一、用单克隆抗体展示猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白在菌体表面的形态和分布（论文文献综述）
付磊[1]（2020）在《原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究》文中提出虽然经典遗传操作工具在少数模式细菌中有着很好的效果,但并不适用于大多数重要病原菌在内的其它细菌。新型基因编辑技术CRISPR/Cas9由于存在表达元件复杂、脱靶效率高以及细菌存在抗Cas9分子等因素,限制了该技术在很多病原菌中的应用。因此,开发通用、简便、高效、无痕的遗传操作工具对于病原菌致病机制和防控技术的研究具有重要的价值和意义。多杀性巴氏杆菌对猪、牛、鸡、鸭等畜禽养殖业危害严重,缺乏高效的遗传操作工具极大限制了该病原菌致病机理的研究及防控产品的研发。为了研究禽多杀性巴氏杆菌的致病机理和基因工程疫苗,我们实验室前期应用多种经典遗传操作系统,如温敏自杀系统、Sac B筛选系统、galk筛选系统及thy A筛选系统等,来构建禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株但都未成功。后来采用NgAgo/gDNA系统成功实现了禽多杀性巴氏杆菌和兔多杀性巴氏杆菌靶基因的敲除和敲入,并获得了毒力下降的疫苗候选菌株,说明NgAgo/gDNA系统为多杀性巴氏杆菌致病机制和防控产品的研究提供了遗传操作工具,但该系统介导细菌基因组编辑的分子机制并不清楚。鉴于此,本论文主要研究原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌基因敲除及其分子机制,其研究内容如下:1)NgAgo介导不同细菌靶基因的敲除及敲入。我们实验室前期研究发现NgAgo/gDNA系统可以高效介导多杀性巴氏杆菌基因的敲除及敲入,但该系统能否用于其它细菌基因敲除需要进一步研究。本研究发现NgAgo/gDNA系统成功介导大肠杆菌aste基因缺失的效率高达90%。表明NgAgo/gDNA系统可以应用于多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌等细菌的基因敲除。2)NgAgo介导细菌基因敲除不依赖自身的DNA酶活性。CRISPR/Cas9系统可通过g RNA靶向切割基因组DNA而提高同源重组效应,来实现细菌基因组编辑,NgAgo/gDNA系统介导细菌基因敲除是否同样依赖gDNA靶向切割基因组DNA的水解酶活性需要进一步探究。故本论文将NgAgo潜在的酶活性位点（D633A,D738A）进行突变,发现仍能高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi基因敲除。不引入外源gDNA,NgAgo也可以高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi及opa基因的敲除。表明NgAgo提高细菌基因敲除的效率不依赖自身DNA酶活性及外源gDNA。3)NgAgo蛋白通过增强recA介导同源DNA链交换来提高同源重组效率。既然NgAgo介导细菌基因敲除不依赖其自身DNA酶活性及外源gDNA,其机制有待解析。本论文采用IP方法筛选NgAgo蛋白互作分子并通过质谱鉴定同源重组酶recA为其互作蛋白,随后通过正反向Co-IP验证NgAgo与内源性recA互作,且互作不受DNase I处理的影响。通过分析纯化的重组NgAgo蛋白和recA蛋白之间的互作,发现两种蛋白可直接互作,进一步应用SPR技术发现NgAgo与recA互作亲和力高于10n M,暗示recA为NgAgo的互作蛋白。同源重组过程中recA通过与单链DNA结合,并介导单链DNA与同源DNA的链交换而实现同源重组。本论文研究发现NgAgo蛋白并没有显着增加recA蛋白与单链DNA的结合,但却能显着增强recA介导的同源DNA链交换能力。表明NgAgo介导细菌基因敲除的机制是NgAgo蛋白与同源重组酶recA结合,并增强recA介导的同源DNA链交换能力,从而提高了同源重组效率,实现了细菌基因组编辑。4)PIWI结构域是NgAgo蛋白介导细菌基因组编辑的主要结构域。NgAgo蛋白主要由四个结构域构成,即N端、PAZ、MID及PIWI结构域,为了分析NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域,将NgAgo分段为NgAgo-A（N端）、B（PAZ-MID-PIWI区域）、C（N-PAZ区域）、D（MID-PIWI区域）。发现NgAgo-A和NgAgo-C不能,而NgAgo-B和NgAgo-D能与recA互作且高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi基因的敲除。说明NgAgo蛋白C端是其介导细菌基因组编辑的主要结构域。为了排除C端PIWI结构域的DNA酶活性,本论文将NgAgo-D蛋白的酶活性位点进行突变,发现其仍能和recA互作,增强recA介导的同源DNA链交换能力,提高同源重组效率来介导禽多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌基因的敲除。表明NgAgo蛋白C端是其介导细菌基因组编辑的主要区域,且不依赖于自身DNA水解酶活性。为了进一步分析NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域是MID或PIWI,故将NgAgo分段为NgAgo-E（MID）和NgAgo-F（PIWI）,发现PIWI是与recA互作且高效介导禽多杀性巴氏杆菌opa基因敲除的主要结构域。表明PIWI结构域是NgAgo蛋白介导基因组编辑的主要结构域,且不依赖于自身DNA水解酶活性。5)多种pAgo蛋白均能高效介导细菌基因敲除且不依赖其DNA酶活性。NgAgo蛋白可以通过PIWI结构域与recA互作,增强recA介导的同源重组效率来介导细菌基因组编辑,本论文进一步分析了其它原核生物Ago蛋白PIWI结构域的功能保守性。对嗜热栖热菌的Tt Ago、嗜热古细菌的Pf Ago及超嗜热菌的Aa Ago进行分析,发现三种pAgo（MID-PIWI区域）蛋白都能与细菌recA蛋白互作,能高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi及opa基因的敲除,且不依赖于PIWI区域的DNA酶活性。表明不同原核生物Ago蛋白的PIWI结构域具有功能保守性,均可介导细菌的基因组编辑。总之,本研究发现具有PIWI结构域的pAgo蛋白都能介导多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的基因组编辑,其机制是不依赖于gDNA靶向切割基因组DNA的水解酶活性,而是pAgo的PIWI结构域与recA互作,增强recA介导的同源DNA链交换能力,从而提高同源重组效率。pAgo具有开发为通用、简便、高效、无痕的细菌基因组编辑工具的潜力,为研究重要病原菌的致病机理及防控产品等方面奠定了基础。
王宇航[2]（2020）在《猪链球菌与ⅡA型磷脂酶A2相互作用机制研究》文中进行了进一步梳理猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）,为革兰氏阳性兼性厌氧菌,是一种新发的重要人兽共患病病原体,依据荚膜多糖的抗原性,猪链球菌可分为35个血清型（1～34型和1/2型）,其中猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2）是毒力最强,分布最广的血清型。人和猪感染后会导致脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症甚至导致急性死亡等。1998年和2005年分别两次在江苏省和四川省引起大规模感染,其严重威胁着养猪业的发展和人类的健康。近些年的研究发现,荚膜多糖（Capsular polysaccharide,CPS）、溶菌酶释放蛋白（Muramidase released protein,MRP）、胞外因子（Extracellular factor protein,EF）、溶血素（Suilysin,SLY）等物质是猪链球菌致病的主要毒力因子。磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2）是一种催化磷脂在sn-2位置水解的酶,可产生溶血磷脂和游离脂肪酸。哺乳动物PLA2可分为分泌型（s PLA2）、胞浆型（c PLA2）和非钙离子依赖型（i PLA2）。其中ⅡA型PLA2（PLA2G2A）是分泌型PLA2中研究最多的酶。PLA2G2A能单独或与杀菌/通透性增加蛋白（BPI）协同作用结合并穿透细菌细胞壁,水解细胞膜磷脂,使细菌细胞膜受损、破裂而杀死细菌。当宿主某部位有炎症或细菌感染时,PLA2G2A在该部位的浓度迅速增加,在此浓度下PLA2G2A能够有效的杀死感染的细菌,其在宿主防御细菌感染中起着重要的作用,被认为是固有免疫的一部分。目前,关于PLA2G2A的确切作用还不完善,对猪链球菌和PLA2G2A作用的研究也相对空白,因此研究猪链球菌与PLA2G2A之间的作用有助于完善猪链球菌与宿主相互作用的机制。在本研究中,我们首先通过体外实验证实PLA2G2A对猪链球菌的杀菌作用。在第一章的研究中,我们首先比较PLA2G2A对不同病原菌菌株的杀菌活性。PLA2G2A对革兰氏阴性病原菌没有明显的杀菌活性,与之相比,革兰氏阳性病原菌猪链球菌能够被其所杀灭,其存活率随浓度的升高逐渐降低。另外两种革兰氏阳性病原菌化脓链球菌和无乳链球菌对PLA2G2A更加敏感。证明猪链球菌可以被PLA2G2A有效杀伤,但需要较高的浓度。2148hk/rr基因是猪链球菌中的一个二元调控系统,与猪链球菌2型05ZYH33菌株和261菌株相比,突变株Δ2148hk/rr对PLA2G2A更敏感。另外比较了PLA2G2A对不同血清型猪链球菌杀菌作用,结果表明四种血清型的猪链球菌对PLA2G2A的作用表现出浓度和时间依赖性以及不同的敏感性,敏感性由强到弱依次为S7>S2>S9>S1,结合透射电镜观察相应菌株的形态,初步推断猪链球菌的荚膜影响PLA2G2A的杀菌作用。原子力显微镜观察测量结果显示,猪链球菌与PLA2G2A作用后,其表面电势改变,推测二者通过静电相互作用结合。特异性抑制剂和二价金属阳离子的作用结果,证明PLA2G2A依赖自身的磷脂酶酶活性发挥对猪链球菌的杀菌作用,其中二价金属阳离子起到重要作用。荚膜多糖是猪链球菌重要的毒力因子,在抵抗宿主免疫吞噬细胞吞噬过程中发挥重要作用。为了研究猪链球菌荚膜对PLA2G2A杀菌作用的影响,在第二章的研究中,我们首先构建了猪链球菌2型CPS基因簇缺失突变株ΔCPS,结合PCR鉴定和透射电镜观察形态证明构建成功,与野生株相比其表面荚膜缺失。Balb/c小鼠攻毒实验证明,突变株ΔCPS毒力下降。血中存活实验表明,突变株ΔCPS在血中存活能力减弱,更容易被清除,但在全血中加入PLA2G2A后,与未加相比,野生株05ZYH33的存活率降低,而突变株ΔCPS存活率无明显变化。体外杀菌实验表明突变株ΔCPS要达到与野生株05ZYH33相同的杀菌率,需要更高的PLA2G2A浓度,更长的作用时间。荚膜菌株比荚膜缺失菌株更敏感,我们推断是由于带负电的荚膜与带正电的碱性蛋白PLA2G2A亲和力更高,更容易结合。BLI实验证明,PLA2G2A和荚膜菌株具有更强的亲和力。本章的研究证明猪链球菌荚膜对PLA2G2A杀菌作用有正向影响。为了进一步研究猪链球菌与PLA2G2A的作用,在第三章我们研究猪链球菌对宿主PLA2G2A表达的影响。猪链球菌刺激人脑微血管内皮细胞后,在转录水平Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型PLA2有所表达,但检测不到PLA2G2A的表达。ELISA实验证明小鼠腹腔巨噬细胞系RAW 264.7 PLA2G2A表达水平低。同时Dot-Blot实验证明C3H/He N小鼠受到细菌感染后,循环中的PLA2G2A含量同样较低。因此我们选用已被应用于研究细菌与宿主PLA2G2A作用的豚鼠肺泡巨噬细胞（AMs）来进一步研究猪链球菌对宿主PLA2G2A表达的影响。猪链球菌与肺泡巨噬细胞作用后,实时定量PCR结果显示,猪链球菌能引起PLA2G2A表达的上调。但与野生株05ZYH33和互补株CΔSLY相比,突变株ΔSLY诱导AMs表达更高水平的PLA2G2A。重组猪链球菌溶血素r SLY单独和AMs作用,PLA2G2A表达水平无明显变化,LPS可引起PLA2G2A表达的上调,将LPS和r SLY共同与AMs孵育,结果显示随着r SLY浓度的增加,PLA2G2A表达水平逐渐降低,说明SLY对PLA2G2A的表达的有负向影响。另外猪链球菌2型腺苷合成酶缺失突变株ΔSsads和ΔSLY的效果类似。综上所述,本研究展示了PLA2G2A对猪链球菌的杀菌作用,表明了猪链球菌表面的荚膜对PLA2G2A杀菌作用的正向影响,证明了猪链球菌能够诱导宿主表达PLA2G2A,其相关毒力因子能限制PLA2G2A的表达,结果显示了猪链球菌与PLA2G2A相互作用的复杂性。
乔宏[3]（2020）在《基于Mrp的猪链球菌病间接ELISA检测方法的建立》文中研究说明猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是一种在自然界中分布广泛的革兰氏阳性菌,猪、马、牛、羊、鸡、小鼠等多种动物均可感染SS继而发病。其中猪的易感性最高,感染后的发病猪会出现脑膜炎、关节炎、以及败血症等临床症状。同时,人也可以感染SS继而出现脑膜炎、败血症等临床症状。由于SS引起的猪链球菌病的死亡率较高且该病的传播速度较快,给养猪行业造成了巨大的经济损失,同时也严重危害着人类健康。因此,及时的检测与诊断是预防猪链球菌病的关键。由于传统的病原分离培养和生化鉴定方法很难对该病做出及时且准确的诊断,并且也不太适合大量样品的检测。所以,建立一种能够快速、准确并且高效的检测方法对该病的预防以及流行病学研究具有重要的意义。溶菌酶释放蛋白（Muramidase-released protein,Mrp）是SS的一种重要的毒力标志因子,具有良好的免疫原性。本研究对mrp基因26173710 bp区段进行扩增,并进一步原核表达和纯化。对纯化的Mrp蛋白进行Western blot分析,结果表明该蛋白的反应原性良好。用纯化的Mrp蛋白作为包被抗原,建立了检测SS血清抗体的间接ELISA方法。实验分别对抗原包被浓度、待检血清稀释倍数及作用时间、封闭液及封闭温度和时间、二抗稀释倍数及作用时间、底物显色时间等进行了优化。并最终确定了该间接ELISA方法的最佳实验条件为:抗原包被浓度为0.05μg/mL,待检血清1∶400倍稀释37℃作用30 min,5%脱脂乳作为封闭液37℃封闭2 h,二抗1∶15000倍稀释37℃作用30 min,底物显色时间为15 min,临界值为0.226。随后对该方法的特异性、敏感性、重复性、临床样品的检测以及保存期等进行了评估。结果表明,该方法的特异性为97%,并且与副猪嗜血杆菌（HPS）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）等几种常见的猪源细菌性以及病毒性疾病的阳性血清不发生交叉反应。同时,猪链球菌2型（SS2）、7型（SS7）、9型（SS9）以及12型（SS12）阳性血清的检测结果均为阳性;敏感性为96%,并且血清样品的最低检出上限为1∶3200倍稀释;重复性试验中,批内以及批间的最大变异系数分别为4.70%和7.20%;对100份临床血清样品用本实验建立的间接ELISA方法和玻片凝集试验同时进行检测,两者总符合率为85.3%;用该间接ELISA方法对440份临床猪血清样品进行检测,其阳性检出率为27.7%;已包被抗原的96孔板在4℃条件下保存的6个月内其特异性以及灵敏性的变异系数均小于10%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性、重复性以及稳定性,并且适用于SS2、SS7、SS9以及SS12血清抗体的检测,有望为猪链球菌病的诊断和流行病学调查提供一种可靠的技术手段。
