和60份阴性临床样品进行检测,3批试剂盒检测均未出现异常扩增曲线;（3）重复性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒检测敏感性质控品,敏感性质控品需进行10倍梯度稀释至最低检出限,每个稀释度做3个重复,批内平均变异系数为1.31%,批间平均变异系数为1.84%,批内批间变异系数均小于3%。结果证明禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒敏感性、特异性和重复性均较好。为了在实际应用的条件下评估禽流感病毒（通用、H5、H7）荧光RT-PCR检测试剂盒的临床适用性,本试验用试剂盒对4个省份活禽交易市场1920份拭子样品进行检测。结果显示,禽流感病毒阳性样品775份,其中61份为H5亚型禽流感病毒,6份为H7亚型禽流感病毒。由此说明,试剂盒可以用于禽流感病毒临床检测,既能检出禽流感病毒,同时可以区分H5和H7亚型高致病性禽流感病毒,能够满足临床检测需求。
陈顺[5]（2021）在《重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价》文中研究指明新城疫（ND）和鸡传染性支气管炎（IB）是世界动物卫生组织规定须通报的动物传染病和我国农业部规定的分别为一类和二类的动物疫病,疫病的流行会造成生产性能的降低和鸡群死亡等严重后果,直接造成巨额的经济损失,已俨然成为制约水禽养殖的重大威胁。然而发展到目前为止,对于这两类疫病最高效经济的防控方式无疑是使用疫苗免疫;传统疫苗的种类主要包括:灭活疫苗和减毒的活疫苗,但是面对像IB这种血清型众多的病毒株,传统疫苗的保护就显得有些力不从心,况且传统疫苗病毒株稳定性差,常出现毒力返强现象,生产成本高、制备工艺复杂、免疫程序繁琐也导致了商品化疫苗的水平参差不齐;诸多问题的叠加放大加快了新型疫苗的研究脚步,基因工程疫苗首当其冲,逐步成为了疫苗研究中的新宠。能够同时表达多个与目标抗原相关及辅助性表位的疫苗被称为鸡尾酒式疫苗,也就是多表位疫苗。作为基因工程疫苗研究领域的翘楚,它能够被多种遗传背景的MHC分子特异性识别结合,诱导高效的递呈反应,增强免疫应答反应,在应对病原微生物的基因突变方面及克服免疫反应中的不良因素中具有得天独厚的优势。此次研究所用本团队已构建完成的重组新城疫病毒表达传染性支气管炎病毒的多表位疫苗rNDV-IBV-T/B株,它是以NDV的La Sota株作为载体,首先将NDV-TS09-C株的耐热性HN基因替换至La Sota株,增强了其热稳定性,然后应用基因工程技术,将IBV-S1蛋白的T、B淋巴细胞功能性表位插入到NDV的F和M基因之间,并通过反向遗传技术将重组病毒进行体外拯救,获得了重组病毒rNDV-IBV-T/B株,重组病毒rNDV-IBV-T/B株能够有效抵抗新城疫病毒以及多种亚型IBV感染。作为转基因微生物,基因安全问题一直以来是基因工程疫苗研究中所面临的重点,为防止对周围环境及人造成不必要的损害,《农业部转基因生物安全管理条例》对转基因生物的生产应用也做出了明确的规定,一般在通过小规模的中间实验、中规模的环境释放实验、大规模的生产性实验三个阶段,经验收合格后方能获得转基因生物安全证书并开展下一阶段的研究,作为基因工程疫苗在生产应用中必须要经历且重要的一环。为此,本研究针对重组病毒rNDV-IBV-T/B株安全性进行评估,为疫苗的生产应用提供了数据支持和保证,同时大力推动了基因工程疫苗的发展进程。本研究对构建保存的重组病毒rNDV-IBV-T/B株目的基因表达及遗传稳定性进行了分析。利用鸡胚传代的方法将重组病毒不断复制扩增,在传代25次后收取鸡胚尿囊液,对重组病毒进行RT-PCR检测并送检测序分析基因突变情况;同时,针对重组病毒外源性插入基因进行特异性检测以及灵敏性分析。结果表明,当重组病毒利用鸡胚传代若干代后无基因突变现象且能够扩增出两条大小为1592bp和977bp的特异性条带,初步说明了重组病毒具有良好的遗传稳定性。当重组病毒的c DNA模板稀释度至10-4时仍能扩增出两条特异性条带,用其他病毒配合特异性引物进行PCR扩增无任何目的条带,重组病毒rNDV-IBV-T/B株能够扩增出两条目的条带,母本La sota株能得到一条目的条带,利用鸡胚还检测出重组病毒具有高水平病毒滴度。这些结果说明重组病毒在多次传代仍具有较强复制能力与毒力水平,插入基因稳定表达且特异。对1日龄的雏鸡进行滴鼻点眼免疫接种,免疫剂量大小为106EID50/0.2m L,在免疫后每日观察鸡群的精神状态及发病死亡情况,免疫后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天进行剖检观察,并取鸡只组织脏器及环境中的饮水、饲料等进行RT-PCR检测。结果发现在整个实验进程中未发生鸡只死亡情况,鸡群采食及精神状态良好,鸡只组织脏器剖检观察均正常,RT-PCR结果显示,在整个免疫观察期内未在免疫鸡体内各脏器中及周围环境饮水、饲料中检测到重组病毒rNDV-IBV-T/B株目的基因;为进一步检测证实PCR结果的可靠性,对重组病毒rNDV-IBV-T/B的安全性进行进一步评估,我们利用间接免疫荧光技术（IFA）,通过细胞水平的检测重新划定重组病毒在机体及环境中的留存情况。在免疫后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天取靶动物鸡的组织器官和周围环境中饮水、饲料等处理后去感染Hela细胞,同时也用重组病毒rNDV-IBV-T/B和NDV强毒Herts33感染Hela细胞作为两个阳性对照。经过检测我们可以发现,在免疫后的56d内,组织脏器及周围环境样品中没有检测到绿色荧光信号,阳性组有明亮的绿色荧光信号标记,即在组织和周围环境中没有检测到重组病毒,说明了重组病毒对靶动物鸡和环境是安全的。综上所述,本实验对表位疫苗株rNDV-IBV-T/B安全性进行了客观性评价,证实了其安全性,为推动疫苗发展进程提供了数据支撑。