胡倩[4]（2019）在《9型猪链球菌突变株cbm缺失菌株的构建及Cbm的免疫致病性研究》文中指出猪链球菌能引起猪多种疾病,包括关节炎、脑膜炎和败血症等,在养猪业中能造成较大的经济损失。2型和9型是猪群中猪链球菌优势血清型之一,目前尚缺乏有效的疫苗预防猪链球菌病,对猪链球菌致病机理的研究是防控该病的基础之一。本实验室分离的9型猪链球菌DN13,在小鼠体内传了10代后,发现传代菌（SS9-P10）对小鼠的毒力显着增强。本实验室前期已对DN13进行全基因测定和对SS9-P10进行全基因组重测序。生物信息学分析显示,相较于亲本株DN13,含“EEPTTTTTT”重复序列和LPXTG基序的胶原结合蛋白Cbm,在SS9-P10中的非重复区域内发生了较多位点的突变。为研究9型猪链球菌中Cbm的作用,我们利用同源重组方法获得SS9-P10的cbm基因缺失菌株。实验结果发现cbm缺失菌株的生长速度及形态较SS9-P10没有发生明显变化,但是对小鼠的毒力降低。相较于亲本株SS9-P10,Cbm缺失后,小鼠死亡率减少了62.5%,而将cbm基因互补至缺失菌株后,细菌毒力又得到了恢复,但小鼠死亡率为75%,低于细菌缺失cbm前100%的死亡率,表明cbm是猪链球菌毒力相关基因之一,可能参与猪链球菌对宿主的致病。为进一步研究Cbm的致病作用,我们分别表达了不含EEPTTTTTT重复序列和含该重复序列的Cbm蛋白,纯化的两种Cbm蛋白添加氢氧化铝佐剂分别免疫小鼠3次后攻毒,结果显示免疫了无/有重复序列的蛋白的小鼠的死亡率（75%、100%）都显着高于对照组（25%）,提示Cbm诱导产生的抗体增强了细菌感染,抗Cbm抗体可能有利于猪链球菌逃避宿主免疫机制。
张焱焱[5]（2019）在《猪肺炎支原体ES-2株的特性研究及猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究》文中研究表明猪呼吸道疾病是制约世界各地集约化养猪业快速发展的重要疾病之一。其中猪肺炎支原体是引起各国养殖业中猪的地方流行性呼吸道疾病气喘病的主要病原,气喘病作为一种发病率高和致死率低的慢性呼吸道疾病,主要引起猪慢性干咳、生长缓慢和对饲料利用率降低。自上个世纪三十年代该病首次被德国科学家报道以来,猪气喘病已经给世界各地养猪业造成严重的经济损失。在实际生产中,感染猪肺炎支原体的猪更容易继发感染细菌性病原,从而给养猪业造成更大的经济损失。猪链球菌2型是一种危害极大的人兽共患病病原体,能够感染人和猪,引起肺炎和脑膜炎。在当前养猪业中,猪链球菌2型经常继发感染患有支原体肺炎的保育猪肺组织,在猪链球菌2型与猪肺炎支原体的混合感染下,使保育猪的呼吸道疾病变得复杂多变,荚膜多糖在猪链球菌2型的致病过程中扮演重要角色,其中荚膜多糖的合成需要多个基因共同参与。本研究针对猪的复杂呼吸道疾病等科学问题,开展了对猪肺炎支原体的分离和培养工作;通过第三代测序技术完成了对新分离株的全基因组测序和组装,通过比较基因组学挖掘了其特有致病相关因子及致病性猪肺炎支原体的共有基因;通过动物实验评估了新分离野生株作为疫苗对猪的免疫保护效果。针对被预测参与荚膜多糖重复糖单元合成的4个基因（cps2E、cps2G、cps2J和cps2L）,通过基因缺失及生物学特性研究,确定了其在猪链球菌2型荚膜多糖合成中的作用。主要研究结果如下:1.猪肺炎支原体ES-2株的分离培养及致病性研究本研究采用了一种多点取样连续传代的方法,并通过使用Friis培养基成功从湖北恩施黑猪肺组织中分离出猪肺炎支原体,并将其命名为猪肺炎支原体ES-2株。ES-2株在改良Friis培养基中培养至48h左右,其生长滴度最高可达到1×1010CCU/mL,在固体平板上呈“煎蛋样”形态。ES-2细胞呈圆形或卵圆形,其直径在0.2-1.6μm之间,对卡那霉素（MIC=2μg/mL）最敏感。动物实验结果显示,猪肺炎支原体ES-2株对宿主具有高致病性,引起猪肺部出现典型的支原体肺炎“肉变”,支气管上皮细胞的纤毛分叉、变短甚至脱落等病变。在通过气管感染不同剂量猪肺炎支原体ES-2株（7×106 CCU、7×107 CCU、7×108 CCU和7×109 CCU）的感染组中,其中攻毒剂量为7×107 CCU的感染组发病率最高且病变最严重。2.猪肺炎支原体ES-2株的全基因组特征及比较基因组学分析本研究通过第三代测序PacBio方法完成对ES-2株全基因组的测序与组装,通过起始位点校正绘制了ES-2株基因组完成图,利用生物信息学工具预测基因组的ORFs,并进一步利用蛋白质数据库NCBI NR和UNIPORT对ORFs进行注释,利用COG数据库对注释的蛋白进行分类,通过与VFDB数据库比对挖掘其毒力因子。通过将ES-2株全基因组与从NCBI收集的161株分离自不同宿主的支原体全基因组做进化树分析,亲缘关系显示ES-2株与已报道的另外8株猪肺炎支原体、1株猪絮状支原体和2株牛差异霉形体位于同一个分支,同猪鼻支原体的亲缘关系较近,与人肺炎支原体的亲缘关系最远。为了挖掘出致病性猪肺炎支原体的共有基因,本研究利用BlASTP比较了致病性（ES-2、168、7422和7448）和非致病性（J）猪肺炎支原体的全基因组,通过设置不同的相似度（0.75、0.80、0.85、0.90、0.95和0.99）,初步筛选出34个致病性猪肺炎支原体的共有基因。通过进一步比对分析,最终在氨基酸和核苷酸水平上,只鉴别出一个致病性猪肺炎支原体的共有基因（ES-200484）。3.猪肺炎支原体ES-2株对猪的免疫保护效果研究本研究基于猪肺炎支原体ES-2株具有生长滴度高且生长速度快的优点,将其制备成猪肺炎支原体ES-2株灭活疫苗,通过给仔猪免疫接种不同剂量的猪肺炎支原体ES-2株灭活疫苗来评估该灭活疫苗的最佳免疫保护剂量。免疫保护结果显示1.6×109 CCU/头份的ES-2株免疫剂量对猪的免疫保护效果最佳,1.6×107CCU/头份和1.6×108 CCU/头份的ES-2株免疫剂量能达到与商业猪肺炎支原体灭活疫苗（1.6×108 CCU/头份）对猪同等的免疫保护效果。4.猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究本研究通过同源重组方法成功将4个基因（cps2E、cps2G、cps2J和cps2L）分别从猪链球菌2型中缺失,构建了4个荚膜多糖单基因缺失株（Δcps2E、Δcps2G、Δcps2J和Δcps2L）。实验结果显示,由于基因cps2E、cps2G、cps2J或cps2L的缺失,导致猪链球菌2型表面的荚膜多糖严重缺失,而且荚膜多糖中的唾液酸含量显着下降。体外和体内实验结果显示,荚膜多糖缺失突变株Δcps2E、Δcps2G、Δcps2J或Δcps2L与宿主的相互作用发生明显变化,对小鼠动物模型的致病能力显着下降。总之,本研究证实了基因cps2E、cps2G、cps2J和cps2L参与了猪链球菌2型细胞表面荚膜多糖的合成,并且进一步的研究表明这些基因在猪链球菌2型对宿主的入侵及定殖过程中发挥重要作用。
李权[6]（2018）在《猪链球菌2型宿主蛋白结合蛋白的筛选及功能分析》文中研究指明猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是一类重要的人畜共患病原菌,是猪链球菌病的主要病原。它能够导致多种疾病包括脑膜炎、关节炎和败血症等,不仅给养猪生产业造成巨大的经济损失,也给相关从业人员的健康造成了巨大的威胁。依据其表面荚膜多糖（CPS）的差异,猪链球菌通常可分为35种不同的血清型（即1-34型和1/2型）,其中猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS2）是临床分离率最高和致病力最强的血清型,已在世界范围内引起了较大关注。到目前为止,国内外相继报道了 100多个与猪链球菌致病性相关的毒力蛋白,其中至少有37个被报道为关键的毒力因子。遗憾的是猪链球菌病的致病机理仍然不是很清楚。病原菌进入机体后,其表面蛋白可以与宿主细胞外基质发生相互作用进而黏附到宿主细胞表面,也可以与宿主免疫系统相互作用伪装成宿主组分逃避补体系统介导的吞噬杀伤。本研究中,我们利用二维电泳和免疫印迹（Far-Western blot）相结合的方法来大规模筛选SS2表面的宿主蛋白结合蛋白,包括细胞外基质蛋白（包括层粘蛋白和纤连蛋白）结合蛋白和H因子结合蛋白。然后对新鉴定到的蛋白进行结合特异性分析和基础生物学功能研究,为后续研究猪链球菌的致病机制提供理论依据。随后选取一些感兴趣且与猪链球菌毒力密切相关的宿主蛋白结合蛋白对其进行基因敲除,研究它们在猪链球菌致病过程中的作用,通过对这些蛋白的生物学功能解析,为猪链球菌的致病机制提供一些新观点。1猪链球菌2型LN和FN结合蛋白的筛选及功能分析细菌表面蛋白常常可以和细胞外基质蛋白（包括层粘蛋白和纤连蛋白）发生相互作用,它们在细菌侵袭和感染宿主细胞过程中发挥着重要作用。本研究中我们利用二维电泳和免疫印迹相结合的方法来筛选SS2表面的层粘蛋白（laminin,LN）结合蛋白和纤连蛋白（fibronectin,FN）结合蛋白。利用这种方法,共鉴定到15种潜在的LN结合蛋白和5种潜在的FN结合蛋白。选择新鉴定到的9种蛋白进行克隆表达,然后用ELISA和免疫印迹两种方法确定它们的结合特异性。结果显示OppA、EF-Tu、enolase、LDH和FBA同时具有LN和FN结合特性,随后制备了其中7种蛋白的兔多克隆抗体,并通过间接免疫荧光试验证实这7种蛋白都可以和HEp-2细胞发生黏附作用。此外,我们还检测了这7种重组蛋白和其对应抗体在细菌黏附过程中的贡献大小。结果发现其中4种蛋白在蛋白抑制和抗体抑制试验中均起到关键作用,表明这4种蛋白在SS2黏附到宿主细胞过程中发挥着关键作用。总的来说,我们鉴定到4种猪链球菌黏附素并证明二维电泳和免疫印迹相结合的方法是一个有价值的研究细菌与宿主相互作用的工具。2猪链球菌2型H因子结合蛋白的筛选及功能分析H因子（Factor H,FH）属于补体系统中的一个负调节因子,SS2表面的FH结合蛋白（FHBPs）可以特异性的结合FH,抑制补体替代途径C3b的活化,进而帮助SS2逃避由补体介导的先天免疫防御系统。本研究的目的是筛选新的FHBPs并探索它们在猪链球菌致病中的生物学功能。我们利用二维电泳和免疫印迹相结合的方法从SS2细胞壁蛋白中筛选到14种潜在的FHBPs,它们全部为首次报道。选择新鉴定到的8种蛋白进行克隆表达,并验证了它们与FH的结合特异性。结果表明SS2与FHBPs对应的抗体孵育后可以降低其与FH的结合能力,并首次发现SS2可以特异性结合鼠的FH。同时,FH也在SS2黏附和侵袭HEp-2细胞的过程中发挥着重要作用。另外,SS2孵育FH后可以增加小鼠血液和脑组织中的细菌载量。这项研究表明SS2结合FH后促进其对宿主细胞的黏附和侵袭能力,有助于抵抗宿主杀伤作用,增强致病力。3 MRP高变区在猪链球菌2型致病过程中的作用Muramidase-released protein（MRP）是SS2重要的毒力标志物且在SS2中广泛分布,但MRP的生物学功能还不是很清楚。分析发现,MRP在强毒菌株中高度保守,在弱毒株中同样也高度同源,但将强弱毒株一起比对后发现MRP在N端存在一段高变区（MRP-D1,a.a.242-596）,在 C 端存在一段保守区（MRP-D2,a.a.848-1222）。我们推测SS2中MRP的高变区很可能与毒力密切相关。于是选取强毒株ZY05719和弱毒株SS26035作为模式菌株对MRP的生物学功能进行探索。通过经典同源重组方法分别敲除MRP的高变区、保守区和全长序列,结果发现强毒株中高变区MRP-D1在SS2黏附过程中发挥着决定性作用,强毒株的高变区比弱毒株高变区（MRP-D1*）结合宿主蛋白的能力更强,同时保守区MRP-D2不能够与宿主蛋白发生相互作用。证实强毒株的高变区MRP-D1是与宿主蛋白互作的重要功能域。细胞内存活试验、猪全血存活试验和小鼠动物模型均表明MRP-D1在SS2致病过程中发挥着重要作用。同时,动物保护试验证明MRP-D1对小鼠有一定的保护作用,可以作为重要的候选亚单位疫苗。以上试验表明,虽然mrp基因不能作为快速鉴定SS2毒力菌株的唯一标志,但mrp基因的高变区mrp-d1参与了 SS2的致病过程,能有效辨别SS2的致病性,为快速鉴定SS2菌株毒力提供依据。4 FBPS不是猪链球菌2型ZY05719的关键毒力因子Fibronectin-/fibrinogen-binding protein（FBPS）是 SS2 非典型的无锚微生物表面成分识别黏附基质分子（MSCRAMM）,其在猪链球菌感染过程中的作用还不是很清楚。通过比较SS2强毒株ZY05719和缺失株△fbps的生物学特性,发现fbps的缺失对SS2的生长状态和细胞形态均没有显着影响。本文研究发现FBPS除了可以特异性结合FN、FH和纤维蛋白原（fibrinogen,FG）外,还可以与LN和免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）发生相互作用。同时,FBPS在SS2黏附HEp-2细胞的过程中发挥重要作用。体外试验揭示将fbps失活后,SS2在巨噬细胞和猪全血中的存活能力和对宿主细胞的侵袭能力都没有显着变化。另外,小鼠模型和斑马鱼模型均表明敲除fbps对SS2的毒力没有显着影响。动物保护试验证明FBPS对小鼠没有明显的保护作用。这些结果显示FBPS不是猪链球菌2型ZY05719的关键毒力因子,提示前期研究发现的一些毒力相关蛋白并不一定是真正的毒力因子。5 PnuC在猪链球菌2型氧化应激和致病中的功能研究我们前期研究发现,PnuC特异性的存在于SS2强毒菌株中,是一个潜在的毒力相关蛋白。为了进一步验证PnuC的生物学功能,我们构建了以SS2强毒株ZY05719为亲本株的突变株△pnuC。通过比较ZY05719和△pnuC,发现敲除pnuC后SS2在摇动条件下生长变慢,但在静止条件下没有显着差异,另外△pnuC对H202的敏感性增加,这些结果暗示PnuC参与氧化应激耐受。斑马鱼感染模型证实pnuC+菌株的毒力水平明显强于pnuC-菌株的毒力水平。小鼠感染模型进一步确认敲除pnuC后SS2对小鼠组织器官的定植能力显着降低,脑组织病理学切片显示敲除pnuC后脑膜炎症状消失。另外,小鼠模型和斑马鱼模型均表明敲除pnuC后SS2的毒力显着下降。这些结果证实毒力相关蛋白PnuC在SS2感染过程中参与了氧化应激耐受和致病过程。