盛洁[6]（2021）在《表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价》文中指出鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性上呼吸道传染病,对全球家禽养殖业危害严重,是目前养禽业面临的最重要疫病之一。有必要基于IBV流行病学研究结果,针对目前我国主要流行的毒株类型研制新型疫苗。纤突（Spike,S）蛋白是IBV病毒粒子表面重要的糖蛋白,在病毒入侵以及受体结合等方面发挥重要作用。纤突蛋白在成熟过程中进一步裂解为S1亚基和S2亚基,其中S1亚基含有病毒主要的中和表位,是IBV重要的免疫原基因,往往将其作为IBV型特异性疫苗设计的主要靶点。鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的影响家禽生产的另一大病毒性呼吸道传染病。该病往往呈地方性散发,但近年来国内鸡群频繁暴发ILT,造成较大的经济损失,弱毒疫苗作为防控该病的有效手段,引起养禽业界的重视。ILTV和IBV作为两种重要呼吸道病毒,由于两者对宿主的感染部位和免疫机理相似,研制联合疫苗成为同时防控这两种疫病的迫切需求,ILTV具备作为疫苗载体表达其他病原保护性抗原的潜质。鉴于此,基于ILT弱毒株来构建表达IB重要免疫原基因的重组ILT基因工程载体联合疫苗便成为同时防控IB和ILT两种疫病的最优选择。本研究以ILTV弱毒株CK/CH/LHLJ/120305株为亲本毒株,将其US9基因缺失并插入增强型绿色荧光蛋白表达盒（EGFP）后获得的ILTV突变体ILTV-ΔUS9-G株作为中间病毒,采用基因同源重组技术,将ILTV-ΔUS9-G株病毒的EGFP基因分别替换为IBV GI-19（QX）型强毒株CK/CH/LDL/091022株的S基因和S1基因,获得表达IBV S蛋白的重组病毒ILTV-ΔUS9-S株及表达IBV S1蛋白的重组病毒ILTV-ΔUS9-S1株。两株重组病毒插入的外源基因S基因和S1基因不影响其体外复制能力,且ILTV-ΔUS9-S1株较亲本弱毒CK/CH/LHLJ/120305株复制滴度更高。两株重组病毒在LMH（Leghorn male hepatocellular cell,鸡肝癌细胞系）上连续传代15代,并以本研究制备的抗IBV S1蛋白的单克隆抗体对重组病毒进行间接免疫荧光检测,结果显示,IBV S蛋白和S1蛋白分别在两株重组病毒中能稳定表达,但表达量较低。两株重组病毒接种SPF鸡后,无不良临床反应,说明重组病毒对鸡是安全的。为评价两株重组病毒对ILTV强毒的免疫保护效果,采用间接ELISA对免疫鸡的血清抗体进行检测,结果显示,免疫后7 d两株重组病毒即能诱导鸡只产生高水平的血清抗体,其中ILTV-ΔUS9-S1株诱导产生的抗体水平更高。从ILTV WG株攻毒后的临床表现来看,两株重组病毒免疫组鸡只不表现呼吸道症状,喉头、气管中的病毒载量远低于对照组鸡只,且ILTV-ΔUS9-S株免疫组鸡只的咽拭子攻毒后8 d不再排毒,ILTV-ΔUS9-S1株免疫组攻毒后12 d不再排毒,显示两株重组病毒均能提供针对ILTV强毒株的完全保护。对于重组病毒针对IBV CK/CH/LDL/091022强毒株的免疫保护效果,s Ig A及IFN-γELISpot检测结果显示,两株重组病毒仅能诱导部分鸡只产生有限的特异性粘膜免疫及细胞免疫反应,对免疫后鸡只进行血清抗体检测,显示免疫后两个免疫组仅有部分鸡血清抗体转阳。两株重组病毒免疫组与对照组在IBV强毒攻毒后5 d时气管和肾脏内均可检测到病毒,各组病毒载量无显着差异,但攻毒后8 d重组病毒ILTV-ΔUS9-S株及ILTV-ΔUS9-S1株免疫组的咽拭子排毒率分别为50%,60%;攻毒后12 d分别为10%,0;相对于对照组在攻毒后8 d和12 d排毒率为80%和20%而言,两株重组病毒免疫后能够在一定程度上加速免疫鸡呼吸道内病毒的清除,但总体而言所激发的免疫保护作用较弱。综上所述,本研究成功构建了分别表达GI-19（QX）型IBV S蛋白和S1蛋白基因的重组ILTV,ILTV-ΔUS9-S株及ILTV-ΔUS9-S1株,两株重组病毒都能对ILTV强毒株攻击提供完全保护,也能够激发针对IBV GI-19（QX）型强毒株S1蛋白的免疫反应,但并不能提供针对IBV强毒的完全免疫保护作用,有待进一步改进和优化外源免疫原基因的表达水平,提升ILTV作为重组基因工程载体的潜在价值。
王丛丛[7]（2021）在《禽流感病毒H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立及其初步应用》文中提出禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）对禽类危害极大,可引起禽流行性感冒（Avian influenza,AI）。大多数AIV只会导致轻度到无症状的感染,但高致病性AIV,主要是H5和H7亚型,在家禽中会导致高达100%的死亡率。最近几年,H7亚型的流感病毒引发了严重的人和家禽的感染,据统计,2013年至2019年3月,H7N9病毒在中国的出现已导致1,568人感染,615人死亡。最初几年,该病毒是低致病性毒株,经过不断发生基因重组与突变,到2017年,进化为高致病性毒株,造成感染禽类快速发病、发生大量死亡,导致养禽业出现巨大损失。为控制H7N9 AIV对养禽业以及人类健康的威胁,降低鸡群中循环的病毒载量,我国开展了H7亚型禽流感疫苗的全面免疫工作。疫苗免疫后需要有可靠方便的实验方法评估抗体水平,因此,H7亚型AI抗体检测工作就显得尤为重要。经典的H7亚型AI抗体检测方法是血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验,该方法稳定性好,操作简便。但是,依然还是有一些不足之处,例如,自动化程度低、难以获得SPF红细胞且不能长期保存、四单位抗原的配制受到操作人员水平的影响较大等。为了避免HI方法的缺陷和进一步增加市场产品的多样化,本研究开展了H7亚型AI抗体的竞争性酶联免疫吸附试验（Competitive enzyme-linked immunosorbent assay,C-ELISA）的研究工作。本研究通过蔗糖梯度密度离心法纯化A/chicken/Guangdong/SD008/2017（H7N9）蛋白作为抗原;在实验室研究基础上,复苏H7亚型杂交瘤细胞1H9制备小鼠腹水,并通过Protein G过柱纯化,得到大量单克隆抗体;利用过碘酸钠法偶联辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）与单克隆抗体1H9制备酶标抗体（HRP-1H9）;根据棋盘滴定法确定最适包被浓度与血清稀释度来建立一种检测H7亚型AI抗体的C-ELISA方法。根据Med Calc软件绘制背景清晰的546份血清的ROC曲线及交互式点状图,确定判定血清样品阴、阳性的临界值。此外,本研究制备了抗AIV H1～H15、H7Nx（N1～N4,N7～N9）亚型鸡血清和其他禽类常见病的血清,如抗新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）鸡血清、抗传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）鸡血清,以及抗传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）鸡血清。并将这些血清作为特异性试验、敏感性试验和重复性试验的血清标准品,结合对1,392份现地样品的检测结果,评估了建立的检测H7亚型AI抗体的C-ELISA方法的诊断性能。根据试验结果,确定C-ELISA方法以5μg/m L浓度包被抗原,1/10稀释血清,1/3,000稀释酶标抗体。通过ROC曲线及交互式点状图分析178份AIV阴性和368份AIV阳性血清（n=546）,当抑制率（Percentage inhibition,PI）为40%时,C-ELISA的特异性和敏感性均达到较高水平,分别为99.44%和98.91%,因此确定C-ELISA的临界值为40%,即血清PI<40%时判定为H7亚型AI抗体阴性。在验证性试验中,通过检测AIV H7Nx（N1～N4,N7～N9）、H1～H6与H8～H15亚型血清以及NDV血清、IBV血清和IBDV血清,验证了建立的C-ELISA方法,除AIV H7各亚型血清外,其余亚型AIV及禽类常见病毒的血清均判定为阴性,具有良好的特异性;通过梯度稀释阳性血清,在320倍稀释时,仍可检测出血清的PI值大于40%,敏感性良好;批内和批间重复性试验的计算结果显示,两组试验的变异系数均小于12%,试验方法较为稳定;对现地样品进行检测,本方法与HI试验的符合率为98.56%。综上所述,本研究利用H7亚型特异性酶标单克隆抗体作为竞争抗体,建立了C-ELISA抗体检测方法。其特点在于同时加入了酶标抗体与待检血清进行竞争反应,与先加入待检血清,再加竞争抗体反应的常规方法比较,简化了操作步骤,缩短反应时间,为开展H7-AI抗体的大量检测提供了一种简单、便捷的技术手段。
朱子晨[8]（2021）在《禽流感病毒NS1蛋白拮抗干扰素水平的差异在NDV-AIV共感染过程中的作用》文中研究说明禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是世界范围内危害禽类的两种重要病毒,两者临床症状相似,主要引起家禽亚临床感染和呼吸道综合征。全球范围AIV和NDV共感染的现象普遍存在,且AIV与NDV共感染时存在相互抑制;尽管研究表明AIV与NDV在体内外感染时存在相互干扰,但这些结果大多基于流行病学数据以及基因水平的初步验证,本研究以NDV Herts/33以及H5N1（A/mallard/Huadong/S/2005）、H9N2（A/Hong Kong/1073/99）为研究对象,建立了NDV与AIV体外共感染模型,探讨了NDV与AIV在单独感染与共感染时的复制差异,深入研究了AIV NS1蛋白在NDV和AIV共感染过程中的作用及可能机制。NDV与AIV在共感染时可能存在拮抗现象。本试验建立了NDV与AIV体外共感染模型,并检测了在NDV和AIV感染的不同时期,AIV和NDV对病毒复制的影响。结果显示,NDV预先感染细胞可以显着降低H9N2亚型AIV NP蛋白表达量,然而NDV预先感染细胞对H5N1亚型AIV NP蛋白表达量无影响。其次,H9N2亚型AIV和H5N1亚型AIV预先感染细胞均能显着降低NDV NP蛋白的表达量。最后,TBK1通路及干扰素测定显示,H9N2亚型AIV不能抑制NDV引起TBK1磷酸化修饰及干扰素的上调表达,而H5N1亚型AIV可以抑制NDV引起TBK1磷酸化修饰及干扰素上调。表明NDV可以有效地抑制H9N2亚型AIV复制但不能抑制H5N1亚型AIV复制;NDV抑制不同亚型AIV复制的差异可能跟干扰素相关。H9N2亚型AIV和H5N1亚型AIV均能有效地抑制NDV复制。AIV NS1蛋白的可以有效拮抗宿主的干扰素以保证病毒复制。为了探究NS1蛋白是否在NDV抑制AIV的感染中扮演重要角色,本试验成功构建了高致病性、低致病性毒株NS1替换AIV感染性克隆,比较NDV感染对野生型AIV以及替换NS1 AIV复制的影响和对NDV诱导干扰素的拮抗作用。结果显示,NDV感染能显着降低H9N2与H5N1-s H9NS1 NP蛋白的表达量,抑制AIV复制,同时NDV预处理可以抑制H9N2复制且引起干扰素上调。La Sota与H5N1、H5N1H9NS1体内共感染实验表明,NDV在体内不能抑制H5N1的复制但能抑制NS1替换毒株H5N1H9NS1的复制,且NDV先感染机体的情况下,H5N1H9NS1相较于H5N1能引起更显着的干扰素上调,因此,NS1蛋白拮抗干扰素功能的强弱是影响NDV抑制AIV复制的关键因素。本试验前期研究发现,NDV感染诱导应激颗粒（Stress granules,SGs）形成,促进病毒复制。为探究H9N2对NDV感染诱导应激颗粒的影响,本试验比较了NDV与H9N2WT、H9N2H5NS1共感染时G3BP1的聚集情况,并通过H9N2 NS1蛋白过表达载体与NDV感染进行验证。结果显示,共感染时H9N2、H9N2H5NS1都明显抑制了G3BP1表达,且H9N2H5NS1抑制效果更明显。说明不同亚型的AIV NS1蛋白在共感染过程中影响了G3BP1的聚集程度,过表达结果显示H9N2 NS1蛋白对NDV诱导形成的G3BP1有显着拮抗作用。综上所述,在NDV与AIV共感染过程中,NS1H5比NS1H9具有更强的拮抗干扰素产生的能力,且对G3BP1有更强的抑制作用。本研究首次揭示了AIV NS1蛋白是NDV-AIV共感染相互抑制过程中具有差异性的关键因素,本研究将为更好地理解NDV-AIV共感染奠定基础,也为未来疾病防控提供理论支撑。