彭婕[7]（2018）在《PurC影响马链球菌兽疫亚种致脑膜炎的作用机制》文中进行了进一步梳理马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ）属兰氏分群的C群β溶血链球菌,可引起败血症,关节炎,心内膜炎和脑膜炎。其宿主谱较广,可感染猪、马、犬、猫等多种与人类关系密切的动物。在我国,SEZ是造成猪链球菌病的重要猪源病原体,是引起猪细菌性脑膜炎的主要病原之一。同时,全球范围内已有大量人类感染SEZ引起脑膜炎的病例报道,大多数感染与密切接触患病动物或食用被污染的食物有关,严重时可导致死亡。因此,SEZ人畜共感染和致脑膜炎的特性已对人类健康构成巨大威胁。本文对PurC影响马链球菌兽疫亚种ATCC35246株致脑膜炎相关机制进行了研究。并且筛选了其他可能破坏血脑屏障的SEZ分泌蛋白。以上研究结果为进一步阐明SEZ引起脑膜炎的机制提供理论依据。1、马链球菌兽疫亚种PurC与HEK 293T细胞互作蛋白的筛选PurC（磷酰基氨基咪唑-琥珀酰基酰胺合成酶,SAICAR合成酶）为参与嘌呤生物合成途径第七步的催化酶。课题组前期对SEZ ATCC35246强毒株的全基因组进行比较基因组学分析,在其II号毒力岛中发现了 SEZ ATCC35246特有的purC基因。本研究通过 SILAC（stable isotope labeling by amino acids in cell culture）及 LC-MS/MS 筛选HEK 293T细胞中可能与PurC有相互作用的蛋白。首先通过SILAC标记获得Arg13C6,Lys13C6 标记的重标 HEK 293T 细胞和 Arg12C6,Lys12C6 标记的轻标 HEK 293T细胞,随后构建SEZ PurC真核表达载体purC-pAcGFP并转染重标HEK 293T细胞,同时用空载pAcGFP质粒转染轻标HEK 293T细胞,两组细胞总蛋白经1:1等量混合后,Co-IP（co-immunoprecipitation）富集结合蛋白。两次重复共检测到差异蛋白19个。经 Co-IP 及 western blot 进一步验证确定 PurC 与 Ezrin、CIP4、Elmod2 互作。2、PurC通过调节脑内皮细胞Moesin磷酸化破坏血脑屏障脑膜炎是SEZ感染的人和动物的主要症状。SEZ必须突破血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）并且逃避宿主免疫防御感染脑组织引起脑膜炎。本研究证明PurC为一种SEZ分泌的毒力因子,它可以进入人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells,hBMEC）,并影响细胞骨架。前期筛选结果表明,Ezrin可能与PurC存在互作。Ezrin属于ERM蛋白家族,该家族蛋白具有组织表达差异性,在内皮细胞中主要表达形式为Moesin,因此我们通过Co-IP及SPR（surface plasmon resonance）证明Moesin与PurC互作。并进一步确认PurC的Ficdomain与Moesin的C-ERMAD结合。Moesin在非活化状态下,C-ERMAD结构域与N-端FERM结构域紧密结合。当C-ERMAD的Thr558被磷酸化时,FERM从C-ERMAD解离,使Moesin转变为活化态的p-Moesin。结果表明,PurC与活化态Moesin具有更高的结合能力,并且可以维持细胞中Moesin的磷酸化水平。p-Moesin通过N-末端结构域（FERM）与跨膜蛋白结合,C-末端结构域（C-ERMAD）与肌动蛋白（F-actin）骨架结合来调节细胞骨架结构。除了作为与细胞粘附分子相互作用的膜-细胞骨架连接分子之外,Moesin还调节鸟苷三磷酸酶（Rho GTPase）家族活性,如RhoA。Dbl为直接负责RhoA激活的GEF因子。PurC处理后,细胞中Moesin磷酸化结合RhoEGF-Dbl导致RhoA活化。随后细胞内产生大量应力纤维,细胞骨架紊乱,最终破坏血脑屏障完整性。3、PurC影响中性粒细胞跨血脑屏障迁移的机制炎症是机体面对病原菌侵袭的一种防御性反应,但是过度的免疫反应可造成严重的炎性损伤。细菌性脑膜炎是中枢神经系统常见的感染。血液中细菌须穿透主要由脑微血管内皮细胞（BMECs）组成的血脑屏障（BBB）而进入中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）,细菌产生的毒素和机体免疫应答产生的炎症也会引起组织损伤,特别是中性粒细胞（polymorphonuclearneutrophil,PMNs）的过度炎症反应与CNS损伤密切相关。已知ERM蛋白在中性粒细胞迁移过程中扮演重要角色。本研究证明PurC能够与中性粒细胞Ezrin互作,并且使细胞中Ezrin Thr567磷酸化水平显着升高。磷酸化的Ezrin能够结合Dbl活化Rac1,引起细胞内F-actin聚集,使细胞产生尾足。同时,磷酸化的Ezrin能够将选择蛋白受体CD44和PSGL-1募集在细胞尾足部位,以促进其与内皮细胞表面选择蛋白结合,进而引起大量的中性粒细胞穿透血脑屏障。4、SEZ与mBMEC互作分泌蛋白的筛选SEZ会引起人和动物的脑膜炎。本研究发现SEZ的分泌蛋白对小鼠脑微血管内皮细胞（mBMEC）具有细胞毒性,并可能促进SEZ穿过血脑屏障（BBB）。运用SILAC标记获得Arg13C6,Lys13C6标记的重标SEZ和Arg12C6,Lys12C6标记的轻标SEZ。通过LC-MS/MS检测,筛选到与小鼠脑微血管内皮细胞（mBMECs）相互作用的SEZ分泌蛋白。质谱结果共鉴定出49种有效的肽,与可以匹配25种SEZ蛋白。生物信息学结果表明,大多数是细胞质蛋白,这些蛋白可能具有破坏宿主血脑屏障的潜在功能。其中一些蛋白在其他细菌中为已知的毒力因子,包括烯醇化酶。进一步试验证明,烯醇化酶为SEZ分泌蛋白,并且可以粘附于mBMEC。烯醇化酶可作为保护性抗原有效保护小鼠免于感染SEZ,并且其抗体显着降低了 SEZ培养上清对mBMECs的细胞毒性。
文德亮[8]（2016）在《浦东地区猪关节病重要病原体检测及其毒力基因分析》文中认为猪关节病通常指导致猪运动功能障碍的四肢活动性关节疾病,是在生物学环境和力学等因素的共同作用下,关节发生的功能和结构的一种退行性改变。病猪临床表现为一个或多个关节肿胀、疼痛、运动障碍,部分发病猪伴有发热等全身症状。研究表明,引起该病的病原主要为猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）和丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae E.rhusiopathiae,ER）等。该病导致仔猪生长性能降低、饲料转化率降低,种猪繁殖性能降低,不但影响猪场正常生产,而且增加了养殖成本,直接导致较高的死淘率,严重困扰着养猪业的发展。对浦东地区规模化养猪场的猪关节病发病原因进行调查,并以调查结果为主要依据进行权重分析,病原因素在仔猪和种猪关节病致病因素中的权重值分别为0.6140和0.4611,是引起猪关节病的主要因素。对仔猪关节病发病情况分析显示,104月份为关节病发病高峰,3060日龄仔猪发病率高。后备母猪和种猪关节病发病季节性不明显,其致病因素也更多元化。对猪关节病病原分离鉴定显示,引起本地区猪关节病的病原菌包括链球菌（Streptococcus）、丹毒丝菌、副猪嗜血杆菌和葡萄球菌（Staphylococcus）。为了同时检测引起猪关节病的猪链球菌2型（Streptococcus suis type2,S.suis 2）、HPS和丹毒丝菌,分别设计针对猪链球菌2型的Cps2J基因,副猪嗜血杆菌的16s rRNA基因和丹毒丝菌的16s rRNA基因,设计3对特异性引物,试验建立了同时检测以上三种病原的多重PCR方法,并对反应条件进行优化,对多重PCR方法的特异性和灵敏度进行了测试,采用该方法对采自猪关节病的病料进行检测,从72份猪关节液样品中检出2株S.suis 2、1株HPS和2株丹毒丝菌,检测结果与单个PCR结果一致,试验结果表明,建立的多重PCR方法敏感、特异、快速,可用于猪关节病重要病原体的检测。对从猪关节病病料分离到的2株S.suis 2进行毒力基因检测,结果显示毒力基因分布为gdh+/cps2J+/mrp+/epf+/sly+/orf2+/gapdh+,对毒力基因进行序列分析,Cps2J、MRP基因未检出变异,提示其高度保守,orf2、GDH、GAPDH基因存在碱基点突变,但突变对其编码的氨基酸种类无影响,与国内外参考菌株的同源性较高。对分离到的2株丹毒丝菌进行毒力基因检测,所检测毒力基因在2株菌内均有分布为Cps-A+/Cps-B+/Cps-C+/Rsp-A+/Rsp-B+/SpaA+,与近期从其它病料分离到的丹毒丝菌毒力基因分布相同,提示该毒力菌株可能在猪场广泛存在并条件性致病,其致病机理有待进一步研究。本研究完成了对浦东地区猪关节病病因和流行状况的分析,分离鉴定了主要病原菌,建立了针对猪关节病重要病原菌的多重PCR检测方法,对分离到的猪源链球菌和丹毒丝菌进行了毒力基因检测和分析,为猪关节病的综合防治积累了病原学资料。
于岩飞[9]（2016）在《猪链球菌2型蛋白的差异表达及翻译后修饰对其毒力的影响》文中研究表明猪链球菌（Streptococcusssuis, SS）是一种革兰氏阳性兼性厌氧球菌,根据其表面抗原荚膜多糖（CPS）的不同可分为33个血清型（1 -31,33及1/2）。猪链球菌2型（SS2）是世界范围内流行最广、致病性最强的血清型,不仅能引起猪的败血症、关节炎、脑膜炎、心内膜炎等多种疾病,还可以感染人,导致人的脑膜炎、败血症甚至死亡。然而,SS2的不同菌株毒力差异很大,而造成这种差异的物质基础—毒力因子,虽然对其开展的研究已经进行多年,但清晰的致病机理,以及不同毒力因子之间的相互关系尚不清楚。本论文针对SS2天然强弱毒株、人工致强致弱突变株以及体内分离和体外培养的菌株三种不同来源的样本,分别进行了比较蛋白组学及蛋白相互作用网络分析,研究差异表达蛋白对SS2毒力的影响。另外,利用修饰组学技术,首次对SS2蛋白质的翻译后修饰,琥珀酰化修饰及乙酰化修饰在SS2生命活动中的作用进行了初步的探索。1天然SS2强弱毒株的比较基因组学和比较蛋白组学分析SS2是一种重要的人畜共患病病原,但不同菌株之间存在毒力的差异。我们利用全基因组测序和同位素相对标记与绝对定量技术（isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ）,对四川大暴发的代表菌株,天然强毒株ZY05719和天然弱毒株T15进行了比较基因组学和比较蛋白组学分析。发现强毒株中特有的148个基因中有33个可以表达。结合操纵子预测、胞壁锚定基序（I/L）（P/A）XTG、酶活基序TL（L/V）TC等分析,发现这33个蛋白中存在分选酶（Sortase）系统。进一步分析发现ZY05719基因组中共含有5种Sortase C （ C类分选酶,催化菌毛合成）和一种Sortase A （ A类分选酶,修饰表面蛋白）。其中三种编码C类分选酶的基因仅存在于强毒基因组中,且属于同一个操纵子,并分别共用碱基,这三个C类分选酶的编码基因分别被命名为srtC1,srtC2和srtC3。在这三个C类分选酶的下游,紧邻的操纵子中,通过iTRAQ表达量的差异及C类分选酶催化的底物特征找到这三个C类分选酶可能作用的底物,命名为C123。另外两种C类分选酶,将其对应基因命名为srtC4和srtC5。iTRAQ结果证明两者在强毒株中的表达量要显着高于弱毒株。同时发现Sortase C4的疑似底物,位于同一操纵子的C4,其在强毒株中的表达量显着高于弱毒株。本章首次系统地鉴定了 SS2中仅存在的A类及C类分选酶系统,并分析了酶与底物的对应关系。后续分析发现,srtC1,srtC2,srtC3仅广泛存在于强毒株中,且敲除C类分选酶及其作用底物相关基因后,菌株毒力变弱,证明其参与SS2毒力的形成。2人工构建的强弱毒株的比较蛋白组学分析猪链球菌天然强弱毒株在基因组上存在较大的差异（如不同的SS2菌株中,基因组大小从2.0到2.24 Mb不等）,基因组的差异映射到蛋白组上会造成更多的差异,给后续分析带来困难。为了规避这个问题,我们以ZY05719为亲本株构建了一系列基因缺失株,经动物实验分析发现了毒力减弱的△pepT突变株和毒力增强的△rfeA突变株。这两株突变株的基因组背景高度一致,其蛋白表达水平的差异极有可能是导致毒力差异的主要原因之一。结合焚荧光差异双向电泳2D-DIGE （two dimension difference gel electrophoresis）及蛋白质非标记定量技术（label-free）等适合比较背景较一致的样本的蛋白质组学技术,以亲本株ZY05719为对照,分析了 ApepT和△rfeA分泌蛋白的变化,共鉴定出38个差异蛋白,其中32个在△pepT中的表达量出现差异,17个在△rfeA中的表达量出现差异,11个在两个菌株中都出现差异。差异蛋白共包括5个已知的毒力因子和33个新发现的毒力相关蛋白。为了研究这些新鉴定到的差异蛋白是否确实与毒力相关,基于String数据库和Cytoscape软件,我们首次构建出SS的毒力互作网络。发现新型的差异蛋白在由已知的毒力因子形成的网络中起到重要的桥梁作用。如新发现的EF-Tu等在毒力网络中作为重要的节点,很好地连接了新发现的差异蛋白和已知的毒力因子,更好地补充和完善了现有的毒力体系。其中一个新发现的差异蛋白SBP2,位于菌体表面,在毒力增强株中表达上调,并牵涉在毒力网络中。进一步分析发现sbp2仅广泛存在于SS2强毒株中。重组SBP2蛋白具有HEp-2细胞黏附性。Far-WB实验推测这种黏附作用部分依靠SBP2与宿主细胞外基质的重要成分纤连蛋白（fibronectin, FN）和层黏连蛋白（laminin, LN）的结合完成。3体内分离和体外培养的菌株的比较蛋白组学分析细菌在体外和体内条件下的生长状况是不同的,单纯对体外培养条件下的细菌进行研究并不能反映真实的细菌的生命状态。利用猪链球菌强毒株ZY05719对易感猪进行人工感染,并从感染猪的血液中分离体内感染增殖的细菌,将它与体外培养基培养的细菌进行比较蛋白组学分析,有利于认识细菌进入体内后为存活及引起感染蛋白表达量发生的变化。