曹祁峰,任显东,李阁锦,李冰[9]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及S1基因遗传演化分析》文中研究指明为调查辽宁地区鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的流行及遗传演化情况,从辽宁某鸡场疑似鸡传染性支气管炎病料中分离得到1株病毒,经分子生物学检测、鸡胚矮小化试验、新城疫病毒血凝特性干扰试验和动物回归试验,确定该毒株为IBV,并命名为CH/LN/2019。扩增该毒株S1基因并进行序列分析发现,分离株S1基因全长1 620 nt,编码540个氨基酸,S1蛋白裂解位点为HRRRR,属于基因Ⅰ型（QX型）毒株;同源性比对发现,分离株与基因Ⅰ型代表毒株QXIBV株的核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为95.6%和94.8%;与国内常规型疫苗H52、H120和Ma5毒株的同源性较低,核苷酸和氨基酸序列同源性仅为77.2%～76.9%和75.4%～76.2%。本试验为辽宁地区鸡传染性支气管炎的流行病学调查及免疫防控提供了参考。
冯林[10]（2020）在《H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立和应用》文中研究指明家禽呼吸道病原是世界范围内家禽发病和死亡的主要原因,常见的有禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒、大肠杆菌、支原体等,其中病毒性疾病导致发生急性和高度接触性感染,对经济影响最重要。与单个病原感染相比,多种病原混合感染在家禽很常见,并导致更严重的临床症状,如气管堵塞、呼吸困难等。低致病性H9N2亚型禽流感病毒在我国鸡群中广泛流行,当与其他呼吸道病原体,特别是与IBV、ILTV等呼吸道病原共感染,可加重H9N2感染而且死亡率差异大。IBV有多种血清型,缺乏交叉免疫,保护效果差,经常导致免疫失败。传染性喉气管炎近年来也在鸡群中时有发生。这些病原体对养禽业具有重要意义,并具有巨大的经济影响,因为它们能够单独或与其他禽类病原体混合感染诱发疾病。目前已经开发出许多用于检测禽呼吸道病毒的荧光定量PCR方法,为从事禽呼吸道病毒感染诊断的人们提供了参考。但是,这些检测方法大多数都只能检测一种病毒,并且不同方法的反应条件也不尽相同。因此,迫切需要一种检测多种重要病原体的可靠的多重荧光定量PCR方法,以用于检测未知样品。本研究旨在建立一种用于检测H9N2 AIV、IBV和ILTV的三重TaqMan荧光定量PCR方法,可同时快速检测H9N2AIV、IBV、ILTV三种病毒,并在2019年从我国17个省份发生呼吸道疾病鸡群采集病料样品660份,应用建立的方法进行了三种病原的临床样品检测。1.H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立H9N2AIV、IBV和ILTV可引起家禽呼吸道疾病,因其临床表现相似,三者之间或与其它病原体常发生混合感染,临床诊断容易混淆。本研究中,我们建立了 一 种三重实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantification PCR,RT-qPCR）检测方法来直接检测3种病毒。该方法以H9N2的HA基因、IBV的5’非编码区和ILTV的ICP4基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针。重组质粒标准品10倍倍比稀释（5×100～5×109copies/μL）分析RT-qPCR灵敏度,单检测具有理想的R2值和效率,检测灵敏度较高。H9AIV、IBV和ILTV的检测限分别在50、500和500copies/反应。批内和批间具有相对较小的变异值,可重复性良好。RT-qPCR具有极好的特异性,与阴性样本或其它常见禽病毒没有交叉反应。H9N2AIV、IBV和ILTV的探针使用不同荧光标记（FAM、HEX和Cy5）,可以同时检测这三种病毒。三重RT-qPCR的R2值、PCR扩增效率和较小的批内和批间变异性与单检测具有可比性。这是首次使用三重RT-qPCR对气管和肺混合样品或棉拭样品同时检测H9N2、IBV和ILTV,并且三重RT-qPCR的检测限与单检测方法相同。因此,该方法节省了时间,可提供定量结果且三者之间没有交叉反应。本文建立的三重RT-qPCR检测方法可用于单或三重检测,适用于大批量检测,且具有可靠的灵敏度和特异性,有望对这三种常见的病毒进行监测。2.TaqMan三重荧光定量PCR方法在临床样品检测中的应用从我国江苏、山东、河北等17个省份共采集了 660份临床样品,样品处理后,用建立的TaqMan三重荧光定量PCR的方法进行三种病原的检测病毒的核酸。其中总检出率IBV最高（30.91%）,其次为ILTV（19.39%）和H9AIV（14.7%）。H9和IBV、H9和ILTV、IBV和ILTV混合感染的检出率分别为4.39%、3.79%和8.03%,3种病原共感染的检出率为1.21%。时间分布上,一年四季均可发病,但是12月份混合感染的检出率最高,IBV和ILTV、H9N2 AIV和ILTV、H9N2AIV和IBV的共感染率分别为21.52%、10.13%、4.22%,三种病原混合感染率为3.38%。根据宿主分布特点来看肉鸡3种病原的检出率均比蛋鸡高,尤其是IBV,检出率高达54.07%。根据其地域分布规律,可看出江苏、山东、河北的病原检出率较高,当然,这也可能与各省的采样量不均匀有关。综上所述,H9AIV、IBV、ILTV在我国养禽业中依然盛行,应当做好流行病学监测,为疾病的预防控制指明方向。本研究建立的三重检测方法在临床上进行疾病的诊断和流行病学调查中具有快速、特异性强等优点,为疾病诊断和流行病学监测提供了一个有力的技术支持。
二、一步法多重RT—PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一步法多重RT—PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究（论文提纲范文）
（1）鸡传染性支气管炎诊断技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 流行病学 |
| 2 临床症状及剖检特征 |
| 3 诊断方法 |
| 3.1 病毒分离鉴定 |
| 3.2 血清学诊断 |
| 3.2.1 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 3.2.2 血凝抑制试验（heamagglutination inhibition test,HI) |
| 3.2.3 病毒中和试验（virus neutralization test,VNT) |
| 3.3 免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC) |
| 3.4 分子生物学诊断 |
| 3.4.1 反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR) |
| 3.4.2 多重PCR(multiplex polymerase chain reaction) |
| 3.4.3 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP) |
| 3.4.4实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR） |
| 3.4.5重组聚合酶等温扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA） |
| 3.5 蛋白芯片技术 |
| 3.6 其他诊断技术 |
| 4 结语 |
（3）禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒样品 |
| 1.2 禽流感病毒核酸样品 |
| 1.3 特异性核酸样品 |
| 1.4试验试剂 |
| 1.3仪器 |
| 1.4 引物、探针的设计 |
| 1.5 禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立 |
| 1.6 敏感性试验 |
| 1.7 特异性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2 分析敏感性试验 |
| 2.3 特异性试验 |
| 3 讨论 |
（4）禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 禽流感综述 |
| 1.1 禽流感的病原学 |
| 1.2 禽流感的流行病学 |
| 1.3 禽流感的临床症状及病理变化 |
| 1.4 禽流感病毒的检测方法 |
| 1.5 禽流感的防控 |
| 2 病毒的灭活及冻干技术研究进展 |
| 2.1 病毒的灭活 |
| 2.2 病毒的冻干 |
| 3 研究目的与意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 特异性引物探针 |
| 1.6 质控品 |
| 1.7 临床样品 |
| 1.8 阳性对照品 |
| 1.9 阴性对照品 |
| 1.10 禽流感病毒(通用、H5、H7)三重荧光RT-PCR试剂盒中引物探针的配比 |
| 1.11 禽流感病毒(通用、H5、H7)三重荧光RT-PCR试剂盒的组成及使用方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 核酸提取 |
| 2.2 荧光RT-PCR试验 |
| 2.3 血凝试验 |
| 2.4 质控品制备工艺研究 |
| 2.5 质控品的制备及鉴定 |
| 2.6 禽流感病毒(通用、H5、H7)三重荧光RT-PCR试剂盒的质量研究 |
| 2.6.1 敏感性研究 |
| 2.6.2 特异性研究 |
| 2.6.3 重复性研究 |
| 2.7 样品处理 |
| 结果 |
| 3.1 质控品制备工艺研究结果 |
| 3.2 质控品的制备及鉴定结果 |
| 3.3 禽流感病毒(通用、H5、H7)三重荧光RT-PCR试剂盒的质量研究 |
| 3.3.1 敏感性研究结果 |
| 3.3.2 特异性研究结果 |
| 3.3.3 重复性稳定性研究结果 |
| 3.4 临床样品检测结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简介) |
| 附录B (在研期间发表论文) |
（5）重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 新城疫的研究概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 病理变化 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.1.5 新城疫疫苗的研究进展 |
| 1.2 传染性支气管炎的研究概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 临床症状及病理变化 |
| 1.2.3 诊断方法 |
| 1.2.4 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 伦理性声明 |
| 2.1.2 毒株及细胞 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要溶液的配制 |
| 2.1.7 主要软件的使用 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组病毒rNDV-IBV-T/B株遗传稳定性分析 |
| 2.2.2 重组病毒rNDV-IBV-T/B株灵敏性及特异性分析 |
| 2.2.3 重组病毒rNDV-IBV-T/B株的毒力测定 |
| 2.2.4 重组病毒疫苗对靶动物鸡的体内残留实验及环境影响 |
| 2.2.5 间接免疫荧光检测鸡只组织脏器及环境中重组病毒的存在 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组病毒rNDV-IBV-T/B株遗传稳定性分析 |