由于体内菌株含量较少,采用对蛋白量要求较低的iTRAQ进行比较分析。共鉴定出188个差异蛋白,其中89个蛋白在体内表达上调,99个下调。后续重点对这些差异蛋白进行操纵子、GO、KEGG通路和蛋白结构域等分类、聚类多方面生物信息学分析。发现体内上调表达的蛋白主要与氨基酸合成、糖代谢及结合活性等相关,下调的蛋白则与脂肪酸合成代谢相关。通过构建新发现的差异蛋白与已知的体内感染相关的毒力因子的互作网络,发现大量差异蛋白与已知的体内感染相关因子存在相互作用。其中最重要的上调蛋白,乙醇/乙醛脱氢酶,adhE（acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase）处于网络中重要的节点,不仅与细菌的厌氧呼吸有关,也通过与宿主细胞（Caco-2）的Hsp60蛋白的互作介导细菌对宿主的黏附。敲除相关基因后,菌株对Caco-2细胞的黏附显着下降。而通过使用抗体封闭下调通路中与脂肪酸合成代谢有关的蛋白fabG,可提高细菌在血液中的存活率。4 SS2全菌蛋白的乙酰化修饰及琥珀酰化修饰赖氨酸的酰化作用是一种重要的翻译后修饰作用（PTM）,包括乙酰化和琥珀酰化等,与多种细胞进程有关。不仅蛋白表达量的差异与细菌的毒力相关,蛋白的翻译后修饰也可能导致毒力的差异。有报道称琥珀酰化与布鲁菌的毒力有关,乙酰化与沙门菌的毒力相关。但在猪链球菌中,赖氨酸酰化作用的功能还未被报道,本论文对SS中的赖氨酸琥珀酰化和乙酰化这两种酰基化作用进行了第一次全面分析。结合亲和富集和高分辨率LC-MS/MS分析的方法,共鉴定出SS2强毒株的51个蛋白的76个琥珀酰化位点（占总蛋白的2.6%）及888个蛋白的2901处赖氨酸乙酰化修饰位点（占总蛋白的46.1%）。进一步的蛋白注释、功能分类、功能富集、基序分析、聚类分析等生物信息学分析发现这些发生修饰的蛋白参与各种细胞功能,尤其是在代谢、细胞进程,催化、结合活性,核糖体相关的进程中。两种修饰之间存在广泛的重叠作用。且发现多个已知的毒力因子同时发生两种修饰作用,如MRP, GAPDH,enolase,5’-nuclcotidase和八ABC transporter等。但两种修饰识别的基序不相同,且乙酰化修饰发挥作用的范围更广泛,也与转运、黏附、调控、信号转导等相关。这一系统的分析为进一步研究琥珀酰化和乙酰化在SS生理及致病机制中所起的作用,奠定了基础。
琚存祥[10]（2012）在《猪链球菌胞壁水解酶等的鉴定与功能分析》文中进行了进一步梳理猪链球菌（Streptococcus suis, SS）是一种重要的人畜共患病病原,可引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎等疾病,也可导致生猪从业人员感染和死亡。根据其荚膜抗原不同,猪链球菌有33个血清型（1-31,33,1/2型）。其中猪链球菌2型（SS2）流行最广,致病性最强,其致病机理目前仍然不甚清晰,且近年来,该菌耐药问题愈发严重,亟需研制新型抗菌药来应对。采用转座突变技术,构建SS2强毒株HA9801突变文库,以斑马鱼为模型筛选鉴定荚膜多糖合成相关基因Cps2F等4个SS2毒力相关基因。鉴定并分析猪链球菌自溶素Atl,通过比较基因组及酶谱法筛选到胞壁水解酶LytA,通过BALB/c小鼠体内试验,验证该蛋白治疗SS2感染的效果。1.SS2突变文库的构建及斑马鱼为模型筛选毒力相关基因构建转座子pSET4S-miniTn4001,利用随机转座技术获得SS2突变文库。采用斑马鱼为模型筛选该文库,以期获得毒力致弱株,从而鉴定SS2毒力相关基因。斑马鱼筛选500株SS2突变菌株,毒力下降最明显的4株用于鉴定转座位点。鉴定的转座位点进行缺失,比较缺失株与转座突变株对斑马鱼的LD50。鉴定出4个SS2毒力相关基因：荚膜多糖合成相关基因（Cps2F）、转录调节因子（tr66）、TetR家族调节蛋白（TetP）和假定的保守蛋白（chp）.这些基因的缺失造成SS2对斑马鱼LD50由5.28×104cfu/fish分别升至7.64×107cfu/fish,7.48×105cfu/fish,8.98×105cfu/fish和2.16×106cfu/fish。Cps2F与SS2荚膜多糖合成相关；TetP是调控蛋白,调节细菌转录及毒力因子表达；tr66与细菌糖代谢调节相关；chp为假定保守蛋白。斑马鱼筛选SS2突变文库得到的毒力相关基因,能加深对猪链球菌致病机理的认识并有助于SS2疫苗的研制。2.SS2自溶素Atl的鉴定与功能分析基因atl编码SS2的自溶素。Atl蛋白含1025个氨基酸,分子量为113kDa,分析结构发现含保守的“N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶”结构域。试验发现Atl具有溶解SS2细胞壁活性及纤维蛋白原结合能力。构建atl缺失株HA9801△atl分析Atl生物学功能。HA9801SDS提取物中有两条胞壁溶解蛋白条带,缺失atl造成它们的消失,证实两个水解蛋白皆由atl编码。缺失株与野毒株相比：细菌的链长显着延长,几乎丧失自溶活性,生物被膜的形成是野毒株的700%,对HEp-2细胞的粘附能力下降50%,对斑马鱼的LDso上升5倍。鉴于Atl具有溶解胞壁活性及纤维蛋白原结合能力及atl缺失对SS2的影响,推测Atl是HA9801的主要自溶素,它参与该菌的自溶,细菌的分裂,生物被膜形成,细胞粘附,并与HA9801的毒力相关。3.SS2胞壁水解酶LytA鉴定及其溶菌活性分析酶谱试验分析猪链球菌2型（SS2）强毒株HA9801及无毒株T15胞壁水解酶,发现T15独有的25KD胞壁水解酶,其活性明显强于其他胞壁水解酶。T15基因组测序,与强毒株比较,筛选差异基因。Blastn分析,一大小为720bps的ORF与化脓链球菌噬菌体相关胞壁水解酶存在同源性,命名为LytA.该基因仅在T15中存在,其他SS未见分布。酶谱证实原核表达的重组蛋白LytA存在溶胞壁活性,缺失LytA后T1525kDa处的溶解条带消失,证实LytA编码T1525kDa的胞壁水解酶。Western分析发现LytA具有免疫原性。体外溶菌试验,LytA在15min内将HA9801OD600值由1.0降至0.003,活菌数从5.0×108cfu/ml降至4.1×106cfu/ml。平板溶菌试验,重组蛋白LytA对检测的SS2菌株产生明显溶菌圈。LytA溶菌的高效性及迅速性,使其成为治疗SS2感染的新型抗菌制剂。4.胞壁水解酶LytA应用于SS2感染的治疗以BALB/c小鼠为模型,通过静脉注射疗法,评价胞壁水解酶LytA治疗SS2感染的效果。静脉注射2,000μg LytA,15min内血液细菌滴度的Log值由7.48降至6.07。4.5×108CFU HA9801感染后1h,静脉注射LytA BALB/c小鼠存活率为90%,PBS组全部死亡。为验证LytA对SS2败血症治疗效果,HA9801感染后5h、10h两次注射LytA,小鼠的存活率为50%,说明及时,多次注射LytA能够有效治疗SS2感染。该蛋白具有免疫原性,兔高免血清的体外试验证明抗体的产生只能部分阻断不能完全中和LytA溶菌活性,且抗体的产生对LytA体内杀菌效果影响不显着（p>0.05）。检测LytA溶菌谱发现,LytA能够有效裂解SS诸多血清型及其他革兰阳性及阴性菌,其中SS2最为敏感。胞壁水解酶LytA是非常高效的抗SS2制剂,有望成为应对SS2感染的新武器。
二、用单克隆抗体展示猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白在菌体表面的形态和分布（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用单克隆抗体展示猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白在菌体表面的形态和分布（论文提纲范文）
（1）原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 细菌经典遗传操作系统 |
| 1.2.1 转座酶系统 |
| 1.2.2 位点特异性重组系统 |
| 1.2.3 同源重组系统 |
| 1.3 基于新型基因编辑技术的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.3.1 基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.3.2 基于碱基编辑器的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.4 原核生物Ago(pAgo)蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 Ago蛋白概述 |
| 1.4.2 Ago蛋白介导RNA干扰 |
| 1.4.3 pAgo蛋白的DNA水解酶活性 |
| 1.4.4 pAgo蛋白在基因编辑中的应用 |
| 第二章 研究目的及意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 质粒、菌株及其培养条件 |
| 3.2 主要试剂耗材 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 培养基配制 |
| 3.5 主要试剂配制 |
| 3.5.1 主要缓冲液 |
| 3.5.2 蛋白表达及纯化试剂 |
| 3.5.3 SDS-PAGE及 Western Blot相关试剂 |
| 3.5.4 IP及 Chip实验试剂 |
| 3.6 引物设计及基因合成 |
| 3.7 NgAgo系统能否介导大肠杆菌靶基因缺失的研究 |
| 3.7.1 大肠杆菌aste基因敲除的相关质粒的构建 |
| 3.7.2 NgAgo能否介导大肠杆菌aste基因缺失的检测 |
| 3.8 NgAgo介导细菌基因敲除是否依赖g DNA靶向的DNA酶活性的研究 |
| 3.8.1 DNA酶活性位点突变的NgAgo相关质粒的构建 |
| 3.8.2 DNA酶活性位点突变的NgAgo能否介导GX-PM基因缺失的检测 |
| 3.8.3 T7E1 方法检测NgAgo蛋白的DNA酶活性 |
| 3.8.4 不引入外源g DNA时 NgAgo能否介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.8.5 NgAgo介导细菌靶基因敲除是否依赖提高同源重组效应的检测 |
| 3.9 NgAgo提高同源重组效率的机制研究 |
| 3.9.1 NgAgo蛋白两端融合Flag标签是否影响其介导基因缺失的检测 |
| 3.9.2 应用IP偶联质谱方法鉴定NgAgo在细菌中的互作蛋白 |
| 3.9.3 Co-IP检测NgAgo蛋白与细菌内源性recA的互作 |
| 3.9.4 Co-IP检测DNase I处理后NgAgo蛋白与recA的互作 |
| 3.9.5 重组蛋白recA及 NgAgo的原核表达质粒的构建 |
| 3.9.6 重组蛋白recA及 NgAgo的表达及纯化 |
| 3.9.7 重组蛋白NgAgo与 recA互作的检测 |
| 3.9.8 SPR方法检测重组蛋白NgAgo与 recA的互作亲和力 |
| 3.9.9 EMSA方法检测NgAgo蛋白能否增加recA蛋白与ss DNA的结合 |
| 3.9.10 NgAgo蛋白能否增强recA蛋白介导的DNA链交换能力的检测 |
| 3.9.11 Chip-q PCR方法检测NgAgo蛋白能否增加recA与细菌内同源靶序列的结合 |
| 3.10 NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域的相关研究 |
| 3.10.1 NgAgo蛋白的截短体能否介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.10.2 NgAgo不同截短体能否与recA互作的检测 |
| 3.10.3 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端能否介导细菌靶基因缺失的检测 |
| 3.10.4 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端与recA互作的检测 |
| 3.10.5 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端能否增强recA介导的同源重组效率的检测 |
| 3.10.6 NgAgo蛋白MID及 PIWI结构域介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.10.7 NgAgo蛋白MID及 PIWI结构域与recA互作的检测 |
| 3.11 不同原核生物Ago蛋白能否介导细菌基因组编辑的相关研究 |
| 3.11.1 不同pAgo蛋白介导GX-PM靶基因缺失相关质粒的构建 |
| 3.11.2 不同pAgo蛋白能否介导GX-PM菌株靶基因缺失的检测 |
| 3.11.3 不同pAgo蛋白能否与细菌recA互作的检测 |
| 3.11.4 DNA酶活性位点突变的pAgo蛋白相关质粒的构建 |
| 3.11.5 DNA酶活性位点突变的pAgo能否介导细菌基因缺失的检测 |
| 3.11.6 DNA酶活性位点突变的pAgo与细菌recA互作的检测 |
| 3.12 数据统计分析 |
| 第四章 结果与分析 |
| 4.1 NgAgo介导不同细菌靶基因的敲除 |
| 4.1.1 敲除大肠杆菌aste基因的相关质粒的构建 |
| 4.1.2 NgAgo介导大肠杆菌aste基因的缺失 |
| 4.2 NgAgo介导细菌基因缺失不依赖自身DNA酶活性及外源g DNA |
| 4.2.1 NgAgo蛋白的DNA酶活性位点突变质粒的构建 |
| 4.2.2 NgAgo介导细菌靶基因缺失不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.2.3 NgAgo介导细菌靶基因缺失不依赖外源g DNA |
| 4.2.4 NgAgo介导细菌靶基因敲除依赖于提高同源重组效应 |
| 4.3 NgAgo增强recA介导的同源重组效率 |
| 4.3.1 NgAgo蛋白两端融合Flag标签不影响其介导细菌靶基因缺失 |
| 4.3.2 细菌中NgAgo互作蛋白的鉴定分析 |
| 4.3.3 NgAgo蛋白与细菌内源性recA互作 |
| 4.3.4 NgAgo蛋白与内源性recA蛋白互作不受DNase I的影响 |
| 4.3.5 重组蛋白recA及 NgAgo表达质粒的构建 |
| 4.3.6 重组蛋白recA及 NgAgo的纯化 |
| 4.3.7 重组蛋白NgAgo与 recA直接互作 |
| 4.3.8 重组蛋白NgAgo与 ErecA互作亲和力的分析 |
| 4.3.9 重组蛋白NgAgo与 PmrecA互作亲和力的分析 |
| 4.3.10 NgAgo蛋白并不能显着增加recA蛋白与ss DNA的结合 |
| 4.3.11 NgAgo蛋白能显着增强recA蛋白介导的DNA链交换能力 |
| 4.3.12 NgAgo蛋白能显着增加recA与细菌内同源靶序列的结合 |
| 4.4 NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域的鉴定 |
| 4.4.1 C端是NgAgo介导细菌基因缺失的主要区域 |
| 4.4.2 NgAgo蛋白C端介导不同细菌基因缺失不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.4.3 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端同样显着增强recA介导的同源重组效应 |
| 4.4.4 PIWI结构域是NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域 |
| 4.5 原核生物Ago蛋白均能介导细菌基因组编辑且不依赖DNA酶活性 |
| 4.5.1 不同pAgo蛋白介导细菌基因缺失相关质粒的构建 |
| 4.5.2 不同pAgo蛋白介导细菌靶基因的缺失 |
| 4.5.3 不同pAgo蛋白与细菌recA互作 |
| 4.5.4 不同pAgo蛋白的DNA酶活性位点突变质粒的构建 |
| 4.5.5 不同pAgo介导细菌基因组编辑不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.5.6 DNA酶活性位点突变的Tt Ago蛋白与细菌recA互作 |
| 4.5.7 DNA酶活性位点突变的Aa Ago蛋白与细菌recA互作 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 pAgo介导细菌基因组编辑的机制 |
| 5.2 pAgo作为细菌遗传操作工具的优势 |
| 5.3 pAgo蛋白应用前景的展望 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 附录四 |
| 个人资料 |
| 致谢 |
（2）猪链球菌与ⅡA型磷脂酶A2相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 立题依据 |
| 2 国内外研究现状 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 第一章 磷脂酶A2对猪链球菌的杀菌作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 PLA_2G2A对不同细菌的杀伤作用 |
| 1.3.2 PLA_2G2A对不同血清型猪链球菌的杀伤作用 |
| 1.3.3 透射电镜观察结果分析 |
| 1.3.4 PLA_2G2A作用后猪链球菌表面电势改变 |
| 1.3.5 PLA_2G2A依靠磷脂酶活性发挥杀菌活性 |
| 1.3.6 二价金属阳离子在PLA_2G2A发挥杀菌活性中的作用 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 猪链球菌荚膜对磷脂酶A2杀菌作用的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 成功构建猪链球菌CPS基因簇缺失突变株ΔCPS |
| 2.3.2 PLA_2G2A作用下荚膜对猪链球菌存活的影响 |
| 2.3.3 荚膜和PLA_2G2A对猪链球菌血中存活的影响 |
| 2.3.4 攻毒实验证明荚膜缺失猪链球菌毒力降低 |
| 2.3.5 荚膜对猪链球菌与PLA_2G2A亲和力的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 猪链球菌对宿主磷脂酶A2表达的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 猪链球菌对人脑微血管内皮细胞不同型磷脂酶A2表达的影响 |
| 3.3.2 猪链球菌对不同细胞系PLA_2G2A表达的影响 |
| 3.3.3 C3H/HeN小鼠血清中PLA_2G2A |
| 3.3.4 猪链球菌对豚鼠肺泡巨噬细胞PLA_2G2A表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）基于Mrp的猪链球菌病间接ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪链球菌概述 |
| 1.1.1 猪链球菌病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.1.4 临床症状和病理变化 |
| 1.1.5 猪链球菌病的诊断 |
| 1.1.6 猪链球菌病ELISA检测方法的研究进展 |
| 1.1.7 目的及意义 |
| 第二章 重组Mrp蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、血清和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 主要溶液及配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SS2基因组的提取以及mrp基因的克隆 |
| 2.2.2 pET28a-mrp重组质粒的构建 |
| 2.2.3 mrp基因的原核表达 |
| 2.2.4 重组Mrp蛋白的纯化 |
| 2.2.5 重组Mrp蛋白反应原性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 mrp基因的克隆 |
| 2.3.2 pET28a-mrp重组表达质粒的鉴定 |
| 2.3.3 Mrp的原核表达和纯化 |
| 2.3.4 重组Mrp蛋白反应原性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 rMrp-ELISA方法的建立及性能评估 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株及血清 |
| 3.1.2 试剂及耗材 |
| 3.1.3 仪器及设备 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 rMrp-ELISA条件优化及最佳反应条件的确定 |
| 3.2.2 临界值的确定 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 敏感性及灵敏性试验 |
| 3.2.5 重复性试验 |
| 3.2.6 符合率试验 |
| 3.2.7 临床样品检测 |
| 3.2.8 保存期试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的确定 |
| 3.3.2 最佳封闭液的确定 |
| 3.3.3 最佳封闭条件的确定 |
| 3.3.4 血清最佳作用时间的确定 |
| 3.3.5 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 |
| 3.3.6 酶标二抗最佳作用时间的确定 |
| 3.3.7 底物最佳显色时间的确定 |
| 3.3.8 临界值的确定 |
| 3.3.9 特异性试验结果 |
| 3.3.10 敏感性及灵敏性试验结果 |
| 3.3.11 重复性试验结果 |
| 3.3.12 符合率试验结果 |
| 3.3.13 临床样品检测结果 |
| 3.3.14 保存期试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）9型猪链球菌突变株cbm缺失菌株的构建及Cbm的免疫致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 猪链球菌病原学特征 |
| 1.2 猪链球菌流行病学 |
| 1.3 猪链球菌致病机理 |
| 1.4 猪链球菌毒力相关因子 |
| 1.5 细菌的LPXTG基序 |
| 1.5.1 细菌锚定基序LPXTG概述 |
| 1.5.2 细菌的LPXTG基序胶原结合蛋白 |
| 1.5.3 细菌的LPXTG基序与保护性抗原 |
| 1.6 抗体依赖性感染增强作用 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第二章 9型猪链球菌突变株cbm缺失株的构建及生物特性比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 敲除质粒 pSET6s-ΔCbm的构建 |
| 2.2.2 电转化阳性菌株的传代 |
| 2.2.3 cbm基因缺失株的筛选 |
| 2.2.4 cbm基因缺失互补菌株的构建 |
| 2.2.5 基因缺失株与互补菌株的生物学及毒力比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 9型猪链球菌Cbm蛋白的克隆表达及免疫致病性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 cbm基因重组表达质粒的构建 |
| 3.2.2 Cbm重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.3 Cbm蛋白的免疫致病性试验 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）猪肺炎支原体ES-2株的特性研究及猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪肺炎支原体研究进展 |
| 1.2 猪肺炎支原体的病原学研究 |
| 1.3 猪肺炎支原体的致病机制 |
| 1.3.1 猪肺炎支原体在呼吸道的增殖 |
| 1.3.2 猪肺炎支原体与宿主的相互作用 |
| 1.3.3 猪肺炎支原体引起的临床症状和肺部病变 |
| 1.4 猪肺炎支原体的流行病学调查 |
| 1.5 预防和治疗猪肺炎支原体的感染 |
| 1.5.1 疫苗预防 |
| 1.5.2 抗生素治疗 |
| 1.6 猪肺炎支原体的诊断方法 |
| 1.7 猪肺炎支原体菌株的多样性 |
| 1.8 小结与展望 |
| 第二章 M.hyopneumoniae ES-2 株的分离培养及致病性研究 |
| 2.1 研究的目的与意义 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株来源 |
| 2.2.2 病料的来源 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.2.4 主要试剂及试剂盒 |
| 2.2.5 培养基及抗生素溶液的配制 |
| 2.2.6 主要溶液及其配制 |
| 2.2.7 主要实验器材 |
| 2.2.8 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 猪肺炎支原体的分离方法(多点采样,分别培养) |
| 2.3.2 最佳离心力的选择 |
| 2.3.3 猪肺炎支原体全基因组提取操作步骤 |
| 2.3.4 PCR产物的回收与纯化 |
| 2.3.5 猪肺炎支原体的保存和复苏 |
| 2.3.6 颜色变化单位(Colour Change Unit,CCU)的测定 |
| 2.3.7 最小抑菌浓度(MIC) |
| 2.3.8 猪肺炎支原体ES-2 株的CCU与培养基pH的关系 |
| 2.3.9 猪肺炎支原体ES-2 株在不同培养基中的生长情况 |
| 2.3.10 观察猪肺炎支原体ES-2 株形态及测量其直径 |
| 2.3.11 猪肺炎支原体ES-2 株菌落形态 |
| 2.3.12 ELISA操作步骤 |
| 2.3.13 猪肺炎支原体ES-2 株的毒力评估实验 |
| 2.3.14 攻毒后观察临床信号 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 临床样品的选择及处理方法 |
| 2.4.2 M.hyopneumoniae ES-2 株的分离和鉴定 |
| 2.4.3 M.hyopneumoniae ES-2 株的形态特征 |
| 2.4.4 选择M.hyopneumoniae ES-2 株生长的最佳培养基 |
| 2.4.5 不同转接量对M.hyopneumoniae ES-2 株生长的影响 |
| 2.4.6 M.hyopneumoniae ES-2 株的生长特性与pH的对应关系 |
| 2.4.7 通过时间、pH及颜色变化定量液体培养基中的M.hyopneumoniae ES-2 |
| 2.4.8 临床常用药物对M.hyopneumoniaeES-2 株的最小抑菌浓度(MIC) |
| 2.4.9 M.hyopneumoniae ES-2 株在固体培养基上的生长特征 |
| 2.4.10 M.hyopneumoniae ES-2 株对猪致病性的研究 |
| 2.4.11 不同感染剂量M.hyopneumoniaeES-2 株在猪肺组织中的定殖能力 |
| 2.4.12 7×10~7CCU的 M.hyopneumoniae ES-2 感染剂量可引起最严重的猪支原体肺炎 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 猪肺炎支原体的分离方法 |
| 2.5.2 最小抑菌浓度(MIC) |
| 2.5.3 猪肺炎支原体ES-2 株在改良Friis培养基中具有生长速度快且生长滴度高等优点 |
| 2.5.4 猪肺炎支原体ES-2 株是一株高致病性菌株 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 M.hyopneumoniae ES-2 株的全基因组测序及致病性相关因子的挖掘 |
| 3.1 研究的目的与意义 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株来源 |
| 3.2.2 主要实验用试剂 |
| 3.2.3 主要实验器材 |
| 3.2.4 猪肺炎支原体培养基的配制 |
| 3.2.5 主要溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 猪肺炎支原体ES-2 株基因组的大量提取方法 |
| 3.3.2 猪肺炎支原体ES-2 株全基因组测序 |