| 3.2 重组病毒rNDV-IBV-T/B株特异性及灵敏性分析 |
| 3.3 重组病毒rNDV-IBV-T/B株病毒滴度测定 |
| 3.4 重组病毒疫苗对靶动物鸡的体内残留实验及环境影响 |
| 3.4.1 免疫后临床及剖检变化 |
| 3.4.2 主要脏器及环境中重组病毒基因PCR检测 |
| 3.4.3 主要脏器及环境中重组病毒间接免疫荧光检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
（6）表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概述 |
| 1.1.1 鸡传染性支气管炎流行病学特征 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒生物学特性 |
| 1.1.3 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白概述 |
| 1.1.4 鸡传染性支气管炎疫苗研究进展 |
| 1.2 鸡传染性喉气管炎病毒及其作为疫苗载体的应用 |
| 1.2.1 疱疹病毒作为疫苗载体的优点 |
| 1.2.2 鸡传染性喉气管炎流行病学 |
| 1.2.3 疱疹病毒的US9 基因 |
| 1.2.4 鸡传染性喉气管炎病毒疫苗研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒与鸡胚 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 酶及主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 转移质粒的构建 |
| 2.2.2 重组病毒的构建及鉴定 |
| 2.2.3 重组病毒的生长特性研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 转移质粒p ILTΔUS9-S、p ILTΔUS9-S1 的构建 |
| 2.3.2 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株的构建及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 IBV S1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及实验动物 |
| 3.1.2 质粒与菌株 |
| 3.1.3 酶及主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组蛋白的构建 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.3 单克隆抗体的制备及效价检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IBV CK/CH/LDL/091022 毒株S1 蛋白的真核表达 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞的制备及单克隆抗体鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒、鸡与鸡胚 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组病毒对ILTV WG株的免疫保护评价 |
| 4.2.2 重组病毒对IBV CK/CH/LDL/091022 分离株的免疫保护评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株对ILTV的免疫保护作用评价 |
| 4.3.2 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株对IBV的免疫保护作用评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）禽流感病毒H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立及其初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 AIV蛋白结构和功能 |
| 1.2.1 RNA聚合酶复合体蛋白(PB1、PB2、PA) |
| 1.2.2 血凝素(HA) |
| 1.2.3 核蛋白(NP) |
| 1.2.4 神经氨酸酶(NA) |
| 1.2.5 基质蛋白(M1、M2) |
| 1.2.6 非结构蛋白(NS1、NEP/NS2) |
| 1.3 H7亚型AIV流行动态 |
| 1.4 禽流感抗原和抗体诊断方法的研究进展 |
| 1.4.1 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR(r PCR) |
| 1.4.3 数字PCR(d PCR) |
| 1.4.4 HA试验和血凝抑制(HI)试验 |
| 1.4.5 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 1.4.6 胶体金免疫层析法(GICA) |
| 1.4.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 H7-AIV蛋白、HRP-1H9 及血清标准品的制备 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 病毒、细胞、血清和试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂和材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液和样品准备 |
| 2.2 抗原的扩增与纯化 |
| 2.2.1 抗原的扩增 |
| 2.2.2 抗原的纯化 |
| 2.3 单克隆抗体的扩增、纯化与标记 |
| 2.3.1 杂交瘤细胞的复苏 |
| 2.3.2 腹水的制备 |
| 2.3.3 单克隆抗体的纯化 |
| 2.3.4 过碘酸钠法标记抗体 |
| 2.4 血清的制备与检验 |
| 2.4.1 病毒效价测定 |
| 2.4.2 接种免疫原 |
| 2.4.3 鸡血的采集 |
| 2.4.4 血清的制备 |
| 2.4.5 血清的检验 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 制备与纯化出H7亚型AIV抗原 |
| 2.5.2 成功纯化1H9 单克隆抗体 |
| 2.5.3 获得高效的酶标抗体 |
| 2.5.4 获得特异性与敏感性标准品 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 禽流感病毒H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立及其初步应用 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 抗原、抗体和血清 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2 H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.2.1 抗原浓度、血清和酶标抗体稀释倍数的选择 |
| 3.2.2 反应条件的优化 |
| 3.2.3 H7亚型C-ELISA临界值的判定 |
| 3.2.4 特异性试验 |
| 3.2.5 敏感性试验 |
| 3.2.6 重复性试验 |
| 3.2.7 现地样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 确定出抗原包被浓度、血清及酶标抗体稀释倍数 |
| 3.3.2 确定最佳H7亚型C-ELISA抗体检测方法的反应条件 |
| 3.3.3 确定出H7亚型C-ELISA抗体检测方法的临界值 |
| 3.3.4 H7亚型C-ELISA抗体检测方法特异性良好 |
| 3.3.5 H7亚型C-ELISA抗体检测方法敏感性良好 |
| 3.3.6 H7亚型C-ELISA抗体检测方法重复性较好 |
| 3.3.7 H7亚型C-ELISA与 HI试验检测的符合率较高 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）禽流感病毒NS1蛋白拮抗干扰素水平的差异在NDV-AIV共感染过程中的作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 多种病原共感染研究进展 |
| 1.1.1 多病原共感染概述 |
| 1.1.2 病毒和衣原体 |
| 1.1.3 细菌和真菌 |
| 1.1.4 病毒和病毒 |
| 1.1.5 病毒与细菌 |
| 1.1.5.1 致病菌和病毒共感染 |
| 1.1.5.2 感染机制 |
| 1.2 NDV-AIV共感染概述 |
| 1.2.1 NDV概述 |
| 1.2.2 AIV概述 |
| 1.2.3 AIV NS1蛋白概述 |
| 1.2.4 NDV与AIV共感染现状 |
| 1.3 共感染机制研究的目的与意义 |
| 1.3.1 NDV与AIV两者异同 |
| 1.3.2 本研究目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 伦理声明 |
| 2.1.2 实验用病毒、细胞及抗体 |
| 2.1.3 所用溶液试剂与配制 |
| 2.1.4 主要设备仪器 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 共感染基本操作 |
| 2.2.1.1 细胞上病毒共感染实验设计 |
| 2.2.1.2 A549细胞复苏、传代及铺板 |
| 2.2.1.3 禽流感病毒H9N2亚型感染A549最适胰酶浓度的确定 |
| 2.2.1.4 病毒在细胞上的共感染 |
| 2.2.1.5 收集和处理细胞样品 |
| 2.2.1.6 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.1.7 Western Blot分析 |
| 2.2.1.8 荧光实时定量检测 |
| 2.2.1.9 胶回收、连接与转化 |
| 2.2.1.10 质粒提取 |
| 2.2.2 病毒拯救及共感染 |
| 2.2.2.1 H5亚型AIV和H9亚型AIV8个基因片段的鉴定与回收 |
| 2.2.2.2 替换NS1基因H5和H9亚型AIV的拯救、传代与鉴定 |
| 2.2.2.3 重组病毒生物学特性测定 |
| 2.2.2.4 替换NS1毒株与新城疫体外共感染 |
| 2.2.2.5 替换NS1毒株与新城疫体内共感染 |
| 2.2.3 H9N2亚型AIV与NDV共感染过程中SG与AIV拮抗作用 |
| 2.2.3.1 剂量梯度NDV与H9N2共感染 |
| 2.2.3.2 构建H9N2亚型NS1蛋白过表达载体 |
| 2.2.3.3 NS1_(H9N2)蛋白在共感染过程中的作用 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 NDV对不同亚型AIV的抑制作用 |
| 3.1.1 H9N2亚型AIV感染A549细胞最适胰酶浓度的确定 |
| 3.1.2 NDV感染对H9N2亚型AIV的影响 |
| 3.1.3 NDV感染对H5N1亚型AIV的影响 |
| 3.1.4 AIV感染对NDV的影响 |
| 3.1.5 NDV与不同亚型AIV共感染中TBK1通路水平的测定 |
| 3.1.6 NDV与不同亚型AIV共感染中干扰素表达的水平 |
| 3.2 拯救替换NS1基因的流感病毒及拯救病毒的共感染 |
| 3.2.1 替换NS1基因流感病毒的拯救 |
| 3.2.2 替换NS1基因流感病毒的鉴定 |
| 3.2.3 替换NS1基因流感病毒的生物学特性测定 |
| 3.2.4 NDV与替换NS1基因AIV在共感染中干扰素的水平 |
| 3.2.5 NDV感染对替换NS1基因AIV在体外A549细胞上的影响 |
| 3.2.6 NDV感染对替换NS1基因AIV在体内SPF鸡上的影响 |