| 3.3.3 猪肺炎支原体ES-2 株基因组序列组装 |
| 3.3.4 猪肺炎支原体ES-2 株基因组的注释分析 |
| 3.3.5 猪肺炎支原体ES-2 株毒力相关基因比较分析 |
| 3.3.6 猪肺炎支原体基因组共线性(结构变异)分析 |
| 3.3.7 分离自不同宿主体内的162 株支原体全基因组进化树分析 |
| 3.3.8 致病性猪肺炎支原体特有基因的筛选 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 M.hyopneumoniae ES-2 株全基因组的提取 |
| 3.4.2 M.hyopneumoniae ES-2 株全基因组的测序与组装 |
| 3.4.3 比较ES-2 株与已报道9株M.hyopneumoniae基因组的基本特征 |
| 3.4.4 M.hyopneumoniae全基因组相似性分析 |
| 3.4.5 通过与VFDB毒力因子数据库比较,挖掘M.hyopneumoniaeES-2株中的毒力因子 |
| 3.4.6 对不同宿主来源支原体全基因组的进化分析 |
| 3.4.7 通过比较基因组学挖掘致病性M.hyopneumoniae的特有基因 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 M.hyopneumoniae ES-2 株全基因组的基本特征 |
| 3.5.2 猪肺炎支原体的全基因组的共线性分析及对ES-2 株毒力因子的挖掘 |
| 3.5.3 支原体的遗传进化分析及挖掘致病性猪肺炎支原体的共有基因 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 M.hyopneumoniae ES-2 株灭活疫苗免疫保护效果的评价 |
| 4.1 研究的目的与意义 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验用菌株 |
| 4.2.2 实验用猪肺炎支原体疫苗 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.2.4 主要试剂及试剂盒 |
| 4.2.5 培养基及抗生素溶液的配制 |
| 4.2.6 主要溶液及其配制 |
| 4.2.7 实验用器材 |
| 4.2.8 引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 评估M.hyopneumoniaeES-2 株灭活疫苗对猪的免疫保护实验方案 |
| 4.3.2 M.hyopneumoniae ES-2 株灭活疫苗的制备 |
| 4.3.3 猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫接种及攻毒实验 |
| 4.3.4 猪肺组织病变评分方法 |
| 4.3.5 猪肺炎支原体血清的收集方法 |
| 4.3.6 检测免疫后猪体内抗体水平 |
| 4.3.7 HE染色及对猪肺组织气管或支气管上皮细胞纤毛观察 |
| 4.3.8 测定攻毒后猪血清及猪肺组织气管或支气管灌洗液中的抗体水平 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 攻毒前,免疫接种M.hyopneumoniaeES-2 株灭活疫苗的实验动物体内抗体水平 |
| 4.4.2 感染M.hyopneumoniae ES-2 株免疫组中实验动物体温变化 |
| 4.4.3 感染M.hyopneumoniae ES-2 株前后,免疫组和非免疫组中实验动物体重变化比较 |
| 4.4.4 感染M.hyopneumoniaeES-2 株前后,免疫组和非免疫组中实验动物咳嗽变化比较 |
| 4.4.5 M.hyopneumoniae ES-2 株在免疫组和非免疫组实验动物肺部定殖能力的比较 |
| 4.4.6 通过肺部病变比较不同剂量灭活M.hyopneumoniae ES-2 抗原对猪的免疫保护效果 |
| 4.4.7 扫描电镜观察疫苗对气管或支气管上皮细胞绒毛的保护效果 |
| 4.4.8 综合评估不同剂量灭活疫苗的保护效果 |
| 4.4.9 血液和支气管灌洗液中M.hyopneumoniae抗体的产生情况 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 免疫M.hyopneumoniae ES-2 株灭活疫苗后猪体内的抗体水平 |
| 4.5.2 免疫猪感染高致病性M.hyopneumoniae ES-2 株后的临床症状 |
| 4.5.3 M.hyopneumoniae ES-2 株灭活疫苗的保护效率 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究 |
| 5.1 猪链球2 型菌的研究进展 |
| 5.1.1 猪链球2 型菌的流行病学调查 |
| 5.1.2 猪链球2 型菌的毒力因子 |
| 5.1.3 研究的目的与意义 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株、质粒、细胞及培养条件 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 培养基与抗生素的配制 |
| 5.2.4 主要缓冲溶液的配制 |
| 5.2.5 引物 |
| 5.2.6 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 自杀性重组质粒的构建 |
| 5.3.2 猪链球菌2 型基因缺失突变株的构建 |
| 5.3.3 突变株和野生株的体外生长特性研究 |
| 5.3.4 透射电镜观察野生株和突变株表面的CPS |
| 5.3.5 猪链球2 型菌表面唾液酸的提取 |
| 5.3.6 RNA提取方法 |
| 5.3.7 qPCR |
| 5.3.8 测定突变株和野生株的半数致死量(LD_(50)) |
| 5.3.9 突变株和野生株SC19 在小鼠体内的组织载菌量 |
| 5.3.10 对Hep-2 细胞的黏附和侵入实验 |
| 5.3.11 抗吞噬实验 |
| 5.3.12 补体激活实验 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 ?cps2E、?cps2L、?cps2J和?cps2G突变株的构建及鉴定 |
| 5.4.2 通过qPCR检测基因的缺失是否影响其他基因的转录水平 |
| 5.4.3 基因cps2E,cps2L,cps2J或 cps2G的缺失对其生长的影响 |
| 5.4.4 基因cps2E,cps2L,cps2J和 cps2G的缺失对S.suis2 表面荚膜多糖的影响 |
| 5.4.5 测定突变株和野生株(半数致死量)LD_(50) |
| 5.4.6 比较突变株和野生株SC19 在小鼠体内的定殖能力 |
| 5.4.7 突变株和野生株对Hep-2 细胞黏附和侵入能力比较 |
| 5.4.8 突变株和野生株抗细胞吞噬能力的比较 |
| 5.4.9 比较补体C3b在突变株和野生株表面的沉积情况 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 四个cps基因分别缺失改变了S.suis2 SC19表面CPS结构 |
| 5.5.2 S.suis2 表面CPS缺失导致其毒力显着下降 |
| 5.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（6）猪链球菌2型宿主蛋白结合蛋白的筛选及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪链球菌毒力因子的研究进展 |
| 1 荚膜多糖 |
| 2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子 |
| 3 溶血素 |
| 4 纤连蛋白/纤维蛋白原结合蛋白 |
| 5 酶类相关的毒力因子 |
| 5.1 烯醇酶 |
| 5.2 3-磷酸甘油醛脱氢酶 |
| 5.3 二肽基肽酶 |
| 5.4 S核糖基高半胱氨酸酶 |
| 6 毒力调控因子 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪链球菌宿主蛋白结合蛋白的研究进展 |
| 1 细胞外基质结合蛋白 |
| 1.1 纤连蛋白结合蛋白 |
| 1.2 层粘蛋白结合蛋白 |
| 1.3 胶原蛋白结合蛋白 |
| 2 H因子结合蛋白 |
| 3 纤维蛋白原结合蛋白 |
| 4 免疫球蛋白G结合蛋白 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 猪链球菌2型LN和FN结合蛋白的筛选及功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和培养方法 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 胞壁蛋白和胞外蛋白的提取 |
| 1.4 利用2D-Far-Western blot方法鉴定LN和FN结合蛋白 |
| 1.5 MALDI-TOF-MS和数据库检索 |
| 1.6 重组LN和FN结合蛋白的克隆表达和纯化 |
| 1.7 重组LN和FN结合蛋白多克隆抗体的制备 |
| 1.8 Far-Western blot验证重组蛋白结合能力 |
| 1.9 ELISA验证重组蛋白结合能力 |
| 1.10 间接免疫荧光试验 |
| 1.11 竞争抑制试验 |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 利用2D-Far-Western blot方法鉴定SS2的LN和FN结合蛋白 |
| 2.2 重组蛋白与LN、FN结合活性验证 |
| 2.3 LN、FN结合蛋白与HEp-2细胞的相互作用 |
| 2.4 EF-Tu、enolase、LDH和FBA是SS2的重要黏附素 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪链球菌2型H因子结合蛋白的筛选及功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和培养方法 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 胞壁蛋白的提取 |
| 1.4 利用2D-Far-Western blot方法鉴定FHBPs |
| 1.5 MALDI-TOF-MS和数据库检索 |
| 1.6 重组FHBPs的表达纯化和多克隆抗体的制备 |
| 1.7 Far-Western blot验证FHBPs的结合能力 |
| 1.8 ELISA结合试验 |
| 1.9 FHBPs多克隆抗体的特异性分析 |
| 1.10 固定化FH与SS2的结合能力分析 |
| 1.11 细菌黏附和侵袭能力检测 |
| 1.12 小鼠感染试验 |
| 1.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 利用2D-Far-Western blot方法鉴定SS2的FHBPs |
| 2.2 确定FHBPs与FH的相互作用 |
| 2.3 SS2可以特异性结合鼠FH |
| 2.4 FH促进SS2对HEp-2细胞的黏附和侵袭能力 |
| 2.5 FH促进SS2在小鼠脑和血液中的定植能力 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 MRP高变区在猪链球菌2型致病过程中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和培养方法 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 MRP的序列分析 |
| 1.4 △mrp、△mrp-d1和△mrp-d2缺失株的构建 |
| 1.5 重组蛋白的表达纯化和多克隆抗体的制备 |
| 1.6 生长曲线测定 |
| 1.7 间接免疫荧光试验 |
| 1.8 细菌黏附试验 |
| 1.9 重组蛋白与人FN、FH、FG和猪IgG的结合活性分析 |
| 1.10 重组蛋白与HEp-2细胞的pull-down试验 |
| 1.11 细胞吞噬和胞内存活试验 |
| 1.12 小鼠体内感染试验 |
| 1.13 动物保护试验 |
| 1.14 猪全血存活试验 |
| 1.15 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MRP的氨基酸序列比对分析 |
| 2.2 缺失株△mrp、 Amrp-d1、△nup-d2的构建和生物学性状分析 |
| 2.3 MRP-D1在SS2与宿主细胞的黏附过程中发挥关键作用 |
| 2.4 MRP-D1是与宿主蛋白相互作用的关键功能域 |
| 2.5 MRP-D1促进SS2在RAW246.7巨噬细胞中的存活 |
| 2.6 小鼠感染模型中MRP-D1参与SS2的毒力 |
| 2.7 MRP-D1对小鼠具有部分保护作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 FBPS不是猪链球菌2型ZY05719的关键毒力因子 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和培养方法 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 △fbps缺失株的构建 |
| 1.4 革兰染色及显微镜观察 |
| 1.5 透射电子显微镜观察SS2荚膜 |
| 1.6 生长曲线测定 |
| 1.7 FBPS相关蛋白的表达和纯化 |
| 1.8 重组蛋白与不同宿主蛋白结合活性的分析 |
| 1.9 间接免疫荧光试验 |
| 1.10 细菌黏附和侵袭试验 |
| 1.11 细胞吞噬和胞内存活试验 |
| 1.12 小鼠体内感染试验 |
| 1.13 斑马鱼LD_(50)测定 |
| 1.14 动物保护试验 |
| 1.15 猪全血存活试验 |
| 1.16 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺失株△fbps的构建和生物学性状分析 |
| 2.2 FBPS及其截短片段与宿主蛋白FN、FH、FG、LN和IgG的结合活性分析 |
| 2.3 FBPS促进SS2与宿主细胞的黏附作用 |
| 2.4 FBPS不能够帮助SS2抵抗巨噬细胞和猪全血的杀伤 |
| 2.5 FBPS不影响ZY05719毒株对小鼠和斑马鱼的致病力 |