| 3.3 SG在 NDV-AIV共感染中的功能初探 |
| 3.3.1 不同剂量NDV的预处理对H9N2的影响 |
| 3.3.2 H9N2对NDV诱导G3BP1聚集的影响 |
| 3.3.3 H9N2 NS1蛋白对NDV诱导G3BP1聚集的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及S1基因遗传演化分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料来源及试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 病料的检测 |
| 1.2.2 病毒的增殖与EID50的测定 |
| 1.2.3 病毒纯化与血凝试验 |
| 1.2.4 新城疫病毒抑制试验 |
| 1.2.5 S1基因克隆与测序 |
| 1.2.6 S1基因序列遗传进化分析 |
| 1.2.7 动物回归试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病料检测 |
| 2.2 鸡胚发育情况和EID50的测定 |
| 2.3 血凝试验 |
| 2.4 新城疫抑制试验 |
| 2.5 S1基因克隆与测序 |
| 2.6 S1基因遗传演化、同源性分析与裂解位点分析 |
| 2.7 动物回归试验 |
| 3 讨论 |
（10）H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 鸡呼吸道疾病病因分析 |
| 1.1 病原体感染 |
| 1.2 环境因素 |
| 1.3 免疫应激 |
| 1.4 自身生理结构因素 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 遗传进化 |
| 2.3 H9N2 AIV的流行现状 |
| 3 传染性支气管炎病毒 |
| 3.1 病原学 |
| 3.2 遗传进化 |
| 3.3 IBV流行现状 |
| 4 传染性喉气管炎病毒 |
| 4.1 病原学 |
| 4.2 遗传进化 |
| 4.3 ILT流行现状 |
| 5 分子生物学检测方法 |
| 5.1 AIV检测方法 |
| 5.2 IBV检测方法 |
| 5.3 ILTV检测方法 |
| 5.4 禽呼吸系统疾病多重检测方法 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物、探针的设计与合成 |
| 2.2 质粒标准品的制备 |
| 2.3 荧光定量PCR反应体系和条件的优化 |
| 2.4 特异性、灵敏度、重复性试验 |
| 2.5 抗干扰试验 |
| 2.6 样品检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 质粒标准品构建结果 |
| 3.2 单和三重荧光定量PCR反应体系和条件的优化结果 |
| 3.3 单荧光定量PCR的评估 |
| 3.4 三重荧光定量PCR的评估 |
| 3.5 荧光定量PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 TaqMan三重荧光定量PCR方法在临床样品检测中的应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病料处理 |
| 2.2 病料总RNA和DNA的提取 |
| 2.3 三重荧光定量PCR检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 检测结果 |
| 3.3 时间分布特点分析 |
| 3.4 宿主分布特点分析 |
| 3.5 地域分布特点分析 |
| 3.6 月龄分布特点分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
四、一步法多重RT—PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究（论文参考文献）
- [1]鸡传染性支气管炎诊断技术研究进展[J]. 张先东,蒋郁明,费奕强,薛晓阳,侯月娥. 中国动物检疫, 2022(01)
- [2]鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及鸡5种病毒多重PCR诊断方法的初步建立[D]. 马彩红. 新疆农业大学, 2021
- [3]禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立[J]. 杨楠,翟少伦,许军海,杨丹芳,娄亚坤. 中国动物保健, 2021(06)
- [4]禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量研究及应用[D]. 赵成龙. 延边大学, 2021
- [5]重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价[D]. 陈顺. 山东农业大学, 2021(01)
- [6]表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价[D]. 盛洁. 中国农业科学院, 2021
- [7]禽流感病毒H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立及其初步应用[D]. 王丛丛. 中国农业科学院, 2021(09)
- [8]禽流感病毒NS1蛋白拮抗干扰素水平的差异在NDV-AIV共感染过程中的作用[D]. 朱子晨. 山东农业大学, 2021(01)
- [9]鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及S1基因遗传演化分析[J]. 曹祁峰,任显东,李阁锦,李冰. 畜牧与兽医, 2021(02)
- [10]H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立和应用[D]. 冯林. 扬州大学, 2020(04)
标签：禽流感论文; elisa试剂盒论文; 血清蛋白论文; 新城疫论文; 基因合成论文;