| 2.6 FBPS对小鼠没有明显的保护作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 PnuC在猪链球菌2型氧化应激和致病中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和培养方法 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 △pnuC缺失株的构建 |
| 1.4 SS2菌株中pnuC基因的分布 |
| 1.5 光学显微镜和透射电子显微镜观察 |
| 1.6 生长曲线测定 |
| 1.7 SS2在H_2O_2、高温和酸性条件下的存活能力测定 |
| 1.8 细菌黏附和侵袭试验 |
| 1.9 斑马鱼LD_(50)的测定 |
| 1.10 小鼠体内感染试验 |
| 1.11 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺失株△pnuC的构建和生长曲线分析 |
| 2.2 PnuC参与SS2氧化应激耐受过程 |
| 2.3 PnuC不参与SS2的黏附和侵袭过程 |
| 2.4 SS2菌株LD_(50)的测定 |
| 2.5 斑马鱼感染模型中PnuC参与SS2的毒力 |
| 2.6 PnuC促进小鼠脑膜炎的发生 |
| 2.7 小鼠感染模型中PnuC促进SS2的致病力 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）PurC影响马链球菌兽疫亚种致脑膜炎的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 细菌性脑膜炎发病机制的研究进展 |
| 1 中枢神经系统屏障的结构与功能 |
| 1.1 血-脑屏障 |
| 1.2 血-脑脊液屏障 |
| 2 细菌性脑膜炎发病机制的一般特性 |
| 2.1 细菌突破宿主先天免疫引起败血症 |
| 2.2 细菌与中枢神经系统屏障相互作用 |
| 3 常见细菌性脑膜炎发病机制的研究进展 |
| 3.1 肺炎链球菌脑膜炎 |
| 3.2 脑膜炎球菌脑膜炎 |
| 3.3 单增李斯特菌脑膜炎 |
| 3.4 猪链球菌脑膜炎 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第二章 马链球菌兽疫亚种PurC与HEK 293T细胞互作蛋白的筛选 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 试剂及材料 |
| 1.3 载体构建 |
| 1.4 质粒转染 |
| 1.5 间接免疫荧光 |
| 1.6 细胞氨基酸的稳定同位素标记 |
| 1.7 筛选互作蛋白样品制备 |
| 1.8 还原烷基化蛋白质消化 |
| 1.9 质谱检测 |
| 1.10 数据分析 |
| 1.11 免疫共沉淀 |
| 1.12 Western blot |
| 2 试验结果 |
| 2.1 purC-pAcGFP真核表达载体构建 |
| 2.2 PurC的细胞内表达及鉴定 |
| 2.3 SILAC方法筛选HEK 239T细胞中与PurC互作的蛋白 |
| 2.4 质谱检测结果 |
| 2.5 互作蛋白的真核表达载体构建 |
| 2.6 PurC与筛选蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 PurC通过调节脑内皮细胞Moesin磷酸化破坏血脑屏障 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 载体构建 |
| 1.4 细菌生长曲线测定 |
| 1.5 动物试验 |
| 1.6 蛋白表达及纯化 |
| 1.7 PurC兔多克隆抗体制备 |
| 1.8 细菌分泌蛋白提取 |
| 1.9 SEZ穿透体外BBB模型试验 |
| 1.10 活细胞成像 |
| 1.11 检测PurC对体外BBB模型完整性的影响 |
| 1.12 Latex beads包被 |
| 1.13 Dot blot |
| 1.14 电镜样品处理 |
| 1.15 细胞骨架染色 |
| 1.16 免疫共沉淀 |
| 1.17 SPR |
| 1.18 Western blot |
| 1.19 hBMEC Moesin基因沉默细胞的构建 |
| 1.20 细胞内Moesin磷酸化水平检测 |
| 1.21 RhoA活化水平检测 |
| 1.22 RhoGTP/GDP交换试验 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 purC基因缺失株及互补株构建结果 |
| 2.2 载体构建结果 |
| 2.3 细菌生长曲线 |
| 2.4 动物试验 |
| 2.5 细菌侵袭hBMEC试验结果 |
| 2.6 细菌穿透BBB模型试验结果 |
| 2.7 蛋白表达及纯化 |
| 2.8 PurC为SEZ分泌蛋白的鉴定 |
| 2.9 PurC处理后在细胞中的分布情况 |
| 2.10 PurC对BBB模型的影响 |
| 2.11 PurC与Moesin之间的互作关系 |
| 2.12 PurC对Moesin磷酸化的影响 |
| 2.13 PurC与细胞内Moesin磷酸化之间的关系 |
| 2.14 PurC对细胞内RhoA活化水平的影响 |
| 2.15 PurC活化RhoA的机制 |
| 2.16 Moesin基因沉默细胞的构建 |
| 2.17 PurC对Moesin基因沉默细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 PurC影响中性粒细胞跨血脑屏障迁移的机制 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 抗体和试剂 |
| 1.3 动物试验 |
| 1.4 荧光定量PCR检测 |
| 1.5 中性粒细胞穿透试验 |
| 1.6 细胞染色及显微镜观察 |
| 1.7 免疫共沉淀及western blot |
| 1.8 SPR |
| 1.9 Rac1活化及检测 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 purC基因对SEZ感染引起的脑组织炎症损伤程度的影响 |
| 2.2 PurC对dHL60细胞形态的影响 |
| 2.3 PurC对dHL60细胞穿透BBB速率的影响 |
| 2.4 PurC对细胞内Ezrin磷酸化水平的影响 |
| 2.5 PurC刺激细胞形成尾足的机制 |
| 2.6 p-Ezrin与细胞PSGL-1及CD44之间的互作关系 |
| 2.7 封闭选择蛋白或其受体对中性粒细胞迁移的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 SEZ与mBMEC互作分泌蛋白的筛选 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 体外血脑屏障模型构建 |
| 1.4 SEZ穿透血脑屏障模型试验 |
| 1.5 SILAC标记SEZ及培养上清蛋白提取 |
| 1.6 培养上清蛋白处理bEnd3细胞 |
| 1.7 全蛋白溶液蛋白酶解消化 |
| 1.8 质谱检测 |
| 1.9 质谱数据分析 |
| 1.10 烯醇化酶的原核表达及纯化 |
| 1.11 Eno兔多克隆抗体的制备 |
| 1.12 SEZ分泌蛋白提取 |
| 1.13 细胞活性检测 |
| 1.14 Western blot |
| 1.15 间接免疫荧光 |
| 1.16 免疫保护试验 |
| 1.17 细胞被动免疫保护试验 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 血脑屏障模型构建 |
| 2.2 SEZ穿透体外血脑屏障 |
| 2.3 SEZ培养上清对细胞的毒性检测 |
| 2.4 SEZ标记效率检测 |
| 2.5 SEZ可能与bEnd3细胞结合的蛋白筛选 |
| 2.6 rEno融合蛋白的纯化结果 |
| 2.7 Eno为SEZ分泌蛋白的鉴定 |
| 2.8 Eno可对bEnd.3细胞黏附性的检测 |
| 2.9 免疫保护试验结果 |
| 2.10 细胞被动免疫保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 全文创新性 |
| 致谢 |
| 博士期间发表及待发表的论文 |
| 附录 |
（8）浦东地区猪关节病重要病原体检测及其毒力基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪关节病概况 |
| 1.1 病因及危害 |
| 1.2 发病情况和临床表现 |
| 1.3 病理变化 |
| 1.4 诊断和鉴别诊断 |
| 1.5 治疗和预防 |
| 2 几种病原的毒力基因研究进展 |
| 2.1 猪链球菌毒力基因研究进展 |
| 2.1.1 荚膜多糖(CPS) |
| 2.1.2 溶菌酶释放蛋白(MRP) |
| 2.1.3 胞外因子(EPF) |
| 2.1.4 溶血素(SLY) |
| 2.1.5 毒力相关序列orf2 |
| 2.1.6 谷氨酸脱氢酶(GDH) |
| 2.1.7 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) |
| 2.2 副猪嗜血杆菌毒力基因研究进展 |
| 2.2.1 荚膜多糖(CPS) |
| 2.2.2 脂多糖(LPS) |
| 2.2.3 外膜蛋白(OMP) |
| 2.2.4 转铁结合蛋白(TBP) |
| 2.3 猪丹毒丝菌毒力基因研究进展 |
| 2.3.1 荚膜多糖(CPS) |
| 2.3.2 粘附素 |
| 2.3.3 表面保护性抗原(SPA) |
| 2.3.4 神经氨酸酶 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 猪关节病病因及流行情况调查分析 |
| 1 方法 |
| 1.1 现场调查 |
| 1.1.1 统计调查 |
| 1.1.2 问卷调查 |
| 1.1.3 针对性调查 |
| 1.2 实验室检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪关节病致病因素及分析 |
| 2.1.1 致病因素的层次结构模型构建 |
| 2.1.2 判断矩阵构造 |
| 2.1.3 致病因素一级指标权重分析 |
| 2.1.4 致病因素二级指标权重分析 |
| 2.2 猪关节病发病情况 |
| 2.2.1 仔猪关节病发病情况 |
| 2.2.2 后备母猪和种猪关节病发病情况 |
| 2.3 病原学诊断 |
| 2.4 猪关节病治疗及疗效评价 |
| 2.5 预防措施及效果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪关节病病原多重PCR检测方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.1.4 引物设计 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细菌培养 |
| 1.2.2 细菌DNA提取 |
| 1.2.3 PCR产物回收 |
| 1.2.4 重组质粒的制备 |
| 1.2.5 多重PCR体系建立及优化 |
| 2 结果 |
| 2.1 常规PCR试验结果 |
| 2.2 多重PCR退火温度 |
| 2.3 多重PCR特异性检测 |
| 2.4 多重PCR灵敏度检测 |
| 2.5 送检样品多重PCR检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 链球菌携带情况和毒力基因分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂、仪器及培养基 |
| 1.1.3 引物设计 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细菌培养 |
| 1.2.2 细菌DNA提取 |
| 1.2.3 毒力基因检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 EF-TU基因PCR检测结果 |
| 2.2 毒力基因检测结果 |
| 2.3 猪链球菌2型菌株毒力基因分析 |
| 2.3.1 Cps2J基因分析 |
| 2.3.2 MRP基因分析 |
| 2.3.3 orf2 基因分析 |
| 2.3.4 GDH基因分析 |
| 2.3.5 GAPDH基因分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 猪丹毒丝菌主要毒力基因分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂、仪器及培养基 |
| 1.1.3 引物设计 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细菌培养 |
| 1.2.2 细菌DNA提取 |
| 1.2.3 毒力基因检测 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 未来研究的展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（9）猪链球菌2型蛋白的差异表达及翻译后修饰对其毒力的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪链球菌2型毒力因子及研究方法进展 |
| 1 猪链球菌毒力因子研究进展 |
| 1.1 荚膜多糖 |
| 1.2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子 |
| 1.3 溶血素 |
| 1.4 黏附相关的毒力因子 |
| 1.5 与血液中的存活和传播有关的毒力因子 |
| 2 组学方法在猪链球菌研究中的应用 |
| 2.1 基因组学 |
| 2.2 蛋白质组学 |
| 2.3 转录组学 |
| 2.4 翻译后修饰组学 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 猪链球菌2型天然强弱毒株的比较基因组学和比较蛋白组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株及培养方法 |
| 1.2 基因组序列分析 |
| 1.3 比较蛋白组学分析 |
| 1.4 信号肽、跨膜区和(I/L)(P/A)XTG基序分析 |
| 1.5 比较基因组学和比较蛋白组学综合分析 |
| 1.6 western blot验证 |
| 1.7 分选酶系统相关基因的敲除 |
| 1.8 缺失株和野生株半数致死量的测定 |
| 1.9 western blot验证Sortase C与其对应底物的互作 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因组的装配和补洞 |
| 2.2 基因组注释 |
| 2.3 比较基因组学分析 |
| 2.4 比较蛋白组学分析 |
| 2.5 强毒特有基因在其余链球菌中的分布情况 |
| 2.6 分选酶系统相关基因的敲除 |
| 2.7 缺失株和野生株半数致死量的测定 |
| 2.8 Far-Western blot验证Sortase C及其对应底物的关系 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于相同亲本株的猪链球菌2型毒力增强及致弱突变株的比较蛋白组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株及培养方法 |
| 1.2 pepT缺失株的构建 |
| 1.3 亲本株及缺失株生长曲线的测定 |
| 1.4 亲本株及缺失株LD_(50)的测定 |
| 1.5 胞外蛋白的提取 |
| 1.6 基于2D-DIGE的比较蛋白组学分析 |
| 1.7 基于label-free的比较蛋白组学分析 |
| 1.8 差异蛋白的转录水平分析 |
| 1.9 差异蛋白的原核表达和纯化及多克隆抗体的制备 |
| 1.10 差异蛋白的western blot验证 |
| 1.11 差异蛋白的生物信息学分析 |
| 1.12 SBP2的功能验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 pepT缺失株的构建及rfeA缺失株稳定性检测 |
| 2.2 亲本株及缺失株生长曲线没有显着差异 |
| 2.3 亲本株及缺失株LD_(50)的比较分析 |
| 2.4 2D-DIGE鉴定到的差异蛋白汇总 |
| 2.5 label-free proteomics方法鉴定到的差异蛋白汇总 |
| 2.6 多种方法获得的缺失株差异蛋白结果汇总 |
| 2.7 qRT-PCR结果分析 |
| 2.8 Western blot结果分析 |
| 2.9 GO功能分类分析发现发挥催化、代谢及结合活性差异蛋白的重要性 |
| 2.10 毒力因子互作网络证明新鉴定的差异蛋白在已知的毒力因子系统中的重要作用 |
| 2.11 Venn分析提示最有价值的毒力相关因子SBP2 |
| 2.12 间接免疫荧光分析发现SBP2可以黏附到HEp-2细胞 |
| 2.13 蛋白黏附抑制再次验证SBP2对HEp-2细胞黏附的贡献 |
| 2.14 Far-Western blot验证SBP2是一个重要的细胞外基质蛋白结合蛋白 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪链球菌2型菌株适应体内环境及发挥毒力作用的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 完全体外培养的细菌的培养条件及细菌的收集 |
| 1.3 体外模拟细菌体内厌氧条件的培养方式及菌体的收集 |
| 1.4 体内培养方式及细菌的分离 |
| 1.5 iTRAQ比较蛋白组分析体内外不同培养方式的细菌的蛋白表达量变化 |
| 1.6 蛋白注释 |
| 1.7 qRT-PCR分析差异蛋白的转录水平 |
| 1.8 差异蛋白MRP, fabG和adhE原核表达和纯化及多克隆抗体的制备 |
| 1.9 差异蛋白的western blot验证 |
| 1.10 差异蛋白的生物信息学分析 |
| 1.11 Western blot验证adhE在厌氧培养条件下表达量的变化 |
| 1.12 间接免疫荧光实验探究adhE蛋白对HEp-2和Caco-2细胞的黏附 |
| 1.13 同源重组方法构建adhE缺失株 |
| 1.14 测定缺失株黏附水平的变化 |
| 1.15 Far-western blot分析adhE与Hsp60的互作关系 |
| 1.16 测定anti-fabG抗体封闭后SS2在猪血中存活能力的变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 革兰氏染色观察体内外培养的细菌 |
| 2.2 质谱(MS)数据的质控 |
| 2.3 蛋白圈图展示表达量变化的总图谱 |
| 2.4 差异蛋白的操纵子分析 |
| 2.5 差异蛋白的qRT-PCR结果分析 |
| 2.6 Western blot结果分析 |
| 2.7 噬菌体和基因岛对SS2适应宿主环境的作用 |
| 2.8 GO功能分类 |
| 2.9 差异蛋白的功能富集分析 |
| 2.10 基于富集分析的cluster分析 |
| 2.11 蛋白互作网络分析 |
| 2.12 WB分析厌氧培养条件下adhE表达量的变化 |
| 2.13 adhE基因缺失株的构建 |
| 2.14 重组adhE蛋白(radhE)对HEp-2和Caco-2细胞的黏附 |
| 2.15 △adhE对Caco-2细胞的黏附水平的变化 |
| 2.16 western blot分析radhE与Hsp60的互作 |
| 2.17 anti-fabG抗体封闭的SS2在猪血中存活能力的变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 猪链球菌蛋白的琥珀酰化及乙酰化修饰 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 菌株及培养方法 |
| 1.3 蛋白样品的提取 |
| 1.4 胰酶消化蛋白样品 |
| 1.5 高效液相色谱分离 |
| 1.6 亲和富集 |
| 1.7 蛋白LC-MS/MS分析 |
| 1.8 数据库检索 |
| 1.9 MS数据的QC验证 |
| 1.10 蛋白注释方法(基因本体论GO注释、结构域Domain注释、KEGG通路注释、亚细胞定位预测) |
| 1.11 功能富集分析(GO、Domain、KEGG) |
| 1.12 基序分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 WB鉴定SS蛋白中赖氨酸琥珀酰化和乙酰化修饰结果概观 |
| 2.2 琥珀酰化蛋白鉴定的质控 |
| 2.3 琥珀酰化蛋白的鉴定结果 |
| 2.4 琥珀酰化蛋白的功能分类 |
| 2.5 琥珀酰化蛋白的功能富集分析 |
| 2.6 琥珀酰化位点序列识别基序 |
| 2.7 乙酰化蛋白鉴定的质控 |
| 2.8 乙酰化蛋白的鉴定结果 |
| 2.9 乙酰化蛋白的功能分类 |
| 2.10 乙酰化蛋白的功能富集分析 |
| 2.11 乙酰化序列识别模体 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）猪链球菌胞壁水解酶等的鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪链球菌2型的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 毒力因子 |
| 3.1 荚膜多糖 |
| 3.2 溶菌酶释放蛋白及胞外因子 |
| 3.3 溶血素 |
| 3.4 黏附素 |
| 3.5 谷氨酸脱氢酶 |
| 3.6 纤连蛋白结合蛋白 |
| 3.7 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 |
| 3.8 毒力相关因子ORF2 |
| 3.9 Sortase A蛋白 |
| 3.10 89K毒力岛 |
| 3.11 血清浑浊因子 |
| 3.12 其他毒力因子 |
| 4 致病性与致病机理研究 |
| 5 猪链球菌2型感染模型 |
| 5.1 仔猪 |
| 5.2 马微型香猪 |
| 5.3 小鼠 |
| 5.4 斑马鱼 |
| 参考文献 |
| 第二章 转座突变筛选细菌毒力因子的研究进展 |
| 1 转座子种类 |
| 2 转座机制 |
| 3 转座突变技术的应用 |
| 3.1 信号标签诱变的应用 |
| 3.2 标准随机突变的应用 |
| 参考文献 |
| 第三章 自溶素与裂解酶研究进展 |
| 1 自溶素研究进展 |
| 1.1 自溶素作用特点 |
| 1.2 自溶素功能 |
| 1.3 自溶素的致病机理 |
| 1.4 生物制剂 |
| 2 噬菌体裂解酶的研究进展 |
| 2.1 裂解酶的结构 |
| 2.2 裂解酶的作用机制 |
| 2.3 裂解酶的应用 |
| 2.4 裂解酶杀菌的作用特点 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 猪链球菌2型突变文库的构建及以斑马鱼为模型筛选毒力相关基因 |
| 摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 菌株和培养条件 |
| 2.2 转座子的构建 |
| 2.3 猪链球菌2型转座突变文库的构建 |
| 2.4 转座突变株的Southern鉴定 |
| 2.5 斑马鱼试验 |
| 2.6 质粒拯救 |
| 2.7 基因缺失株的构建 |
| 2.8 转座突变、基因缺失及野毒株对斑马鱼半数致死量(LD_(50)) |
| 2.9 Cps2F突变对Cps表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 转座子的构建 |
| 3.2 猪链球菌2型转座突变文库的构建 |
| 3.3 突变文库的初步筛选 |
| 3.4 斑马鱼筛选突变文库 |
| 3.5 质粒拯救 |
| 3.6 基因缺失株的构建 |
| 3.7 斑马鱼半数致死量 |
| 3.8 Cps2F突变对Cps表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第五章 猪链球菌2型自溶素Atl的鉴定与功能分析 |
| 摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.2 Atl的克隆、表达及重组蛋白的纯化 |
| 2.3 细胞壁和胞壁水解酶的制备 |
| 2.4 酶谱实验 |
| 2.5 亲和免疫印迹 |
| 2.6 质谱分析 |
| 2.7 HA9801 Atl基因缺失株的构建和鉴定 |
| 2.8 缺失株的互补 |
| 2.9 实时荧光定量聚合链酶反应 |
| 2.10 缺失株△Atl、互补株C△Atl和野毒株HA9801生物学性状的比较 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 atl的克隆、表达及重组蛋白的纯化 |
| 3.2 酶谱实验和亲和免疫印迹 |
| 3.3 质谱分析 |
| 3.4 Atl缺失株的构建 |
| 3.5 荧光定量分析atl基因的表达 |
| 3.6 缺失株△Atl、互补株C△Atl和野毒株HA9801生物学性状的比较 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第六章 猪链球菌2型胞壁水解酶LytA鉴定及其溶菌活性的分析 |
| 摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株和培养条件 |
| 2.2 细胞壁及胞壁水解酶的制备 |
| 2.3 酶谱试验 |
| 2.4 LytA的克隆表达及纯化 |
| 2.5 比较基因组分析 |
| 2.6 LytA在不同猪链球菌的分布 |
| 2.7 水解酶LytA的缺失 |
| 2.8 LytA免疫原性分析 |
| 2.9 体外溶菌试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因组比较及目的基因的搜素 |
| 3.2 LytA在不同猪链球菌的分布 |
| 3.3 LytA结构分析 |
| 3.4 水解酶LytA的缺失 |
| 3.5 克隆、表达及纯化LytA |
| 3.6 LytA免疫原性分析 |
| 3.7 酶谱试验 |
| 3.8 体外溶菌试验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第七章 胞壁水解酶用于猪链球菌2型败血症的治疗及评价 |
| 摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株和培养条件 |
| 2.2 表达纯化LytA及去除内毒素 |
| 2.3 体内杀菌试验 |
| 2.4 重组蛋白的血液半衰期 |
| 2.5 小鼠败血症的治疗 |
| 2.6 体外杀菌谱 |
| 2.7 毒性试验 |
| 2.8 抗体对蛋白活性的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 LytA清除血液中细菌 |
| 3.2 败血症的治疗 |
| 3.3 体外杀菌谱 |
| 3.4 重组蛋白毒性及稳定性 |
| 3.5 抗体对LytA活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 博士期间发表及待发表的论文 |
| 致谢 |
四、用单克隆抗体展示猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白在菌体表面的形态和分布（论文参考文献）
- [1]原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究[D]. 付磊. 华中农业大学, 2020
- [2]猪链球菌与ⅡA型磷脂酶A2相互作用机制研究[D]. 王宇航. 军事科学院, 2020(02)
- [3]基于Mrp的猪链球菌病间接ELISA检测方法的建立[D]. 乔宏. 中国农业科学院, 2020(01)
- [4]9型猪链球菌突变株cbm缺失菌株的构建及Cbm的免疫致病性研究[D]. 胡倩. 湖南农业大学, 2019(08)
- [5]猪肺炎支原体ES-2株的特性研究及猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究[D]. 张焱焱. 华中农业大学, 2019
- [6]猪链球菌2型宿主蛋白结合蛋白的筛选及功能分析[D]. 李权. 南京农业大学, 2018(07)
- [7]PurC影响马链球菌兽疫亚种致脑膜炎的作用机制[D]. 彭婕. 南京农业大学, 2018(07)
- [8]浦东地区猪关节病重要病原体检测及其毒力基因分析[D]. 文德亮. 上海交通大学, 2016(03)
- [9]猪链球菌2型蛋白的差异表达及翻译后修饰对其毒力的影响[D]. 于岩飞. 南京农业大学, 2016(12)
- [10]猪链球菌胞壁水解酶等的鉴定与功能分析[D]. 琚存祥. 南京农业大学, 2012(04)